陳雪珍，胡金輝，楊 爭，袁 博，王 霖，謝 婷

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007;2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

肉芽腫性乳腺炎(granulomatous lobular mastitis，GLM)又稱特發(fā)性肉芽腫性乳腺炎，是一種非細(xì)菌感染、非干酪樣壞死、局限于乳腺小葉、以肉芽腫為主要病理特征的慢性炎癥性乳腺疾病。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未明確。其病程長，纏綿難愈，給患者帶來極大的痛苦。因此，尋找有效的治療靶點(diǎn)和防治方法具有重要的科學(xué)意義。目前研究表明，西醫(yī)尚無良好的治療方法，中醫(yī)治療具有其獨(dú)特的優(yōu)勢。大量中醫(yī)研究和臨床實(shí)驗(yàn)研究表明，GLM的中醫(yī)病機(jī)主要為肝郁痰凝，因此疏肝化痰為其基本治則。本課題組前期研究證實(shí)，疏肝散結(jié)類中藥治療GLM有顯著療效[1-2]。消瘰丸的主要功效為疏肝化痰散結(jié)，該方治療GLM的機(jī)制尚未見報道。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為切入點(diǎn)，探討消瘰丸治療GLM的有效活性成分和作用靶點(diǎn)；揭示其可能治療GLM靶點(diǎn)及其分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用和進(jìn)一步開發(fā)提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1材料 TCM-ID數(shù)據(jù)庫[3-4]；PubChem數(shù)據(jù)庫；KEGG數(shù)據(jù)庫；PharmMapper數(shù)據(jù)庫[5-7]；GeneCards數(shù)據(jù)庫[8]；DAVID數(shù)據(jù)庫；Cytoscape 3.6.1軟件；R3.60軟件。

1.2消瘰丸有效成分的收集及處理 通過TCM-ID數(shù)據(jù)庫檢索并篩選消瘰丸的有效成分；通過PubChem數(shù)據(jù)庫查找化合物的3D結(jié)構(gòu)并將其導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫以預(yù)測其分子對接靶點(diǎn)；將消瘰丸靶點(diǎn)名注釋后通過string數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索GLM疾病靶點(diǎn)67個，將PPI網(wǎng)絡(luò)中包含的靶點(diǎn)與GLM疾病靶點(diǎn)相交取共同子集，即得到消瘰丸治療的靶點(diǎn)。

1.3消瘰丸治療GLM靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將消瘰丸相關(guān)靶點(diǎn)間相互關(guān)系及化合物與靶點(diǎn)相互關(guān)系文件整理后導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建消瘰丸靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4消瘰丸化學(xué)成分治療GLM關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO及KEGG通路分析 將消瘰丸治療GLM關(guān)鍵靶點(diǎn)通過webgestalt分析平臺[9]程序包進(jìn)行GO及KEGG富集分析。

2 結(jié) 果

2.1消瘰丸成分及其對應(yīng)靶蛋白的收集與篩選通過TCM-ID 數(shù)據(jù)庫檢索消瘰丸中所有中藥的化合物，通過PubChem數(shù)據(jù)庫檢索各個化合物的3D結(jié)構(gòu)或2D結(jié)構(gòu)，剔除無相關(guān)結(jié)構(gòu)的化合物；得到消瘰丸有效成分14個，見表1。通過PubChem數(shù)據(jù)庫查找14個化合物的3D或2D化學(xué)結(jié)構(gòu)并將其上傳至PharmMapper服務(wù)器平臺進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，以Norm Fit>0.7作為篩選條件，最后成功注釋得到197個靶點(diǎn)。

表1 消瘰丸活性化合物基本信息

2.2“消瘰丸-活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索GLM疾病靶點(diǎn)67個，發(fā)現(xiàn)消瘰丸治療GLM靶點(diǎn)6個，見表2；以消瘰丸活性成分及預(yù)測靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，構(gòu)建“消瘰丸活性成分-靶點(diǎn)”預(yù)測網(wǎng)絡(luò)；該網(wǎng)絡(luò)包含218個節(jié)點(diǎn)及1 895條邊，平均度數(shù)8.69，見圖1。

表2 消瘰丸治療肉芽腫性乳腺炎的靶點(diǎn)

圖1 消瘰丸“方劑-中藥-活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)”的相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3GO富集分析 將消瘰丸治療GLM 6個靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，GO 功能注釋是通過生物過程、細(xì)胞組分和分子功能對基因進(jìn)行注釋和分類，見圖2?？梢?，消瘰丸治療GLM可能參與對刺激的反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞通訊、代謝過程、多細(xì)胞生物過程、微生物過程、細(xì)胞增殖、發(fā)展過程、本土化、細(xì)胞成分組織、再生產(chǎn)、成長等生物過程。可能與膜封閉腔、核、膜、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外空間、內(nèi)膜系統(tǒng)、囊泡、含蛋白質(zhì)復(fù)合物、線粒體、高爾基體、信封、細(xì)胞投射、染色體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞組件相關(guān)，可能與蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、核酸結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、分子換能器活性、酶調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性、水解酶活性、核苷酸結(jié)合、電子轉(zhuǎn)移活性、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、氧結(jié)合等分子功能相關(guān)。

圖2 消瘰丸治療肉芽腫性乳腺炎靶點(diǎn)GO富集分析結(jié)果

2.4KEGG富集分析 將消瘰丸治療GLM 6個靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，得到與消瘰丸治療GLM相關(guān)的信號通路10條，主要包括甲狀腺激素合成、雌激素信號通路、乳腺癌、內(nèi)分泌和其他因子調(diào)節(jié)的鈣重吸收、谷胱甘肽代謝、催乳素信號通路、內(nèi)分泌抵抗、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、甲狀腺激素信號通路和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂。見圖3及圖4。

圖3 消瘰丸治療肉芽腫性乳腺炎靶點(diǎn)通路KEGG富集基因

圖4 消瘰丸治療肉芽腫性乳腺炎靶點(diǎn)通路KEGG富集的靶點(diǎn)數(shù)目

3 討 論

GLM目前主要治療方式有激素治療、抗結(jié)核治療、免疫治療、手術(shù)治療及中醫(yī)藥治療，但由于抗生素過用引起的耐藥、免疫抑制劑引起的免疫抑制以及激素誘導(dǎo)的同型肥胖和代謝紊亂，給疾病的治療帶來了更為嚴(yán)重的后果。嚴(yán)重的GLM患者甚至需要乳房全切手術(shù)，給患者帶來了重大的身心創(chuàng)傷。因此，深入研究GLM的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和防治方法具有重要的科學(xué)意義。

GLM屬于中醫(yī)學(xué)“乳發(fā)”“乳漏”“乳癰”“乳疳”“瘡瘍”等范疇。清·許克昌《外科證治全書·乳癰》載：“乳房內(nèi)結(jié)一塊，紅腫熱痛，大則言癰，小則言癤，由憤怒郁結(jié)，或多食厚味，致厥陰之氣不行，竅不通，陽明之血壅怫于內(nèi)故也。”林毅教授認(rèn)為本病由異物郁積，阻滯乳絡(luò)，氣血通行不暢，痰瘀交阻，凝聚成乳房腫塊；郁久化熱，熱盛肉腐成膿而發(fā)為乳房膿腫。治則當(dāng)“不必潰發(fā)，但令熱氣散，則自消”。消瘰丸是《醫(yī)學(xué)心悟》方劑，由玄參、牡蠣、浙貝母組成。方中牡蠣咸寒質(zhì)重，其味咸能軟堅(jiān)散結(jié)，性寒質(zhì)重則能平肝潛陽；浙貝母清熱化痰，散結(jié)消腫；玄參滋陰降火，潤燥軟堅(jiān)。本方藥味不多，但配伍精當(dāng)，力專效著，具有疏肝化痰、軟堅(jiān)散結(jié)之功，對肝郁痰凝、痰濕內(nèi)聚、痰瘀結(jié)塊所致的病癥有良好療效。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)入手，探討消瘰丸治療GLM的作用機(jī)制，為消瘰丸多成分、多靶點(diǎn)、多通路的治療機(jī)制提供參考。對消瘰丸與GLM的共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI映射并構(gòu)建活性成分-GLM-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)頻次較高的靶點(diǎn)為甲狀腺激素合成、雌激素信號通路、乳腺癌、內(nèi)分泌和其他因子調(diào)節(jié)的鈣重吸收、谷胱甘肽代謝、催乳素信號通路、內(nèi)分泌抵抗、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、甲狀腺激素信號通路和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等信號通路。目前研究認(rèn)為GLM與自身免疫性、感染因素、激素水平等密切相關(guān)，但是大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其屬于一種自身免疫性疾病。有研究證實(shí)GLM患者白細(xì)胞介素水平升高，白細(xì)胞介素調(diào)控的炎性反應(yīng)是乳腺疾病發(fā)生的重要因素，其水平異常和GLM的病理過程有關(guān)[10]。另有研究提示：運(yùn)用阿莫西林輔助潑尼松可通過降低GLM患者的白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)水平，提高患者的免疫功能，達(dá)到治療目的[11]。同時有研究證實(shí)IL-6信號通路與雌激素信號通路兩者之間存在相互作用，且兩條信號通路的相互作用對疾病的發(fā)生發(fā)展具有深廣的意義[12]。另有研究提示超重、肥胖和脂質(zhì)代謝異常均可增加GLM的發(fā)病風(fēng)險[13]。脂肪組織內(nèi)瘦素、抵抗素、內(nèi)臟脂肪素、脂聯(lián)素、促?；鞍?ASP)等脂肪因子發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用，同時對機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫功能具有一定影響。由此可知消瘰丸可能通過雌激素、IL-6、內(nèi)分泌或者孕激素水平等多靶點(diǎn)治療肉芽腫性乳腺炎。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步預(yù)測消瘰丸的活性成分、藥物靶點(diǎn)及藥物-疾病的相關(guān)通路，系統(tǒng)揭示了消瘰丸主要通過雌激素信號通路、內(nèi)分泌通路或者孕激素通路達(dá)到治療目的。研究結(jié)果對GLM的病因?qū)W有新的啟示，同時有望為中醫(yī)藥防治GLM提供新的依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。