王苑菲，沈美曉，吳祖榮，黃亞蓮，琚 楓，符 暢，符茂雄

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，海口 570100）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是一種常見糖尿病微血管并發(fā)癥，是終末期腎病的最常見病因，具有腎小球高過濾、腎臟肥大等不良表現(xiàn)，發(fā)展到末期可導(dǎo)致腎衰竭，嚴(yán)重危害患者生命健康[1-2]，金絲桃苷（Hyperoside，HP）廣泛分布于各種植物中，是一種天然黃酮醇苷類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化等多種生理作用[3]。Zhang等[4]研究報(bào)道，HP能顯著改善DN小鼠腎小球硬化從而維持腎功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，Zhou等[5]研究顯示，HP能顯著緩解DN大鼠腎小球過濾功能及腎臟損害并減輕早期糖尿病腎病臨床癥狀，并認(rèn)為HP具有成為DA新型治療藥物的潛在價(jià)值，但關(guān)于其對DA 大鼠腎上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）影響的研究較少。因此，繼續(xù)探究DN 可能發(fā)病機(jī)制及相關(guān)治療方案仍是近年來的研究熱點(diǎn)。腎臟纖維化是DN 的主要病理特征，與腎功能損害密切相關(guān)[6]，資料顯示腎EMT是腎臟纖維化的初始環(huán)節(jié)之一[7-8]，鐘濤等[8]研究表明轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/smad 通路的激活與DN發(fā)展及腎EMT發(fā)生密切相關(guān)，因此本研究通過建立DN 大鼠模型，探究HP 對DN 大鼠腎EMT 及TGF-β 1/smad通路的影響，為臨床治療DN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、材料及設(shè)備

SPF 級雄性SD 大鼠（體質(zhì)量200 g～220 g）由南京醫(yī)科大學(xué)提供（實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（蘇）2018-0001）；金絲桃苷（貨號：482-36-0，純度≥97.0%）、鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（貨號：111607-200301，純度＞98%）均購自Sigma 公司；羅格列酮片（Rosiglitazone，RGZ，批號：190106）購自成都恒瑞制藥有限公司；HE 染色試劑盒（貨號：G1121）、Masson染色試劑盒（貨號：G1340）、全蛋白提取試劑盒（貨號：BC3170）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：PC0020）均購自北京索萊寶科技有限公司；兔源一抗anti-纖維連接蛋白（Fibronectin）（貨號：ab268020）、anti-E-鈣黏蛋白（E-cadherin）（貨號：ab40772）、anti-α-平滑肌動蛋白（α-smooth muscles actin，α-SMA）（貨號：ab5694）、anti-TGF-β1（貨號：ab215715）、anti-smad2（貨號：ab40855）、anti-smad3（貨號：ab40854）、anti-smad7（貨號：ab216428）、anti-GAPDH（貨號：ab181602），二抗羊抗兔IgG（貨號：ab6721）均購自英國Abcam 公司；動物代謝籠（型號：41800）購自意大利Ugo Basile公司；全自動生化分析儀（型號：Catalyst One）購自美國IDEXX；光學(xué)顯微鏡（型號：ContourGT-K）購自美國BRUKER 公司等。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組給藥 將60只SD大鼠隨機(jī)分為造模組（48只）和對照（NC）組（12只），DN大鼠模型的構(gòu)建參考文獻(xiàn)[9]并稍作改動，所有造模大鼠均用高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料中含有60%普通飼料、2%膽固醇、8%蛋黃粉、10%煉豬油、20%蔗糖，持續(xù)喂養(yǎng)4 周，第4 周最后一天對大鼠進(jìn)行腹腔注射STZ 30 mg/kg（用0.1 mol/L 的檸檬酸緩沖液配置的1%STZ溶液）。觀察到大鼠飲水量、尿量顯著增加，出現(xiàn)毛色發(fā)黃、脫毛、煩躁等癥狀時(shí)，進(jìn)行尾靜脈采血，于全自動生化分析儀中測定大鼠血糖值，連續(xù)3 d測血糖≥16.7 mmol/L，表明糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功；將大鼠置于動物代謝籠中繼續(xù)喂養(yǎng)，記錄大鼠24 h尿量并測定24 h尿蛋白，當(dāng)尿量≥150%原尿量，尿蛋白量＞30 mg/24 h為DN模型構(gòu)建成功。對照組正常喂養(yǎng)。

將造模組48 只DN 大鼠隨機(jī)分為模型（M）組、陽性藥物羅格列酮（RGZ）組、HP低（HP-L）、中（HPM）、高劑量（HP-H）組，每組12只。建模成功后24 h開始給藥，參考文獻(xiàn)[10]將HP低、中、高劑量組灌胃劑量分別設(shè)置為12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg；RGZ 組給藥劑量按照人體表法計(jì)算，系數(shù)采用6.25，成年人每日RGZ 用量為4 mg，則大鼠給藥劑量設(shè)置為0.4 mg/kg，NC組、M組均灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃8周。

1.2.2 標(biāo)本采集 治療結(jié)束后，將大鼠放于動物代謝籠中收集各組大鼠24 h尿液，離心后收集上清液保存待檢。腹腔注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉處死各組大鼠，腹主動脈采血，低溫離心后收集血清至離心管中，低溫保存?zhèn)溆?。對大鼠進(jìn)行體表常規(guī)消毒后解剖大鼠，分離大鼠腎臟組織行后續(xù)病理學(xué)觀察及相關(guān)蛋白的免疫印記法（Western blotting，WB）檢測。

1.2.3 FBG 及血清生化指標(biāo)檢測 采用全自動生化分析儀分析尿微量白蛋白（urinealbumin，UAlb）、尿肌酐（urine creatinine，Ucr）及尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、空腹血糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG）水平。

1.2.4 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)觀察 取1.2.2 中大鼠左側(cè)腎臟組織，從最大面切為兩部分，取其中一部分置于多聚甲醛中固定，固定好后經(jīng)過不同濃度梯度的酒精溶液、二甲苯溶液進(jìn)行脫水及透明處理，用石蠟進(jìn)行常規(guī)包埋后行切片處理，按照蘇木精—伊紅（HE）染色試劑盒中的操作說明進(jìn)行染色處理，將石蠟切片經(jīng)過二甲苯溶液脫蠟處理，經(jīng)過不同濃度的酒精溶液進(jìn)行水化處理，經(jīng)過蘇木素染色、返藍(lán)液返藍(lán)、伊紅染色、脫水、透明化等處理后進(jìn)行封片，于顯微鏡中觀察腎臟組織病理學(xué)變化。

1.2.5 Masson染色法觀察大鼠腎臟纖維化程度

取“1.2.4”項(xiàng)中另一部分腎臟組織用于Masson染色，制作常病理組織切片，具體操作步驟參考Masson染色試劑盒，常規(guī)脫蠟至水，用Weigert鐵蘇木素染色液染色10 min，酸性乙醇分化液分化15 s，Masson 藍(lán)化液返藍(lán)5 min，蒸餾水沖洗1 min，麗春紅品紅染液染色10 min，依次用弱酸工作液、磷鉬酸溶液清洗，放入苯胺藍(lán)染液中染色2 min，經(jīng)弱酸工作液沖洗、乙醇脫水、二甲苯透明處理后用中性樹膠封固，于光學(xué)顯微鏡中觀察并拍照，根據(jù)腎臟組織纖維化面積與所選視野總面積之比計(jì)算大鼠腎臟組織纖維化面積比。

1.2.6 WB 實(shí)驗(yàn)測定各組大鼠EMT、TGF-β1/smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

采用蛋白提取試劑盒提取各組大鼠右側(cè)腎組織總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。取60 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳變性，轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，依次添加一抗anti-Fibronectin（1∶400）、anti-E-cadherin（1∶600）、anti-α-SMA（1∶500）、anti-TGF-β1（1∶1 000）、anti-smad2（1∶1 000）、anti-smad3（1∶1 000）、anti-smad7（1∶1 000）、anti-GAPDH（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，添加二抗IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，顯色、曝片，以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模組與NC組大鼠FGB及尿蛋白水平比較

與NC組比較，造模組大鼠FBG、尿蛋白水平均顯著升高（均P＜0.05），提示DN 大鼠模型構(gòu)建成功，見表1。

表1 造模組與NC組大鼠FGB及24 h尿蛋白水平比較

表1 造模組與NC組大鼠FGB及24 h尿蛋白水平比較

與NC組比較，aP＜0.05。

2.1 各組大鼠FGB及生化指標(biāo)水平比較

與NC 組比較，M 組大鼠FBG、UAlb、Ucr、BUN水平均顯著升高（均P＜0.05）；與M組比較，RGZ組大鼠FBG、UAlb、Ucr、BUN水平均顯著降低（均P＜0.05），HP-L 組、HP-M 組、HP-H 組大鼠FBG、UAlb、Ucr、BUN水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（均P＜0.05），其中HP-H組優(yōu)于RGZ組（均P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠FGB、UAlb、Ucr、BUN水平比較 n=12，

表2 各組大鼠FGB、UAlb、Ucr、BUN水平比較 n=12，

與NC組比較，aP＜0.05；與M組比較，bP＜0.05；與RGZ組比較，cP＜0.05；與HP-L組比較，dP＜0.05；與HPM組比較，eP＜0.05。

2.2 各組大鼠腎組織病理學(xué)觀察

NC 組大鼠腎組織及腎小管結(jié)構(gòu)基本正常，無明顯損害；與NC 組比較，M 組大鼠腎組織病變嚴(yán)重，出現(xiàn)腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，腎小球體積顯著增大且染色偏藍(lán)，腎臟纖維化面積顯著較多（均P＜0.05）；與M組比較，RGZ組大鼠腎組織形態(tài)得到明顯改善，腎臟纖維化程度顯著降低（均P＜0.05），HP 各劑量組大鼠腎組織腎臟組織損害及纖維化程度均得到明顯改善，且呈劑量依賴性（均P＜0.05）。其中HP-H 組優(yōu)于RGZ 組（均P＜0.05），見圖1、表3。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)觀察

表3 各組大鼠腎組織纖維化面積比 n=12，

表3 各組大鼠腎組織纖維化面積比 n=12，

與NC 組比較，aP＜0.05；與M 組比較，bP＜0.05；與RGZ組比較，cP＜0.05；與HP-L 組比較，dP＜0.05；與HP-M 組比較，eP＜0.05。

2.3 各組大鼠腎EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

與NC組比較，M組大鼠腎組織E-cadherin蛋白水平顯著降低，α-SMA、Fibronectin蛋白水平顯著增加（均P＜0.05）；與M組比較，RGZ組大鼠腎組織Ecadherin 蛋白水平顯著增加，α-SMA、Fibronectin 蛋白水平顯著降低（均P＜0.05），HP-L 組、HP-M 組、HP-H 組大鼠腎組織腎組織E-cadherin 蛋白水平顯著增加，α-SMA、Fibronectin 蛋白水平顯著降低，且呈劑量依賴性（均P＜0.05）。其中HP-H 組優(yōu)于RGZ組（均P＜0.05），見表4和圖2。

圖2 各組大鼠腎組織E-cadherin、α-SMA、Fibronectin 蛋白表達(dá)

表4 各組腎組織E-cadherin、α-SMA、Fibronectin 蛋白表達(dá)比較 n=12，

表4 各組腎組織E-cadherin、α-SMA、Fibronectin 蛋白表達(dá)比較 n=12，

與NC 組比較，aP＜0.05；與M 組比較，bP＜0.05；與RGZ組比較，cP＜0.05；與HP-L 組比較，dP＜0.05；與HP-M 組比較，eP＜0.05。

2.4 各組大鼠腎組織TGF-β1/smad 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

與NC 組比較，M 組大鼠腎組織TGF-β1、smad2、smad3 蛋白水平顯著增加，smad7 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與M組比較，RGZ組大鼠腎組織TGF-β1、smad2、smad3蛋白水平顯著降低，smad7蛋白水平顯著增加（P＜0.05），HP-L 組、HP-M 組、HP-H 組大鼠腎組織腎組織TGF-β1、smad2、smad3蛋白水平顯著降低，smad7蛋白水平顯著增加，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。其中HP-H 組優(yōu)于RGZ 組（P＜0.05），見表5和圖3。

表5 WB檢測腎組織TGF-β1/smad通路相關(guān)蛋白表達(dá) n=12，

表5 WB檢測腎組織TGF-β1/smad通路相關(guān)蛋白表達(dá) n=12，

與NC組比較，aP＜0.05；與M組比較，bP＜0.05；與RGZ組比較，cP＜0.05；與HP-L組比較，dP＜0.05；與HP-M組比較，eP＜0.05。

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1/smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

DN 是導(dǎo)致糖尿病死亡的重要原因之一，目前對其發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，與糖代謝紊亂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激等因素有關(guān)，腎病的不斷發(fā)展會引起腎臟纖維化程度增加、腎水腫等，嚴(yán)重時(shí)可威脅患者生命[11]。因此，探究DN 相關(guān)治療策略及可能機(jī)制仍是研究中的熱點(diǎn)，而建立穩(wěn)定有效的DN動物模型具有重要意義，楊等[9]通過高脂飼料喂養(yǎng)及STZ注射成功建立DN大鼠，本研究結(jié)果顯示，與NC 組比較，M 組大鼠FBG、UAlb、Ucr、BUN 水平均顯著升高，與DN病情發(fā)展類似，腎組織病理學(xué)結(jié)果顯示模型組大鼠腎臟組織受到損害、纖維化程度加深，提示DN大鼠模型制備成功。

RGZ 是臨床治療DN 的常見藥物，但其療效不穩(wěn)定且存在一定的肝毒性[12]。研究發(fā)現(xiàn)，植物中含有的多酚類、黃酮類化合物具有抗炎、降血脂及增強(qiáng)免疫力等多種生物活性，HP廣泛存在于各種植物中，為天然黃酮類化合物，因其分布廣泛且具有一定的藥理作用而深受研究者關(guān)注[13-14]。黃凱等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HP可通過清除自由基、減少炎性因子釋放、調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群平衡對小鼠免疫性肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用。Zhang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)HP 可減少DN 小鼠的UAlb，改善DN 小鼠腎小球系膜基質(zhì)的擴(kuò)張及足細(xì)胞突起的消失，進(jìn)而緩解DN 小鼠的腎臟損傷。An等[17]研究發(fā)現(xiàn)，HP 可減輕DN 小鼠腎小球基底膜損傷，改善其臨床癥狀，對DN小鼠腎組織有一定的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，與M組比較，經(jīng)HP治療的大鼠FBG、UAlb、Ucr、BUN 水平均顯著降低，腎臟受損程度及腎臟纖維化面積均得到改善，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中HP-H 組較好且優(yōu)于陽性藥物RGZ 組，提示HP 可有效改善DN 大鼠血糖代謝及腎臟功能。

資料顯示，進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化是DN 的標(biāo)志性病理特征，而EMT在腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮重要作用，EMT是使極化的上皮細(xì)胞經(jīng)歷多種生化變化獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過程，在此過程中，上皮細(xì)胞的遷移、侵襲、抗凋亡能力較強(qiáng)，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，進(jìn)而加劇腎間質(zhì)細(xì)胞纖維化，危害腎臟功能[18]。Yang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，YY1 高表達(dá)可通過上調(diào)α-SMA 的表達(dá)誘導(dǎo)EMT，進(jìn)而促進(jìn)糖尿病小鼠腎纖維化。EMT常以α-SMA、Fibronectin等間充質(zhì)標(biāo)記物過表達(dá)、E-cadherin 表達(dá)缺失等為主要特征[20]，本研究結(jié)果顯示，與NC 組比較，M 組大鼠Ecadherin 蛋白水平顯著降低，α-SMA、Fibronectin 蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示腎EMT與腎臟纖維化聯(lián)系密切，可能參與了DN進(jìn)程，與M組比較，HP各劑量組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平均得到緩解，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中HP-H 組較好且優(yōu)于陽性藥物RGZ 組，提示HP 可能具有一定的抑制DN 大鼠腎EMT的作用。

TGF-β1 可誘導(dǎo)多種上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，具有正向調(diào)控EMT的作用，是腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化的重要細(xì)胞因子[21-22]，林等[21]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/smad通路激活可促進(jìn)肝臟細(xì)胞EMT及肝臟纖維化進(jìn)程，TGF-β1 與其受體結(jié)合形成三聚體，進(jìn)而激活smad2、smad3，而smad7 可抑制TGF-β1 信號的傳導(dǎo)，可抑制腎EMT及腎纖維化進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示，與與M 組比較，HP 各劑量組大鼠腎組織TGF-β 1、smad2、smad3 蛋白水平顯著降低，smad7 蛋白水平顯著增加，提示HP可能通過抑制TGF-β1/smad通路激活來減輕DN大鼠腎EMT及腎纖維化程度。

綜上所述，HP 可減輕DN 大鼠腎EMT 及腎纖維化程度，可能與抑制TGF-β1/smad 通路有關(guān)。本研究初步探索HP 對DN 大鼠腎功能的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，但HP作用機(jī)制復(fù)雜，關(guān)于其詳細(xì)藥理作用機(jī)制尚不完全明確，有待進(jìn)一步深入探究。