楊正濤，林方梁，溫利梅

（四川省自貢市第一人民醫(yī)院，自貢 643000）

牙髓治療普遍認可牙髓牙本質復合體的修復、再生，包括干細胞移植、細胞歸巢、牙髓血運重建等技術[1]。雖然醫(yī)療水平不斷進步，牙髓治療的技術也得到了很大提升，但臨床上仍存在很多問題。牙髓細胞具有很強的分化和再生牙本質牙髓復合體的能力，也是再生醫(yī)學研究的重要對象。據(jù)報道，牙髓細胞分化的分子機制受堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、轉化生長因子β（TGFβ）、神經(jīng)生長因子（NGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）等基因的調控[2]。微小RNA（miRNA）是一種非編碼RNA，長度在18～25 個核苷酸，其通過識別靶基因，抑制靶基因mRNA 的翻譯，從而在生物的發(fā)育、細胞增殖、凋亡、分化及腫瘤中發(fā)揮作用[3-4]。目前已發(fā)現(xiàn)，大量miRNA參與牙髓細胞的分化調控[5]，其中包括新發(fā)現(xiàn)的miR-508-3p[6]。AF4/FMR2 家庭成員4（AFF4）是AF4/FMR2 家族的最末位成員。AFF1 和AFF4 都是重要的表觀遺傳調控因子，其在人骨髓間充質干細胞成骨分化過程中的作用不同，其中AFF4 在促進骨髓間充質干細胞成骨分化中起著關鍵作用[7]。本研究通過構建缺氧誘導的牙髓細胞模型，觀察過表達miR-508-3p或敲減AFF4 對缺氧牙髓細胞分化的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自大連TaKaRa；pcDNA3.1（貨號：HG-VPI0001）、pcDNA3.1-AFF4（貨 號：GM-10405OP01）購自上海吉滿生物科技有限公司；兔抗AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP、TGFβ1、Smad、BMP抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗均購自上海艾博抗公司；熒光素酶報告基因試劑盒購自上海吉滿生物公司；RNA 抽提試劑盒、RT-qPCR試劑盒、ECL均購自碧云天。半干轉膜儀購自美國BIO-RAD公司，凝膠成像分析儀購自柯達公司。本試驗所用所有引物、質粒、mimics-NC、miR-508-3p mimics、si-NC、si-AFF4 序列均由上海吉瑪基因提供。

1.2 牙髓細胞的分離培養(yǎng) 收集2019 年2 月至2021年5月自貢市第一人民醫(yī)院拔除的無病變健康前磨牙或第三磨牙。無菌條件下取出牙髓組織，PBS洗凈，剪碎，用Ⅰ型膠原酶消化1 h。收集細胞，用20%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，隔2 d 換液1 次，0.25%胰酶消化傳代。取第3～6 代的細胞用于實驗研究。

1.3 缺氧牙髓細胞模型的建立與分組轉染 用200 μmol/mL 的氯化鈷（CoCl2）溶液處理牙髓細胞24 h，建立缺氧模型，記為實驗組。用等量生理鹽水處理的牙髓細胞為對照組。使用Lipofectamine?2000 脂質體將miR-NC 組（轉染mimics-NC）、miR-508-3p組（轉染miR-508-3p mimics）、si-NC組（轉染si-NC）、si-AFF4 組（轉染si-AFF4）、miR-508-3p+pcDNA 組（共轉染miR-508-3p mimics 和pcDNA）、miR-508-3p+pcDNA-AFF4 組（共轉染miR-508-3p mimics 和pcDNA-AFF4）轉染至實驗組牙髓細胞。轉染48 h后，用RT-qPCR法檢測轉染效率。

1.4 RT-qPCR 實驗 提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，進行PCR 反應。miR-508-3p 內參為U6，AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP 內參為GAPDH。用2-△△Ct法計算miR-508-3p、AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP的表達。PCR反應條件：94 ℃變性2 min；94 ℃變性30 min；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min，共45 個循環(huán)。引物序列如下：miR-508-3p 上游：5’-ACACTCCAGCTGGGTACTCCAGAGGGCGTCACT-3’，下游：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；DMP1 上游：5’-GTGAGTGAGTCCAGGGGAGATAA-3’，下游：5’-TTTTGAGTGGGAGAGTGTGTGCC-3’；DSPP 上游：5’-GGGACACAGGAAA-AGCAGAA-3’，下 游：5’-TGCTCCATTCCCACTAGGAC-3’；OCN 上游：5’-CTCACACTCCTCGCCCTATT-3’，下游：5’-TTGGACACAAAGGCTGCAC-3’；ALP上游：5’-CTATCCTGGCTCCGTGCTC-3’，下游：5’-GCTGGCAGTGGTCAGATGTT-3’；GAPDH上游：5’-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3’，下游：5’-GGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3’；U6 上游：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游：5’-CGCTTC ACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.5 Western blotting 實驗 將細胞充分裂解，提取總蛋白，并進行定量、煮沸變性。SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉移至PVDF 膜，脫脂奶粉封閉，加入一抗AFF4（1∶1 000）、DMP1（1∶1 000）、DSPP（1∶500）、OCN（1∶1 000）、ALP（1∶1 000）、TGFβ1（1∶800）、Smad（1∶2 000）、BMP（1∶1 500）4 ℃孵育過夜；洗膜，加入山羊抗兔二抗溶液（1∶500）37 ℃孵育2 h，洗膜，ECL 顯影、曝光。ImageJ 分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.6 雙熒光素酶報告基因實驗 在線預測網(wǎng)站Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）預測到miR-508-3p 與AFF4 存在靶向關系。將AFF4 3’UTR WT、AFF4 3’UTR MUT分別與miR-NC、miR-508-3p、anti-miR-NC、anti-miR-508-3p 構建重組載體質粒，并共轉染至293T 細胞。用雙熒光素酶活性檢測試劑盒測定細胞中螢火蟲熒光素酶的熒光值與海腎熒光素酶的熒光值的比值。

1.7 統(tǒng)計學方法 用PEMS 3.2軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-508-3p、AFF4 及牙髓分化指標在缺氧誘導牙髓細胞中的表達 與對照組相比，實驗組細胞中miR-508-3p 的表達顯著升高，AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP 表達均顯著降低（均P＜0.01），見圖1。

圖1 miR-508-3p、AFF4及牙髓分化檢測指標在缺氧誘導牙髓細胞中的表達

2.2 過表達miR-508-3p 或敲減AFF4 對缺氧誘導牙髓細胞分化的影響 與miR-NC 組相比，miR-508-3p組miR-508-3p表達顯著升高，AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP 的表達均顯著降低（均P＜0.01）。與si-NC 組相比，si-AFF4 組miR-508-3p 表達升高，AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP 的表達均明顯降低（均P＜0.01），見圖2。

圖2 過表達miR-508-3p或敲減AFF4對缺氧牙髓細胞分化的影響

2.3 miR-508-3p 靶 向AFF4 Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）預測到miR-508-3p與AFF4之間的互補堿基序列，見圖3A。與miR-NC 組相比，miR-508-3p組AFF4 3’UTR WT細胞的熒光活性顯著降低（P＜0.01），而AFF4 3’UTR MUT 組細胞的熒光活性變化不明顯，見圖3B；與miR-NC組相比，miR-508-3p組AFF4 蛋白表達顯著降低，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-508-3p 組AFF4 蛋白表達顯著升高（P＜0.01），見圖3C。

圖3 miR-508-3p與AFF4的靶向關系

2.4 過表達AFF4 部分逆轉過表達miR-508-3p 對缺氧誘導牙髓細胞分化的作用 與miR-508-3p+pcDNA 組相比，miR-508-3p+pcDNA-AFF4 組誘導牙髓細胞中miR-508-3p 表達顯著降低，AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP 的表達均明顯升高（P＜0.01），見圖4。

圖4 過表達AFF4對miR-508-3p的抑制誘導牙髓細胞分化作用的調控

2.5 TGFβ1 信號通路在缺氧誘導牙髓細胞中受miR-508-3p、AFF4 調控 與miR-NC 組相比，miR-508-3p 組TGFβ1、Smad、BMP 蛋白表達均顯著降低（P＜0.01）；與miR-508-3p+pcDNA 組相比，miR-508-3p+pcDNA-AFF4組TGFβ1、Smad、BMP蛋白表達均顯著升高（P＜0.01）；與si-NC 組相比，si-AFF4組TGFβ1、Smad、BMP 蛋白表達均顯著降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 TGFβ1信號通路關鍵蛋白TGFβ1的表達與miR-508-3p/AFF4的關系

3 討論

牙髓細胞分化所處的環(huán)境含氧量雖然遠遠低于正常細胞培養(yǎng)的含氧量，但是若牙髓細胞長期受到炎癥、外傷、牙菌斑侵蝕等，容易誘發(fā)牙髓組織的缺血缺氧[8-9]。袁曉琴等[10]在研究中使用化學法誘導牙髓細胞缺氧，模擬牙髓的缺氧環(huán)境，在此基礎上發(fā)現(xiàn)，miR-210-3p參與牙髓在缺氧環(huán)境中的促增殖分化作用。因此，本研究建立了缺氧環(huán)境中的牙髓細胞模型，用于探究miR-508-5p、AFF4 在其中的功能及機制。

miRNA參與人類的多種疾病的發(fā)病過程，其中包括牙髓疾病[11]。Liu等[12]研究報道，miR-508-5p在牙周發(fā)育的過程中表達逐漸降低，過表達miR-508-5p 后，牙髓細胞的分化能力顯著降低，miR-508-5p的這種抑制牙髓細胞分化功能可被非轉移性黑色素瘤糖蛋白B（GPNMB）逆轉，揭示miR-508-5p 通過靶向GPNMB 發(fā)揮抑制牙髓細胞分化的調節(jié)機制。于是，猜測miR-508-3p可能參與調控缺氧條件下牙髓細胞的分化過程。本研究檢測了缺氧牙髓細胞中miR-508-5p 的表達發(fā)現(xiàn)，其明顯升高，再次確定了miR-508-5p 在牙髓細胞分化中的抑制作用。本實驗對miR-508-5p 過表達后的缺氧牙髓細胞進行檢測，檢測其中牙髓分化相關基因DMP1、DSPP、OCN、ALP 的表達發(fā)現(xiàn)，其可抑制牙髓分化的上述基因表達，這些結果與Liu 等[12]的實驗結果相一致。通過熒光素酶實驗進行深入探究發(fā)現(xiàn)，miR-508-5p可與靶向負調節(jié)AFF4的表達水平。推測這種靶向關系可能與miR-508-5p 的牙髓分化調節(jié)有關。這些實驗結果揭示了miR-508-5p 在缺氧牙髓細胞中顯著升高，發(fā)揮抑制牙髓細胞分化功能，這種抑制功能與靶向AFF4緊密相關。

近期，AFF4 在人類疾病發(fā)生發(fā)展中的調控功能的研究越來越多[13]。最近Xiao等[14]發(fā)現(xiàn)，AFF4參與牙囊細胞的成骨分化過程，敲減AFF4 能夠下調成骨相關基因遠端同源框5、核心結合因子a1 和骨γ-羧谷氨酸蛋白的表達，而慢病毒介導的AFF4過表達則具有相反的作用，并顯著增強牙囊細胞的成骨能力，這種調控作用與AFF4上調ALKB同源蛋白1具有直接關系。Zhang 等[15]報道，慢病毒介導的AFF4 過表達能夠促進牙髓細胞的成牙分化，而AFF4缺失則可抑制牙髓細胞分化，并且AFF4的這種功能與牙根形成關鍵因素核因子ⅠC相關。本研究發(fā)現(xiàn)，AFF4 在缺氧牙髓細胞中表達下調，敲減AFF4 可抑制牙髓分化相關基因DMP1、DSPP、OCN、ALP的表達，并且過表達AFF4還可逆轉過表達miR-508-3p對DMP1、DSPP、OCN、ALP表達的下調作用。這說明了AFF4可逆轉miR-508-5p對牙髓細胞分化的抑制作用。

大量研究報道，TGFβ1信號通路參與牙髓細胞損傷過程[16]。為了探究該通路是否受miR-508-3p、AFF4 的影響，本實驗檢測了TGFβ1 信號通路關鍵基因TGFβ1、Smad、BMP 的表達情況，結果顯示，miR-508-5p 可抑制缺氧誘導的牙髓細胞中TGFβ1、Smad、BMP的表達，敲減AFF4也具有相似的功能，而過表達AFF4可逆轉過表達miR-508-3p對TGFβ1、Smad、BMP 的抑制作用。這些實驗結果展示了TGFβ1 信號通路的活性在缺氧牙髓細胞中受miR-508-3p 的抑制、AFF4 的 促進，揭示miR-508-5p/AFF4/TGFβ1信號通路在牙髓細胞分化中的調控機制。

綜上所述，miR-508-5p 可抑制缺氧誘導的牙髓細胞分化，產(chǎn)生這種作用的機制與miR-508-5p靶向AFF4，抑制TGFβ1 信號通路活性有關，本研究結果可為牙髓再生提供理論參考。