黃敏，劉若雪，林鑫，韓曉晨，何俊瑛，趙輝，燕犁天，鄒月麗，卜暉

軟腦膜轉(zhuǎn)移(LM)，又稱“腦膜癌病”、“癌性腦膜炎”，是指癌細(xì)胞擴散到軟腦膜，蛛網(wǎng)膜和CSF空間所致的惡性疾病。LM往往發(fā)生在惡性腫瘤的晚期階段，有很高的致殘率和病死率。實體腫瘤LM最常見的來源是肺癌，乳腺癌和黑色素瘤。盡管肺癌和乳腺癌更為普遍，但黑色素瘤擴散到CNS的風(fēng)險最高[1-2]。據(jù)估計約30%的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者會發(fā)生CNS受累(尸檢時高達75%)，轉(zhuǎn)移至軟腦膜空間的患者約占5%[3]。近年來LM的發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢，可能是影像學(xué)技術(shù)的改善，較低的診斷閾值，以及癌癥患者生存率提高和許多抗腫瘤藥對血液-CSF屏障滲透性有限的結(jié)果[4-5]。黑色素瘤LM患者的預(yù)后很差，平均總生存期為8～10周[3]。Ferguson等[6]對178例黑色素瘤LM患者進行生存預(yù)后分析表明盡早正確診斷是與總生存期顯著相關(guān)的積極因素。因此，在未出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損之前，盡早準(zhǔn)確的診斷，為患者提供更好的、及時有效的治療方式，是提高這部分患者總體生存期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文主要討論黑色素瘤LM診斷方面的新進展，強調(diào)了開展CSF細(xì)胞學(xué)檢查的必要性，并闡述了其他新興CSF分析技術(shù)的最新數(shù)據(jù)，為臨床提供依據(jù)。

1 LM的生物學(xué)基礎(chǔ)

軟腦膜空間是由緊貼大腦和脊髓表面的軟腦膜和蛛網(wǎng)膜組成的空間，其間充滿循環(huán)流動的CSF。在正常健康狀態(tài)下，CSF內(nèi)幾乎是無細(xì)胞的，可有少數(shù)的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞主要通過：(1)脈絡(luò)叢的動脈循環(huán)；(2)貝特森叢或橋接靜脈的靜脈循環(huán)；(3)沿顱神經(jīng)或脊神經(jīng)根的神經(jīng)周圍間隙；(4)從腦實質(zhì)通過神經(jīng)膠質(zhì)足突直接浸潤等四種途徑進入該空間[2,7-8]。但有研究[8]表明在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中，沿神經(jīng)周圍的遷移很少見。一旦進入CSF，癌細(xì)胞就可以在整個CNS中擴散并在軟腦膜空間循環(huán)，種植在軟腦膜上，按照“種子和土壤”假說來促進腫瘤細(xì)胞的生長和增殖[9]。

CSF中有絲分裂原少，蛋白質(zhì)、葡萄糖和細(xì)胞因子含量很低[10]。與其他轉(zhuǎn)移部位(如腦組織)相比，軟腦膜空間在轉(zhuǎn)移微環(huán)境方面明顯不同。進入CSF的轉(zhuǎn)移細(xì)胞面臨著營養(yǎng)和生長支持信號相對較差的無細(xì)胞環(huán)境[11]。Boire等[11-12]通過研究四個不同LM模型發(fā)現(xiàn)CSF中的癌細(xì)胞均上調(diào)了補體成分3的產(chǎn)生，導(dǎo)致血CSF屏障破壞，可以促進血漿中生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)進入CSF，從而促進癌細(xì)胞在該特殊環(huán)境中的生長。最近一項對來自黑色素瘤LM患者的CSF進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的研究[13]顯示，CSF中與先天免疫，蛋白酶介導(dǎo)的損傷和胰島素樣生長因子(IGF)相關(guān)信號有關(guān)的通路均有表達增加[如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)表達增加，PI3K/ AKT通路上調(diào)等]，可能促進了癌細(xì)胞的增殖。

軟腦膜空間一直以來被認(rèn)為是具有“免疫特權(quán)”的部位，到達該部位的癌細(xì)胞可以逃避免疫監(jiān)視[8,14]。然而，最近的小鼠模型實驗[15]發(fā)現(xiàn)CNS內(nèi)存在與硬腦膜竇伴行的腦膜淋巴管系統(tǒng)，并可將CNS來源的抗原引流至頸深部淋巴結(jié)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。未來對癌細(xì)胞如何躲避免疫監(jiān)視的探索將會促進新型診療手段的研發(fā)。

2 黑色素瘤LM的診斷

目前LM的診斷主要基于臨床評估，腦脊髓MRI和CSF檢查。根據(jù)歐洲神經(jīng)腫瘤協(xié)會-歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會(EANO-ESMO)指南，CSF中檢測到腫瘤細(xì)胞可確診LM。對于已知或可能患癌癥的患者，存在典型的臨床癥狀和影像學(xué)征象則提示可能為LM[16]。CSF細(xì)胞學(xué)仍是目前確診腦膜癌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，也是監(jiān)測治療反應(yīng)的主要手段。2020年CSF細(xì)胞學(xué)臨床規(guī)范應(yīng)用專家共識也指出CSF細(xì)胞學(xué)對腦膜癌病的診斷具有重要意義，并建議將CSF細(xì)胞學(xué)作為臨床CSF檢查的常規(guī)檢查或者一線檢查，且應(yīng)積極開展[17]。

隨著技術(shù)進步，LM檢測的手段越來越多，敏感性及特異性有所提高。但黑色素瘤LM的診斷仍然是一個巨大挑戰(zhàn)。臨床醫(yī)生需要在患者的一般狀況改變以及發(fā)生多發(fā)，嚴(yán)重或固定的神經(jīng)功能缺損之前進行LM診斷，且可能在整個過程中，需臨床醫(yī)師適當(dāng)聯(lián)合多種檢測手段來明確診斷。

2.1 臨床表現(xiàn) 黑色素瘤LM患者的臨床表現(xiàn)無特異性，可因惡性細(xì)胞累及CNS的不同區(qū)域而表現(xiàn)為不同的癥狀。常見癥狀包括頭痛、顱神經(jīng)缺損(如視力障礙、復(fù)視、聽力下降)、精神疾病發(fā)作和癲癇發(fā)作，也可出現(xiàn)神經(jīng)根疼痛、背痛或馬尾神經(jīng)綜合征。此外，腫瘤細(xì)胞生長可影響CSF循環(huán)，導(dǎo)致阻塞性或交通性腦積水的癥狀，如惡心、嘔吐、嗜睡等[18-19]。由于非特異性的多形式和多灶性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征，必須進行鑒別診斷，考慮的疾病應(yīng)包括但不局限于其他轉(zhuǎn)移性癌、淋巴瘤、白血病、神經(jīng)結(jié)節(jié)病、急性彌漫性腦脊髓炎、感染性病因和其他自身免疫性疾病等。這些疾病的表現(xiàn)與之類似，會使診斷進一步復(fù)雜化，需應(yīng)用其他檢測手段加以鑒別。

2.2 影像學(xué)檢查 目前釓劑增強的腦和脊髓MRI(MRI-Gd)是評估可疑LM患者的首選影像學(xué)檢查[20]。由于黑色素具有順磁性，黑色素瘤在MRI上可能表現(xiàn)為T1WI高信號，T2WI等信號以及注射釓劑后的明顯增強[21]。黑色素瘤LM可表現(xiàn)為大腦半球皮質(zhì)溝和小腦葉的結(jié)節(jié)樣和曲線樣增強，或顱神經(jīng)和基底池的強化，也可表現(xiàn)為沿脊髓表面和/或馬尾神經(jīng)根的平滑增強和結(jié)節(jié)增強。這些MRI增強表現(xiàn)并非特異性，許多良性的軟腦膜疾病也可以導(dǎo)致類似結(jié)果，這使得僅通過影像學(xué)來診斷LM具有挑戰(zhàn)性[8]。但是MRI結(jié)果陰性也不能排除LM的診斷。應(yīng)注意的是，影像學(xué)檢查盡量在腰穿之前進行，以避免因短暫性顱內(nèi)低壓或藥品對腦膜的刺激而引起潛在的醫(yī)源性硬腦膜和軟腦膜增強。此外，有研究[22]表明免疫治療可能會引起“假性腦膜炎”，導(dǎo)致MRI假陽性。18F-脫氧葡萄糖PET-CT進行全身掃描可顯示出高代謝灶的部位用于鑒別轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和原發(fā)性CNS黑色素瘤[23]。

2.3 CSF分析 與CNS其他部分相比，CSF是最容易獲得的介質(zhì)，可以直接從CNS的不同部分獲取多種與疾病進展和對治療反應(yīng)有關(guān)的腫瘤標(biāo)志物[24]。因此CSF的多模式分析可提供更直接、更準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，也是監(jiān)測疾病變化及治療反應(yīng)的一個更便捷途徑，已成為現(xiàn)代LM診斷工作的重要組分。

2.3.1 CSF常規(guī)檢查 在條件允許的情況下，患者應(yīng)盡可能行腰椎穿刺術(shù)，不僅可以提供診斷且可評估治療反應(yīng)。在超過90%的LM病例中觀察到標(biāo)準(zhǔn)CSF常規(guī)檢查異常。LM患者的CSF常規(guī)分析往往顯示顱內(nèi)壓增高，白細(xì)胞升高(以淋巴細(xì)胞為主)，CSF蛋白水平升高，葡萄糖水平降低[2]。CSF細(xì)胞學(xué)仍是目前診斷LM的臨床金標(biāo)準(zhǔn)，其因操作簡便，特異性高，患者接受度高等特點在臨床廣泛應(yīng)用。當(dāng)在CSF中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積大，胞膜不規(guī)則有突起，細(xì)胞質(zhì)嗜堿性有空泡，核質(zhì)比失調(diào)，可見單核或多核，胞內(nèi)黑色素極其豐富常覆蓋細(xì)胞核的典型黑色素瘤細(xì)胞時即可診斷黑色素瘤LM[25]。在最終診斷為LM的患者中，初次檢查時高達45%的細(xì)胞學(xué)為陰性。通過第二次CSF分析，其敏感性可達到80%[26]。增加CSF送檢量，盡快處理標(biāo)本，多次送檢等可提高細(xì)胞學(xué)檢測的靈敏度[2,12]。CSF細(xì)胞學(xué)檢測對于LM診斷的敏感性及特異性高于影像學(xué)及臨床癥狀的提示。適當(dāng)提早CSF細(xì)胞學(xué)檢測，將有效提高診斷效率，并對患者的治療措施及預(yù)后產(chǎn)生更為積極的影響。CSF免疫細(xì)胞化學(xué)檢測可以通過抗原抗體反應(yīng)發(fā)現(xiàn)CSF中的黑色素瘤細(xì)胞，即表達S-100(+)，HMB45(+)，MelanA(+)和EMA(-)的細(xì)胞[27]。有研究[28-29]表明，HMB45和MelanA僅在黑色素瘤細(xì)胞特異表達，MelanA的診斷敏感性為71%，HMB45的診斷敏感性可達85%。

2.3.2 CSF高級檢測 “液體活檢”的定義是對來自生物流體的腫瘤細(xì)胞或核苷酸進行實時采樣。CSF作為一種可用于“液體活檢”的生物流體，已被證明具有明確CNS腫瘤遺傳學(xué)，監(jiān)測腫瘤進展，和改變患者臨床治療的潛力[30]。目前主要的兩種液體活檢方法是循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)分析和游離腫瘤DNA(ctDNA)測序，其他方法包括游離細(xì)胞RNA(cfRNA)、外泌體、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)[31-32]。

CTCs是指那些從腫瘤起源部位或轉(zhuǎn)移性沉積物脫落后轉(zhuǎn)移到血液循環(huán)或其他生物流體中的細(xì)胞。CTC是轉(zhuǎn)移的直接種子，其診斷意義受到研究人員和臨床醫(yī)生的高度關(guān)注。但是CTC離開原發(fā)部位，進入循環(huán)并侵襲轉(zhuǎn)移性定植靶器官的過程非常復(fù)雜，其機制尚未完全了解[30]。目前，CSF中CTC的檢測已用作實體瘤LM的輔助診斷策略。用于檢測CTCs的技術(shù)方法包括以下幾種：CellSearch技術(shù)平臺、RT-PCR、免疫熒光原位雜交(FISH)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等[24]。有研究[33-36]已經(jīng)通過這些技術(shù)檢測到乳腺癌、肺癌LM患者 CSF中的惡性細(xì)胞。Le Rhun等[26]通過改良后的Cellsearch技術(shù)平臺檢測到7例黑色素瘤LM患者CSF中具有典型形態(tài)的黑色素瘤細(xì)胞即具有CD146(+)；4′,6-二咪基-2-苯基吲哚(DAPI)(+)；抗熒光黑素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)(+)；CD34(-)和CD45(-)這些免疫表型的細(xì)胞，表明CellSearch可實現(xiàn)CSF中黑色素瘤細(xì)胞的連續(xù)監(jiān)測。Torre等[37]通過CellSearch平臺對20例實體瘤LM患者(包括2例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者)的CSF進行檢測，顯示其診斷LM的靈敏度為88.9%，特異性為77.8%。這些實驗都充分說明CTC的檢測可以作為LM的早期診斷，并可精準(zhǔn)定量，了解腫瘤負(fù)荷，評估LM治療反應(yīng)。

近幾年還處于臨床前階段的最有前景的檢測CSF CTCs的方法是光聲流式細(xì)胞術(shù)(PAFC)，與其他診斷技術(shù)相比，它表現(xiàn)出超靈敏的分子檢測和不同體液(例如血液、淋巴液和CSF)中計數(shù)單細(xì)胞的能力。有研究[24]使用乳腺癌轉(zhuǎn)移癌的臨床前模型報道了PAFC首次成功檢測出CSF中CTCs的能力。最近，Edgar等[38]對38例晚期黑色素瘤患者進行血液CTCs檢測表明，PAFC可以檢測Ⅰ～Ⅲ期黑色素瘤患者血液中極少數(shù)的CTCs，具有預(yù)測轉(zhuǎn)移性疾病發(fā)生的潛力，成功地證明了PAFC的臨床意義。未來光聲流式細(xì)胞術(shù)在黑色素瘤LM患者中的應(yīng)用將可以提前檢測到處于亞臨床狀態(tài)的轉(zhuǎn)移性疾病，并盡早針對極少數(shù)的CTC進行單細(xì)胞治療，阻止轉(zhuǎn)移性疾病的發(fā)生。

CtDNA是從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性病變中的壞死或快速生長的細(xì)胞和/或循環(huán)腫瘤細(xì)胞中脫落的，是一個完全由腫瘤衍生的循環(huán)游離DNA(cfDNA)子集[30]。血清ctDNA檢測的限制是血清中ctDNA的含量相對稀少，ctDNA與cfDNA的比率很低，而CSF中非腫瘤來源的DNA含量較低，因此CSF中ctDNA與cfDNA的比率比血清中的高得多，從而更容易檢測到等位基因頻率較低的突變[39]。CSF ctDNA檢測的臨床應(yīng)用在于，一是可以為細(xì)胞學(xué)陰性的LM患者提供輔助診斷;二是確定轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的基因改變，給予最佳靶向治療[40]。目前用于CSF ctDNA檢測的技術(shù)有微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)和二代測序技術(shù)(NGS)。Ballester等[41]通過ddPCR和NGS檢測了來自黑色素瘤LM患者的CSF ctDNA相關(guān)突變情況，發(fā)現(xiàn)ddPCR、NGS與MRI結(jié)果之間有很強的相關(guān)性;這種相關(guān)性強于CSF細(xì)胞學(xué)檢查和MRI結(jié)果之間的相關(guān)性，這表明ddPCR、NGS在分析黑色素瘤LM患者CSF方面優(yōu)于細(xì)胞學(xué)及MRI檢查。Li等[42]通過觀察1例黑色素瘤LM患者在整個臨床病程中不同時期的CSF ctDNA變化趨勢得出，較高的ctDNA量與更嚴(yán)重的癥狀相對應(yīng)，并通過對ctDNA全外顯子測序發(fā)現(xiàn)突變基因給予靶向治療，表明來自CSF中腫瘤細(xì)胞的ctDNA具有特征性突變，這些突變對于選擇靶向治療劑或監(jiān)測治療反應(yīng)具有臨床意義。

但CSF CTC和ctDNA的存在均不足以診斷LM。因毗鄰軟腦膜間隙或腦室系統(tǒng)的實質(zhì)性病變可將CTC或ctDNA釋放到CSF中，而沒有活細(xì)胞侵入該間隙。在高達63%無LM的實質(zhì)性腦轉(zhuǎn)移患者中，通過ddPCR在其CSF中也檢測到了與腫瘤相關(guān)的突變(如BRAF、MET)。因此，CSF CTC的存在和CSF ctDNA中腫瘤相關(guān)突變的存在可能反映了腦轉(zhuǎn)移和(或)LM[43-45]。有關(guān)這些檢測技術(shù)的敏感性和特異性仍有待大量臨床試驗的評估。

當(dāng)侵入軟腦膜空間時，癌細(xì)胞會引起轉(zhuǎn)移微環(huán)境的相應(yīng)改變。最近一些研究[2,46]表明CSF中部分通路表達的改變可能與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并在軟腦膜空間增殖有關(guān)。因此，CSF蛋白質(zhì)組學(xué)分析，尤其是與轉(zhuǎn)移過程有關(guān)的蛋白，可能具有潛在的診斷和預(yù)后價值。Smalley等[13]對16例黑色素瘤LM患者的45份連續(xù)CSF樣本進行多重免疫測定和質(zhì)譜分析得出軟腦膜環(huán)境中許多關(guān)鍵途徑表達有所增加，如TGF-β水平的升高與較差的臨床表現(xiàn)狀態(tài)及更短生存期有關(guān)，多種補體成分(包括C2、C3、C6、C5、C9、C8α、C8β和C8γ)的表達增加可能表明患者軟腦膜炎性活動的增加，這可能導(dǎo)致一些與該疾病相關(guān)的嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的發(fā)生。CSF環(huán)境中的蛋白質(zhì)/轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析可能是LM患者生存預(yù)后的相關(guān)因素，全方位的檢測可用于評估治療效果，提示預(yù)后。

2.3.3 CSF生物標(biāo)志物 生物標(biāo)志物是指可以客觀測量和評估疾病過程或?qū)χ委煼磻?yīng)特征的指標(biāo)。當(dāng)前，所有可用于LM的生物標(biāo)志物均基于CSF研究。目前有關(guān)黑色素瘤LM的研究[47]已顯示某些非特異性標(biāo)記物，例如β-葡萄糖醛酸酶、乳酸脫氫酶(LDH)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，已可用作黑色素瘤LM診斷和評估治療反應(yīng)的間接指標(biāo)。有研究[47]表明，黑色素瘤LM患者CSF中β-葡萄糖醛酸苷酶和LDH水平顯著高于正常CSF水平，并與病程發(fā)展及治療反應(yīng)有一定相關(guān)性。VEGF已被證明在LM患者的CSF中有所升高[48]。Herrlinger等[49]通過比較39例LM患者(其中包括7例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者)連續(xù)CSF標(biāo)本得出LM患者診斷時的VEGF水平顯著升高(中位數(shù)359 pg/ml)。在可獲得連續(xù)CSF樣品的患者中，VEGF水平與臨床病程相關(guān)，治療緩解后顯著降低，復(fù)發(fā)時有所增加，具有預(yù)測疾病發(fā)展，指導(dǎo)早期治療的潛力。Groves等[48]通過分析89例LM患者(包括13例黑色素瘤LM)的CSF發(fā)現(xiàn)，升高的VEGF水平對惡性腫瘤的預(yù)測敏感性為67%～75%，特異性為95%～100%，表明CSF VEGF水平可作為高危LM黑色素瘤患者早期診斷的生物標(biāo)志物。但這些標(biāo)記物在診斷黑色素瘤LM時并非特異性，未來仍需大量的臨床實驗去探索新的高特異度和敏感度的生物標(biāo)記物，更好地預(yù)測疾病發(fā)展及監(jiān)測治療反應(yīng)。

2.4 軟腦(脊)膜活檢 如果無法通過細(xì)胞學(xué)、影像學(xué)及其他輔助檢查等方法診斷LM，并且已經(jīng)排除了慢性腦膜炎的常見原因，對于高度懷疑LM的患者則應(yīng)根據(jù)有癥狀的神經(jīng)部位和/或MRI上造影劑增強區(qū)域來進行軟腦脊膜活檢[50]。但由于腦膜活檢的創(chuàng)傷較大，累及部位的特殊性及新型診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，目前LM的診斷往往很少需要進行腦膜活檢[51]。

3 結(jié)論

黑色素瘤患者LM的發(fā)病率正在增加。雖然針對LM的治療已取得進展，但該群體的整體生存期仍然較短，其中及早診斷是提高生存期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。CSF細(xì)胞學(xué)是目前診斷LM最基本、可靠且操作性強的手段，同時不斷發(fā)展的診段工具和腫瘤標(biāo)記物也可以為早期診斷和治療提供幫助?？傊?，多模式的CSF分析可以為LM患者盡早提供診斷以及實現(xiàn)個體化治療。未來方向可以針對CSF單個腫瘤細(xì)胞進行檢測并治療，在萌芽期阻斷LM的發(fā)生。