周 茜， 王玉州， 陳 蕓， 凱迪日耶·玉蘇普， 劉 飛， 趙惠新

(1. 喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點實驗室， 喀什 844000； 2. 新疆師范大學(xué) 新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實驗室 干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實驗室， 烏魯木齊 830054 )

AP2/ERF(APETALA2/Ethylene responsive factor)廣泛存在于植物中，是一類能夠響應(yīng)非生物脅迫應(yīng)答和調(diào)控植物生長發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[1-2]。AP2類轉(zhuǎn)錄因子，通常含1或2個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，可以分為DREB(dehydration-responsive element binding protein)，AP2(APETALA 2)，RAV(related to ABI3/VP1)，ERF(ethylene-responsive element binding factors)4個亞族[3]。有研究表明[4]，水稻HL6基因突變后，破壞了AP2結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致水稻表皮毛發(fā)數(shù)量明顯降低，影響了水稻毛狀體起始發(fā)育；歐洲油菜BnAP2基因表達(dá)受抑制時，可以導(dǎo)致其花表型缺陷和雌性育性降低[5]；青蒿植物的AaERF1和AaERF2兩個AP2類基因，過表達(dá)時青蒿素和青蒿酸積累增加，抑制時兩種代謝物的含量均下降[6]；擬南芥AP2類基因AtCBF1過表達(dá)時對低溫耐受性有明顯提高[7]。許多研究表明，AP2類轉(zhuǎn)錄因子不僅能夠調(diào)控植物生長發(fā)育和參與植物次生代謝，還能夠抵御干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫[8]。

密碼子的正確翻譯是遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)準(zhǔn)確傳遞的關(guān)鍵[9-10]。密碼子偏性(condon usage bias，CUB)指在長期的物種進(jìn)化中，編碼同一氨基酸的密碼子可能不止一種；在翻譯過程中，同一種氨基酸在選擇密碼子時，往往受到環(huán)境的影響，使得其不能隨機(jī)使用密碼子，而存在一定選擇性。因此，密碼子為了更好地適應(yīng)基因表達(dá)特性而形成了使用偏性。不同物種具有不同的進(jìn)化方式，促使形成了自身特有的密碼子選擇偏性[9]。在生物界中，這樣的偏性使用現(xiàn)象普遍存在，能夠決定一些基因的堿基組成和基因表達(dá)水平等[11]。最優(yōu)先被使用的密碼子數(shù)量越多，越有利于基因的高效表達(dá)，從而使得表達(dá)量也較高[12]。評價密碼子使用偏好性的參數(shù)主要有有效密碼子數(shù)(effective number of codons，ENc)、同義密碼子相對使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)、密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation index，CAI)和不同位置GC含量等[11]。

獨行菜為十字花科獨行菜屬植物是典型的早春短命植物，能夠適應(yīng)早春低溫環(huán)境，是研究早春短命植物在低溫環(huán)境下抗逆生長的理想材料。前期課題組已對獨行菜的抗逆生理機(jī)制及轉(zhuǎn)錄組等進(jìn)行了研究，獲得了許多與其低溫抗逆相關(guān)的基因。目前已經(jīng)克隆獲得獨行菜LaAP2基因，并初步確定其在獨行菜幼苗抵抗低溫脅迫中起調(diào)控作用[13]，但對獨行菜LaAP2基因密碼子偏性還未進(jìn)行研究。本研究根據(jù)獨行菜LaAP2基因進(jìn)行預(yù)測，對其密碼子使用模式及其基因進(jìn)化模式進(jìn)行分析，為獨行菜LaAP2基因功能和轉(zhuǎn)基因研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)來源

獨行菜LaAP2 mRNA克隆于本實驗室，序列全長為1 005 bp，ORF長度為1 005 bp，編碼334個氨基酸。

辣椒、擬南芥和蘋果等24種AP2基因的序列來源于GenBank，具體見表1。模式生物大腸桿菌、酵母菌和擬南芥等基因組密碼子使用偏性數(shù)據(jù)，于Codon Usage Database網(wǎng)站上獲取。

表1 AP2基因編碼區(qū)序列

1.2 密碼子使用偏性分析

25種植物AP2基因的密碼子使用頻率等相關(guān)數(shù)據(jù)的計算，使用CodonW和EMBOSS(CUPS和CHIP)等程序[14-15]。使用Excel和SPSS軟件，對相關(guān)參數(shù)計算統(tǒng)計，進(jìn)行ENc、中性繪圖和PR2分析(PR2-bias plot analysis)。

1.3 同義密碼子使用偏性分析

RSCU值為密碼子使用頻率與預(yù)期使用頻率的比值，可以評價密碼子使用偏性程度。當(dāng)RSCU值為1，表明該密碼子在使用過程中無選擇性；RSCU值大于l時，該密碼子具有較高使用頻率；RSCU值小于l時，使用頻率較低[16]。兩個物種間密碼子使用頻率比值介于0.5～2.0時，表明兩物種間密碼子使用頻率差異性不大，密碼子選擇偏性小。當(dāng)比值小于等于0.5或大于等于2.0時，表明兩物種密碼子使用頻率差異較大，偏性有顯著差異[17]?；蛴行艽a子數(shù)ENc的值，介于20～61，值越接近20，證明密碼子使用個數(shù)越少，基因更加偏向選擇特殊的幾種密碼子，則偏性越強(qiáng)。反之，值越大，可選擇密碼子種類變多，偏性相對較弱且稀有密碼子增多[18]。

1.4 AP2基因的聚類分析

將25種植物AP2基因的RSCU值，利用SPSS19.0分析計算，根據(jù)Ward(離差平方和法)算法針對RSCU的變量把不同物種進(jìn)行偏性聚類，用歐氏平方距離表示基因間的距離[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 獨行菜LaAP2基因密碼子使用偏性分析

2.1.1 獨行菜LaAP2基因的GC、ENc和CAI分析

經(jīng)過CHIPS和CodonW程序的相關(guān)計算(表2)，獨行菜LaAP2基因的EN值為48.65，GC含量為42.69%，GC3s值為0.404。ENc值為48.65，大于35，小于61，體現(xiàn)出獨行菜LaAP2基因在翻譯編碼時，對密碼子的使用偏性弱，表達(dá)水平不高。獨行菜LaAP2基因CDS序列中GC含量為42.69%，則AT含量為57.31%，表明該基因偏性與使用堿基A或T。獨行菜LaAP2基因中密碼子的GC1為45.97%，GC2為39.70%，GC3值為42.39%，表明獨行菜LaAP2基因密碼子堿基的第3位主要選擇使用以AT結(jié)尾。獨行菜LaAP2基因密碼子CAI值為0.214，遠(yuǎn)比1小，與ENc值一致說明獨行菜LaAP2基因在使用密碼子時偏性不強(qiáng)。

2.1.2 獨行菜LaAP2基因的RSCU分析

采用CodonW程序?qū)Κ毿胁薒aAP2基因的RSCU值進(jìn)行計算，使用CUPS獲得獨行菜LaAP2基因密碼子的使用頻率。結(jié)果(圖1)顯示，獨行菜LaAP2基因密碼子RSCU的值有11個大于1.5，有25個大于1。獨行菜LaAP2基因中TTG為使用偏性較強(qiáng)的密碼子，RSCU值為2.75。其它編碼亮氨酸殘基的密碼子，CTA的RSCU值為0.25，CTC的RSCU值為0.25，CTG的RSCU值為0.00，CTT的RSCU值為0.50，TTA的RSCU值為2.25；TTA的值為2.25，也大于2，說明亮氨酸殘基編碼的過程中，6種密碼子中主要使用TTG和TTA，且更傾向于使用密碼子TTG，選擇偏性更強(qiáng)。

表2 LaAP2基因密碼子使用偏性相關(guān)參數(shù)

密碼子RSCU值不小于2的密碼子，還有TGT、CCG、ACG和GTT，表明也具有較高的使用偏性。密碼子RSCU值為0的有TGC、GGC、CTG和CCC，表明這4個密碼子在獨行菜LaAP2基因編碼時不使用。3個密碼子TGG、TAC和TAT的RSCU值為1，表明在編碼LaAP2蛋白質(zhì)時這些密碼子可被隨機(jī)選用。其余28種密碼子的RSCU值小于1，使用偏性比預(yù)期值小。TTG、GCC、TGT、CCG、ACG和GTT 6個密碼子在相應(yīng)的同義密碼子中選用頻率較高，這使得ENc值的要小于61。

圖中數(shù)字表示同義密碼子相對使用度(RSCU)；下劃線表示獨行菜LaAP2基因?qū)υ撁艽a子使用頻率較高。

2.2 不同物種間AP2基因密碼子選用偏性分析

2.2.1 不同物種AP2基因CDS序列及RSCU系統(tǒng)聚類

25個物種AP2基因密碼子基于RSCU值的偏性聚類分析如圖2，25個物種聚為兩大類。一大類由5種十字花科植物，3種茄科植物，2種大戟科植物，歐洲栗和油橄欖組成。其中，5種十字花科植物，3種茄科植物，2種大戟科植物，各歸為一小類，而歐洲栗和油橄欖歸為一小支。另一類由大豆、三七、柿、白樺、麻雀花、2種薔薇科植物和4種單子葉植物聚類而成。3種單子葉植物的蘭科植物聚為一小支，而禾本科的單子葉植物玉米與麻雀花聚為一小支；同屬薔薇科的草莓和蘋果并沒有聚在一支。以上說明在根據(jù)RSCU值進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，有時密碼子使用頻率相近的物種其親緣可能較近，也可能較遠(yuǎn)。因此，不同的AP2基因在物種進(jìn)化過程中傾向于使用特定的密碼子，導(dǎo)致其親緣關(guān)系和密碼子使用偏性有時無相關(guān)性，這也暗示著AP2基因在選擇使用密碼子時偏好性豐富。獨行菜LaAP2基因有關(guān)參數(shù)較雙子葉植物相近，體現(xiàn)了其密碼子使用特性上與雙子葉植物的一致性。

圖 2 AP2基因密碼子使用偏性聚類分析

2.2.2 不同AP2基因的中性分析

對25種植物AP2基因的GC、GC1、GC2、GC3和ENc，采用SPSS19.0進(jìn)行Pearson關(guān)聯(lián)分析。發(fā)現(xiàn)GC3與GC2呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，GC與GC1、CG2、CG3呈極顯著正相關(guān)性(P<0.01)，說明不同物種AP2基因的堿基成分相似(表3)。圖3中AP2基因的中性分析中，發(fā)現(xiàn)GC3的值介于0.305 7 ～ 0.949 5，GC12的范圍為0.408 3 ～ 0.617 4，大部分AP2基因分布在回歸線左右，波動范圍小。GC3和GC12的極顯著相關(guān)系數(shù)為0.828，P<0.01，線性回歸系數(shù)是0.686 1。對比Pearson結(jié)果，共同表明不同的AP2基因堿基組成差異小，突變壓力是影響其的主要因素[20]。獨行菜LaAP2基因離回歸線較近，靠近雙子葉植物分布的位點，偏離單子葉植物分布位點，與前面兩種聚類分析結(jié)果一致。

表 3 AP2基因密碼子成分相關(guān)性分析

圖3 AP2相關(guān)基因密碼子使用偏好中性繪圖

2.2.3 不同物種AP2基因ENc分析

對AP2基因ENc值進(jìn)行分析，結(jié)果(圖4)顯示，歐洲栗、煙草、甘藍(lán)、蘿卜和枇杷的基因在期望曲線上，表明這些物種突變壓力是導(dǎo)致AP2基因密碼子選擇偏性的主要因素[21]。木油桐、油橄欖、三七、白樺等8個物種在期望曲線上面分布，其余位點在期望曲線下面分布。表明大部分AP2基因在選擇密碼子時，除受堿基突變影響外，還受自然選擇的影響，與中性繪圖分析結(jié)果相似。然而獨行菜AP2基因并不在曲線上，且離期望曲線較遠(yuǎn)，表明自然選擇、表達(dá)量和基因長度等是影響其選擇密碼子的重要因素[22-23]。

圖4 AP2相關(guān)基因的 ENc-plot 分布

2.2.4 不同物種AP2基因PR2分析

25個物種AP2基因的PR2分析如圖5所示，G3/(G3+C3)或A3/(A3+T3)值均偏離0.5左右。在橫坐標(biāo)上，小于0.5的位點和大于0.5的位點數(shù)量大致一樣，表明AP2基因密碼子在G與C之間的使用上無顯著差異。在縱坐標(biāo)上，小于0.5的位點占大多數(shù)，說明AP2基因密碼子在使用A和T之間偏向于T結(jié)尾。由于PR2分析的比值等于0.5時，表明同義密碼子在第3位堿基選擇，會受堿基突變和其他多種因素的影響[24]?？梢娮匀贿x擇等其他壓力因素，在物種AP2基因的進(jìn)化中發(fā)揮著一定作用。

A3、T3、G3、C3分別表示密碼子第3位上堿基的含量。

2.3 獨行菜LaAP2基因受體系統(tǒng)的選擇

將獨行菜LaAP2基因與大腸桿菌、酵母菌和擬南芥等7個物種的基因組密碼子選用頻率計算比值。獨行菜LaAP2基因與大腸桿菌和酵母菌的比值，大于等于2.0和小于等于0.5值(表示偏性差異顯著)的分別有16和17個，表明大腸桿菌原核表達(dá)體系較酵母菌更易于獨行菜LaAP2基因的異源表達(dá)。獨行菜LaAP2基因與擬南芥、煙草和番茄密碼子使用頻率比值中，差異較大個數(shù)擬南芥為16個，煙草為18個，番茄為17個；水稻和玉米均為23。表明擬南芥在獨行菜LaAP2基因遺傳轉(zhuǎn)化功能驗證中，是更好的異源受體，且兩者同屬十字花科，親緣關(guān)系較近，能夠成為LaAP2基因瞬時表達(dá)的較佳受體。

3 討論

生物在長期的進(jìn)化過程中，由于受到自然選擇和基因突變等因素的影響，不同物種的不同基因，在選擇相應(yīng)的密碼子時，理論上傾向于使用最優(yōu)密碼子。然而，自然選擇會使基因偏好使用最優(yōu)密碼子，而基因突變會使部分非最優(yōu)密碼子存在。因此，每個物種特定的基因在生物進(jìn)化過程中就形成了自身獨特的密碼子偏好性。

本研究通過對獨行菜LaAP2基因密碼子偏性的研究，發(fā)現(xiàn)其堿基第3位主要選擇使用以AT結(jié)尾，堿基選用時偏向于AT。雙子葉植物密碼子多以GC結(jié)尾，但獨行菜偏向使用AT結(jié)尾，可能是其基因功能和類型所造成的。其密碼子使用偏性弱，表達(dá)水平或許不高?？赡苁瞧渥鳛檗D(zhuǎn)錄因子，在上游起重要的調(diào)控作用，不需要大量表達(dá)。分析LaAP2基因的RSCU值，發(fā)現(xiàn)TTG、GCC、TGT、CCG、ACG和GTT 6個密碼子在相應(yīng)的同義密碼子中選用頻率較高偏性強(qiáng)，這些密碼子的存在使得其ENc值偏離61。

不同基因可能選擇特殊的密碼子，使其存在使用偏性，導(dǎo)致RSCU聚類在表現(xiàn)物種真實的系統(tǒng)分類和親緣關(guān)系時有些偏差。而CDS序列聚類分析中，物種的親緣關(guān)系更加接近于傳統(tǒng)的物種分類。因此，結(jié)合RSCU和CDS聚類分析更有利于物種的精確分類，能更客觀地體現(xiàn)物種間AP2基因的進(jìn)化規(guī)律。自然選擇和受突變壓力是影響密碼子使用偏性的主要因素。此外，密碼子使用偏性也會受tRNA豐度、GC含量、基因表達(dá)水平、基因長短、甲基化位點和mRNA結(jié)構(gòu)等影響[25-26]。對25個物種AP2基因的密碼子進(jìn)行PR2偏好性分析、中性繪圖和ENc繪圖分析后，發(fā)現(xiàn)AP2基因的密碼子偏好性除堿基突變影響外，還受自然選擇等其他因素的影響。

分析獨行菜LaAP2基因密碼子使用頻率，得出大腸桿菌原核更易于獨行菜LaAP2基因的異源表達(dá)。但依據(jù)不同情況，使用時需要對基因進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化。通過對比分析，獨行菜與擬南芥的使用偏性差異最小，擬南芥在獨行菜LaAP2基因遺傳轉(zhuǎn)化功能驗證中，是更好的異源受體，且兩者同屬十字花科，親緣關(guān)系較近，能夠成為LaAP2基因瞬時表達(dá)的較佳受體。實際應(yīng)用中還需綜合mRNA二級結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控和轉(zhuǎn)化效率等因素，來決定LaAP2基因能否較高表達(dá)。因此，獨行菜LaAP2基因在異源植株高效遺傳表達(dá)仍需深入研究。