陳奇娜，王 斌，郭 慶，王 靜，黃 偉，王 霄，紀 華

(1.大理大學 藥學院，云南 大理 671000；2.昆明學院 農(nóng)學與生命科學學院，云南 昆明 650214；3.解放軍聯(lián)勤保障部隊第920醫(yī)院 腫瘤科，云南 昆明 650032)

DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)是在DNA序列的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基上加一個甲基的重要表觀修飾酶，DNMT分為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1和從頭甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A、DNMT3B[1]，DNA甲基化修飾可在DNA復制過程中經(jīng)細胞分裂并遺傳給下一代，這種修飾通常與基因沉默有關，被認為是構(gòu)成性和兼性異染色質(zhì)形成的重要因素[2]．此外，DNA高甲基化也被證明是用來維持基因的永久沉默[3]．因此，DNA甲基化被認為是轉(zhuǎn)基因沉默[4]的重要原因．近年來，CHO-K1細胞越來越多地用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)，以及克服轉(zhuǎn)基因沉默等以提高CHO-K1高效表達的手段而備受關注．因而，獲得DNA甲基化缺陷并穩(wěn)定高效表達的CHO細胞株已成為產(chǎn)業(yè)界追求的目標．

CRISPR/Cas9是用于基因編輯的前沿方法，以CRISPR/Cas9為基礎的基因編輯技術(shù)在一系列基因治療的應用領域都展現(xiàn)出極大的應用前景．例如血液病、腫瘤和其他遺傳疾?。送?，該技術(shù)的成果已應用于人類細胞、斑馬魚、小鼠以及細菌的基因組精確修飾[5-6]．通過設計含有20個核苷酸的sgRNA(small guide RNA)，并且sgRNA與核苷酸序列為 NGG 的PAM序列相鄰；sgRNA和靶標DNA之間的互補堿基配對，sgRNA引導Cas9內(nèi)切酶接近基因組中的任意DNA序列，Cas9-DNA的相互作用以及相關的構(gòu)象變化驅(qū)動R-loop的形成和在靶向基因組DNA中進行雙鏈斷裂(DSB)．雙鏈斷裂后DNA修復機制啟動并催化非同源端連接(NHEJ)或同源定向修復(HDR)．對于NHEJ，丟失的序列可能無法恢復，導致序列插入或缺失，以及基因功能喪失．而對于HDR，引入外源DNA模板將填補DSB，從而進行基因敲入、刪除、調(diào)整或突變[7-8]．

CHO細胞主要包括CHO-dxb11、CHO-K1、CHO-dg44和CHO-s等多種細胞系[9-11]．隨著CHO細胞培養(yǎng)條件的不斷改進優(yōu)化，比如，改進培養(yǎng)溫度、馴化貼壁細胞懸浮培養(yǎng)、無胎牛血清培養(yǎng)等，可以獲得不同表觀遺傳背景的細胞系用于提高工業(yè)化生產(chǎn)中蛋白的表達量．雖然已有CHO-K1中甲基化酶基因DNMT3A、DNMT3B基因敲除后的報道[12-16]，但是，可能存在因為基因敲除靶點的區(qū)別、不同甲基化背景的CHO-K1細胞甲基化酶基因敲除后誘變條件的不同，導致表觀遺傳背景差別，以及獲得的細胞系高效表達的潛質(zhì)完全不相同，因此，篩選DNMT3B基因特異位點敲除的特異細胞系仍然很有必要．

本研究利用CRISPR/Cas9基因修飾技術(shù)，通過優(yōu)化的軟瓊脂培養(yǎng)法對本實驗室馴化培養(yǎng)的 CHO-K1 細胞進行靶向sgRNA設計、細胞篩選和陽性克隆鑒定等，以期得到具有高效表達潛力的DNMT3B基因特異位點敲除的CHO-K1細胞系．

1 材料與方法

1.1 靶向DNMT3B基因的sgRNAs設計

根據(jù)CRISPR/Cas9靶點設計原則[17-18]，設計大于20個核苷酸長度的sgRNAs[19]．同時選擇DNMT3B基因第4個外顯子3個不同的靶點序列(表1)，通過體外實驗，從中篩選出效率較高的sgRNA，以增加成功率和增強敲除效率[8]，CRISPR/Cas基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建示意圖如圖1所示．

表1 sgRNA設計序列

圖1 CRISPR/Cas基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

1.2 引物合成

根據(jù)實驗要求設計DNMT3B基因第4外顯子的檢測引物(表2),引物由上海生工生物工程有限公司合成．

表2 引物序列

1.3 轉(zhuǎn)染及嘌呤霉素篩選

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 d，將24孔板的培養(yǎng)基換成不含抗生素的血清．當細胞匯合度達到50%～70%，進行轉(zhuǎn)染．轉(zhuǎn)染效率最佳的為 10 μL 體系，轉(zhuǎn)染試劑 3.6 μL，質(zhì)粒 1.2 μg．步驟如下：加 3.6 μL 轉(zhuǎn)染液到無抗生素培養(yǎng)基中，孵育 5 min；加 1.2 μg 的質(zhì)粒到無抗生素培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染液中孵育 20 min；24孔板換液 490 μL 無抗生素培養(yǎng)基；將孵育好的轉(zhuǎn)染試劑和DNA轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)基中輕柔混勻．設置3個重復和陰性對照，熒光顯微鏡下觀察3個重復轉(zhuǎn)染效率相差不大，陰性對照沒有熒光．轉(zhuǎn)染 24 h 后加入 12 μL 的嘌呤霉素，培養(yǎng) 4 d．

1.4 單克隆篩選

本實驗采用軟瓊脂法挑取單克隆．配置終質(zhì)量分數(shù)為0.5%瓊脂+10%FBS+1%三抗+1×DMEM的下層瓊脂，以及終質(zhì)量分數(shù)為0.35%瓊脂+10%FBS+1%三抗+1×DMEM的上層瓊脂鋪板到 5 cm 的細胞培養(yǎng)皿中[20]．細胞經(jīng)過細胞篩過濾以后，計數(shù)200個細胞加入上層瓊脂中．

通常鋪板 14 d 左右，肉眼可以觀察到針尖樣的單克隆細胞團，細胞鋪軟瓊脂期間每隔2～3 d，往軟瓊脂中加入 200 μL 的培養(yǎng)基，避免軟瓊脂過于干燥．當肉眼能看到單克隆細胞團時，用鑷子挑出單克隆到96孔板中將細胞團吹散．

1.5 TE1酶切

1.5.1 反應體系

T7E1核酸內(nèi)切酶反應體系見表3．

表3 T7E1核酸內(nèi)切酶反應體系

1.5.2 酶切反應程序

95 ℃ 5 min；95～85 ℃ -2 ℃/s；85～25 ℃ -0.1 ℃/s；4 ℃；置于PCR儀中反應結(jié)束后，加入 0.5 μL 的T7E1內(nèi)酶，嚴格冰上操作；加入T7E1內(nèi)切酶后，37 ℃ 反應 0.5 h 后，立刻跑電泳，電泳槽TAE每次換成新的．

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆細胞中DNMT3B基因的鑒定

2.1.1 DNMT3B基因片段鑒定

經(jīng)過轉(zhuǎn)染sgRNA的質(zhì)粒，用嘌呤霉素篩選后，通過對獲得的瞬時轉(zhuǎn)染的細胞進行軟瓊脂法篩選，并對獲得的單克隆進行DNMT3B基因鑒定，擴增片段大小為483 bp(圖2)，確定為篩選引物擴增的目的片段．

2.1.2 基因敲除陽性細胞篩選

為了確認獲得的單克隆是否發(fā)生基因編輯，利用T7E1酶切切割DNMT3B基因，而T7E1 核酸內(nèi)切酶能夠識別由于堿基缺失或改變造成不完全互補配對的雜合雙鏈 DNA，進行DNA切割，對野生型則不會產(chǎn)生切割．如圖3所示，1號、2號為DNMT3B-1單克隆T7E1酶切1號體系和2號體系(表3)切開的條帶，7號、8號為DNMT3B-2單克隆T7E1酶切的1號體系和2號體系(表3)切開的條帶，均切開3條條帶．

M:Marker;1:DNMT3B-1，用DNMT3B引物擴增；2:DNMT3B-2，用DNMT3B引物擴增．圖2 DNMT3B 基因片段PCR鑒定結(jié)果

圖3 單克隆篩選酶切鑒定結(jié)果

隨后，將T7E1酶切切開的PCR產(chǎn)物純化后進行TA克隆，菌落PCR，陽性菌落擴大培養(yǎng)后，小提質(zhì)粒，DNA測序比對，確定該單克隆基因敲除了25 bp(圖4a)和敲除了10 bp(圖4b)成功，并進一步通過比對，確定基因敲除位點發(fā)生在第4外顯子上(圖4c)．

2.2 DNMT3B基因特異位點的細胞篩選

基于上述基因鑒定結(jié)果，確定DNMT3B基因敲出背景清楚的單克隆，再通過有限稀釋法對單克隆進行重篩選．分別獲得DNMT3B第4個外顯子上刪除25 bp和10 bp的特異的細胞株，普通顯微鏡下顯示細胞生長情況良好(圖5a)．為進一步確定單克隆均一性，用倒置熒光顯微鏡進行分析其熒光均一度(圖5b)．

圖4 DNMT3B-1、DNMT3B-2單克隆測序結(jié)果

圖5 DNMT3B-1、DNMT3B-2單克隆細胞

3 討論

DNMT3B基因由23個外顯子組成．本文通過CRISPR/Cas9基因修飾技術(shù)，分別獲得DNMT3B第4個外顯子上刪除25 bp和10 bp的特異的細胞株．雖然已有利用CRISPR/Cas9基因修飾技術(shù)，將CHO-K1甲基化酶基因DNMT3B中第1個外顯子上的一部分片段的基因敲除的報道[12]，但是該文與本文的基因敲除靶點完全不同，并且敲除的片段長度也不同，因而有可能對細胞的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)層面，如開放染色質(zhì)、染色質(zhì)環(huán)、或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域[21]等造成不同的影響，導致獲得基因敲除細胞的表觀遺傳背景可能完全不同．另外，不同甲基化背景的CHO-K1細胞經(jīng)甲基化酶基因缺失后獲得的細胞表觀遺傳背景也可能有差別．由于不同的表觀遺傳背景差異，不同的DNMT3B基因敲除的細胞系可能在篩選高效表達細胞系的潛質(zhì)完全不相同．因此，本研究獲得的DNMT3B基因特異位點敲除的特異細胞系仍然具有一定的創(chuàng)新性．

本研究所采用的CRISPR/Cas9方法在單克隆細胞的篩選上利用軟瓊脂法，不同于與已有報道[12-15]的DNMT3B、DNMT3A基因敲除研究中用到的流式分選或者96孔板稀釋法．流式分選法的優(yōu)點是省時省力，但與其他單克隆篩選的方法相比，費用較高，并且有容易污染、細胞膜容易受損等缺點．有限稀釋法作為傳統(tǒng)篩選方法，優(yōu)點是技術(shù)成熟、操作簡單、成本較低[22]；缺點是單克隆得率低．而軟瓊脂法操作簡單、成本較低，并且得到的單克隆細胞均質(zhì)性更好，但是生長環(huán)境完全不同于有限稀釋法的96孔板，因此對獲得的細胞的表觀遺傳背景也可能產(chǎn)生不同的影響．雖然獲得的DNMT3B基因缺陷的單克隆細胞已經(jīng)過嚴格的測序鑒定，并且熒光分析結(jié)果顯示單克隆較為均一，但是，仍然需要對其進行進一步鑒定，并在后續(xù)應用于高效表達細胞篩選研究中對其表觀遺傳背景進行深入分析．