錢(qián)南南， 王久香， 裴 培， 楊 悅， 楊文明

肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson’s Disease，WD，MIM 277900)是一種常染色體隱性遺傳的以銅代謝紊亂為特征的代謝性疾病，主要表現(xiàn)為肝功能異常、神經(jīng)或精神損害、角膜可見(jiàn)K-F環(huán)(Kayser-Fleischer ring)甚至腎損傷。臨床上，該病主要分為肝型(肝功能損傷)、腦型(神經(jīng)精神異常)和混合型(二者都異常)。患者一般在5～35歲發(fā)病，兒童以肝型為主，腦型患者少見(jiàn)[1，2]。目前發(fā)現(xiàn)WD是由ATP7B基因突變所導(dǎo)致，我們對(duì)1例中國(guó)漢族早發(fā)型腦型WD家系進(jìn)行ATP7B變異鑒定，以明確其遺傳學(xué)病因，為該家系的疾病診斷提供遺傳學(xué)證據(jù)，對(duì)家系其他成員的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 先證者，女，13歲。2017年7月份漸出現(xiàn)口角流涎、言語(yǔ)不清，寫(xiě)字慢、字體歪斜。就診于當(dāng)?shù)匦l(wèi)生所考慮“胃炎”，予口服藥治療未見(jiàn)好轉(zhuǎn)(具體用藥不詳)。發(fā)病16 m開(kāi)始出現(xiàn)左手不自主抖動(dòng)，記憶力明顯減退?；颊唠p眼角膜K-F環(huán)陽(yáng)性，腦部MRI顯示雙側(cè)基底節(jié)區(qū)、黒質(zhì)對(duì)稱(chēng)性異常低信號(hào)(見(jiàn)圖1)，24 h尿銅 621.7 μg/d，ALT、AST、GGT和AKP正常，CER 0.093 g/L(參考值0.2～0.6 g/L)，考慮“肝豆?fàn)詈俗冃浴?，予排銅、保腦等綜合治療后口角流涎及左手不自主抖動(dòng)較前好轉(zhuǎn)?；颊?歲時(shí)患過(guò)病毒性腦炎。

表1 ATP7B外顯子及其側(cè)翼區(qū)PCR擴(kuò)增引物序列

先證者腦部MRI顯示雙側(cè)基底節(jié)區(qū)、黒質(zhì)對(duì)稱(chēng)性異常低信號(hào)圖1 先證者頭部MRI

本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)中國(guó)合肥安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，本研究參與者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 EDTA抗凝管采集先證者及家系其他成員的外周血3 ml(見(jiàn)圖2A)，全血基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA，并用分光光度計(jì)(Eppendorf，德國(guó))檢測(cè)其濃度和質(zhì)量。

1.2.2 基因測(cè)序 利用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含ATP7B基因外顯子及其外顯子內(nèi)含子連接區(qū)引物，由武漢擎科生物有限公司合成(見(jiàn)表1)。PCR體系(50 μl)：5X PrimeSTAR緩沖液(含Mg2+)10 μl (Takara)、基因組DNA 100 ng、上下游引物各0.2 μmol/L、dNTP Mixture 0.2 mmol/L(Takara)，PrimeSTAR DNA polymerase 0.5U(Takara)，用H2O補(bǔ)足至50 μl體系。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃ 變性10 s；55 ℃～60 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送武漢擎科生物有限公司用ABI PRISM 3100測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的ATP7B基因序列進(jìn)行比對(duì)(見(jiàn)圖2B-2E)。

2 結(jié) 果

ATP7B基因測(cè)序結(jié)果：外顯子直接測(cè)序結(jié)果顯示，先證者ATP7B基因存在c.2333G>T和c.2975C>T復(fù)合雜合錯(cuò)義變異(見(jiàn)圖2C)，分別導(dǎo)致ATP7B第778位精氨酸變成亮氨酸，第992位脯氨酸變成亮氨酸。經(jīng)檢索HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP、千人基因組等數(shù)據(jù)庫(kù)證實(shí)，c.2333G>T和c.2975C>T均為已知WD致病位點(diǎn)。先先證者母親攜帶c.2333G>T(p.Arg778Leu)突變(見(jiàn)圖2B)，先證者父親攜帶c.2975C>T(p.Pro992Leu)突變(見(jiàn)圖2C)。先證者的弟弟攜帶c.2333G>T(p.Arg778Leu)突變(見(jiàn)圖2E)。

A：先證者家系圖，箭頭指示先證者；B～E：ATP7B測(cè)序結(jié)果(正向)，箭頭指示變異位點(diǎn)圖2 先證者家系及測(cè)序結(jié)果圖

3 討 論

WD是由于體內(nèi)銅離子異常累積導(dǎo)致的一種罕見(jiàn)隱形遺傳病。ATP7B是目前已知的WD致病基因，其定位于13q14.3，編碼含有1465氨基酸殘基的跨膜蛋白。銅離子的代謝障礙導(dǎo)致其在腦部、肝臟、眼底甚至腎臟累積，導(dǎo)致患者出現(xiàn)肝硬化、神經(jīng)精神紊亂、角膜K-F環(huán)甚至腎損傷。因此早診斷、早治療可減少患者肝、腦等組織的損傷，延緩病情進(jìn)展，明顯提高WD患者的生存質(zhì)量，最終回歸家庭和社會(huì)?；颊咦猿錾创嬖阢~代謝障礙，一般3歲以后才開(kāi)始出現(xiàn)癥狀，臨床表現(xiàn)各異且大部分為非特異性，因此早期診斷仍較為困難[3]。本文先證者發(fā)病初期口角流涎、言語(yǔ)不清，曾考慮胃炎，外院治療后未見(jiàn)好轉(zhuǎn)。發(fā)病4 m后，流涎、言語(yǔ)不清加重，開(kāi)始出現(xiàn)左手不自主抖動(dòng)。

目前ATP7B基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有600多個(gè)WD致病突變位點(diǎn)。H1069Q是目前中歐最常見(jiàn)的WD突變位點(diǎn)，在波蘭、羅馬尼亞，奧地利等中歐國(guó)家的等位基因頻率為30%～60%[4]。R778L是日本、韓國(guó)、中國(guó)等亞洲患者的熱點(diǎn)變異位點(diǎn)[5]。R778L等位基因在韓國(guó)WD患者的攜帶率約為 37.9%、日本約為27%，中國(guó)約28%～44%[4，6，7]。c.2975C>T(p.Pro992Leu)突變位于ATP7B第8外顯子，蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。2013年，有學(xué)者報(bào)道了1例9歲的中國(guó)WD男童，攜帶與本文先證者相同的突變位點(diǎn)ATP7B c.2333G>T和c.2975C>T[8]。該患者神經(jīng)精神正常，本文中的先證者有明顯的神經(jīng)精神癥狀；角膜K-F環(huán)陰性，本文患者陽(yáng)性；肝功能指標(biāo)ALT(137 IU/L)、AST(106 IU/L)明顯升高，本文先證者ALT(16 U/L，參考值5～35 U/L)、AST(22 U/L，參考值5～35 U/L)。有多位學(xué)者嘗試尋找患者基因型和發(fā)病年齡、性別、臨床表型的關(guān)系，但是沒(méi)有明確的結(jié)論[9～11]。最新研究顯示ATP7B DNA甲基化可能與患者臨床表型相關(guān)[12]。此外先證者4歲時(shí)曾患有病毒性腦炎，是否與患者的早期發(fā)病相關(guān)亦未可知。

先證者的母親攜帶ATP7B c.2333G>T突變，父親攜帶c.2975C>T突變。先證者從雙親遺傳到ATP7B c.2333G>T和c.2975C>T符合雜合突變，結(jié)合患者臨床癥狀、生化檢查及體征，診斷WD明確。通過(guò)對(duì)先證者的弟弟ATP7B 基因21個(gè)外顯子和外顯子內(nèi)含子銜接區(qū)的測(cè)序發(fā)現(xiàn)其只攜帶c.2333G>T突變，提示其弟弟的發(fā)病可能性不大，可密切隨訪觀察。

我們報(bào)告了一例早發(fā)型腦型WD家系，明確該家系WD發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)是ATP7B c.2333G>T和c.2975C>T，并對(duì)先證者的弟弟進(jìn)行突變檢測(cè)，分析其患病的可能性。