任玉鵬，納 吉，向 華，向 萌，王一丹

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus, PRV）引起的豬的一種急性接觸性傳染病。除豬外，犬、貓和其他多種家畜均為其易感動(dòng)物。PRV對(duì)各年齡豬只均可引起發(fā)病，以引起呼吸困難、神經(jīng)癥狀和繁殖障礙為特征，特別是導(dǎo)致母豬流產(chǎn)，仔豬感染死亡率可達(dá)100%，危害極為嚴(yán)重[1]。我國長期通過免疫接種、抗體監(jiān)測(cè)等手段持續(xù)對(duì)PRV進(jìn)行防控和凈化，這使得豬偽狂犬病疫情在一定程度上得到控制。但是，近年來我國PRV免疫失敗的案例層出不窮，具體表現(xiàn)為免疫PRV Bartha-k61基因缺失疫苗的豬群再次出現(xiàn)感染，并且其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，給我國PRV的防控帶來新的挑戰(zhàn)[2]。

對(duì)當(dāng)前流行的PRV毒株分子特征研究結(jié)果表明，流行株基因組出現(xiàn)了不同程度的遺傳變異，特別是自2011年后，PRV變異株的出現(xiàn)導(dǎo)致其在國內(nèi)流行趨勢(shì)逐步上升。近年來，在四川、河南、湖北和廣東等多地均有PRV流行的報(bào)道[3]。對(duì)PRV變異株主要毒力基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，變異株與經(jīng)典毒株處于不同的分支，經(jīng)典毒株屬于基因1型，變異株多為基因2型，在gB、gC、gD和gE基因均存在一定程度的遺傳變異[4-5]。如gB基因的遺傳變異多分布于其重要抗原表位（59～279氨基酸）區(qū)域，這可能是導(dǎo)致毒株部分抗原性改變的重要原因[6-7]。此外，高映雪等[8]對(duì)2013—2018年國內(nèi)流行的64個(gè)毒株測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，所有毒株與經(jīng)典株相比在gE基因均出現(xiàn)不同程度的變異，特別是第48位氨基酸處均存在1個(gè)天冬氨酸（D）插入。由于gE基因是PRV重要的毒力基因，上述氨基酸變異是否對(duì)病毒毒力產(chǎn)生影響值得進(jìn)一步研究。同時(shí)，gE基因作為PRV重要分子檢測(cè)靶點(diǎn)，是野毒株與基因缺失疫苗株的重要鑒別基因，該基因的核苷酸變化可能會(huì)導(dǎo)致部分已有檢測(cè)方法的靈敏性下降[9]。所以，新的PRV分子檢測(cè)方法有必要建立。

本研究擬建立一種基于TaqMan熒光定量PCR技術(shù)的PRV分子檢測(cè)方法，以PRV的gE基因作為靶向基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，達(dá)到有針對(duì)性檢測(cè)PRV野毒株的目的。同時(shí)對(duì)該方法的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行優(yōu)化，評(píng)估其敏感性、特異性和穩(wěn)定性，并比較其與商品化試劑盒檢測(cè)符合率，以期為PRV野毒株的快速檢測(cè)提供可靠手段。

1 材料與方法

1.1 菌毒株及樣本

試驗(yàn)于2020年7—12月在西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。PRV Bartha-k61疫苗株購自某實(shí)業(yè)股份有限公司；豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬A群輪狀病毒（PoRV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬鏈球菌（S.suis）、豬源大腸桿菌（E.coli）、豬源巴氏桿菌（P.multocida）、豬霍亂沙門氏菌（S.choleraesuis）和葡萄球菌（S.aureus）等用于特異性檢驗(yàn)的菌毒株及核酸樣本信息見表1；用于符合率檢測(cè)的50份PRV已知陽性樣本核酸及40份已知陰性樣本核酸由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

表1 菌毒株信息及來源

1.2 主要試劑

TIANamp Virus DNA/RNA kit和TIANamp Bacteria DNA kit購自天根生物科技（北京）有限公司；豬偽狂犬病病毒（gE基因）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防控技術(shù)有限公司；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）、BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物及探針的設(shè)計(jì)

用Maga 7.0對(duì)NCBI上登錄的多個(gè)PRV毒株gE基因序列（KJ789182.1、MN240565.1、MK622299.1、MH507059.1、KU962917和KX170935.1）進(jìn)行比較，通過對(duì)比分析找到gE基因的保守區(qū)域，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)PRV gE基因長片段（562 bp）擴(kuò)增引物（P1/P2）用于構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；進(jìn)一步在該區(qū)域內(nèi)用Beacon Designer 8設(shè)計(jì)用于檢測(cè)方法建立的特異性引物（P3/P4）及探針（表2）。上述引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 PRV擴(kuò)增引物

1.4 核酸提取

將病毒液和菌液各取200 μL，按照TIA Namp Virus DNA/RNA kit和TIANamp Bacteria DNA kit的操作指南，對(duì)包括PRV SC-5株（Vero細(xì)胞毒）在內(nèi)的所有毒株菌核酸進(jìn)行提取，并將抽取的樣品放置在-80 ℃下保存。

1.5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

分別對(duì)PRV SC-5株核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為50 μL，Premix Ex TaqTM25 μL、上下游引物（P1/P2）均為1 μL、模板2 μL，dd水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，（94 ℃ 30 s，57 ℃30 s，72 ℃ 35 s）循環(huán)30次，72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

根據(jù)Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0試劑盒說明書對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化，然后根據(jù)pMD19-T載體說明書進(jìn)行產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將重組菌涂布接種于含有Amp的LB平板，取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，將其命名為：pGEM-T-PRV。利用NanoDrop 2000測(cè)定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度并根據(jù)公式拷貝數(shù)（copies/μL）=6.02×1023（copies/mol）×濃度（ng/μL）/MW（g/mol），MW為平均分子量，計(jì)算核酸標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。

1.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化

以步驟1.5中所獲得的度為104copies/μL的pGEM-T-PRV標(biāo)準(zhǔn)品為模板，按照單一變量原則，進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化。在反應(yīng)體系中加入引物P3/P4，使其終濃度分別為0.2、0.4、0.6、1 μmoL/L；加入探針使其終濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.5 μmoL/L，根據(jù)擴(kuò)增曲線和熒光強(qiáng)度值進(jìn)行引物和探針濃度的優(yōu)化。采用最佳引物和探針濃度，在退火溫度分別為56、58、60、62 ℃下進(jìn)行反應(yīng)，最終確定最優(yōu)體系和條件。

1.7 反應(yīng)條件的優(yōu)化

將pGEM-T-PRV標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行101～107倍的稀釋，并分別作為模板進(jìn)行TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)，分別以各稀釋度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的Log值和CT值作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的X軸和Y軸以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性關(guān)系。

1.8 特異性試驗(yàn)

分別用PRV Bartha-k61株、PEDV、TGEV、PoRV、PPV、PDCoV、S.suis、E.coli、P.multocida、S.choleraesuis和S.aureus等菌毒株核酸作為模板，以無菌水為空白對(duì)照，進(jìn)行TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)評(píng)估檢測(cè)方法的特異性。

1.9 敏感性試驗(yàn)

將已知濃度的pGEM-T-PRV標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋，以各稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品混合液為模板，按照最佳反應(yīng)條件進(jìn)行一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR反應(yīng)，以評(píng)價(jià)該方法的靈敏性。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn)

以步驟1.9中稀釋至103、105和107拷貝數(shù)的pGEM-T-PRV為模版，進(jìn)行3次TaqMan熒光定量RT-PCR反應(yīng)，每次試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，以評(píng)價(jià)該方法組內(nèi)和組間的重復(fù)性，并將試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.11 與商品化檢測(cè)試劑盒比較檢測(cè)符合率

用本研究建立的方法與PRV實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較。同時(shí)檢測(cè)50份已知PRV野毒感染陽性樣本和40份PRV陰性進(jìn)行檢測(cè)，通過2×2列聯(lián)表法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算符合率和Kappa值，評(píng)價(jià)該方法檢測(cè)結(jié)果與商品化檢測(cè)試劑盒的一致性。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定

對(duì)pGEM-T-PRV重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的、大小約560 bp的目的條帶（圖1）。對(duì)重組質(zhì)粒的測(cè)序并經(jīng)Blast比對(duì)分析，結(jié)果與已登錄參考PRV毒株gE基因序列同源性為100%，表明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建成功。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

經(jīng)優(yōu)化結(jié)果表明，在PRV上下游引物濃度均為0.2 μmol/L，探針濃度為0.05 μmol/L、退火溫度為58 ℃時(shí)，擴(kuò)增曲線為S型光滑曲線，表明此為最佳反應(yīng)體系和條件（圖2）。

圖2 優(yōu)化后的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品濃度的Log值為X軸，以CT的值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。結(jié)果表明，該方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性關(guān)系表達(dá)式分別為：y=-3.481 8 x+36.699，R2=0.995 5。

圖3 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 TaqMan熒光定量PCR的特異性

用本試驗(yàn)建立的PRV（gE）熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)PRV疫苗株、PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV、PPV、S.suis、E.coli、P.multocida、S.choleraesuis和S.aureus進(jìn)行檢測(cè)，其CT值均≥38或無熒光信號(hào)，表明該方法具有良好的特異性。

2.5 TaqMan熒光定量PCR的檢測(cè)下限

將PRV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行1 0倍梯度稀釋（101～1011），然后進(jìn)行TaqMan熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示PRV最低檢測(cè)下限為3.92 copies/μL（圖4），表明該方法具有良好的敏感性。

圖4 熒光定量PCR法對(duì)10倍梯度稀釋質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果

2.6 重復(fù)性檢測(cè)

重復(fù)性評(píng)估結(jié)果表明，無論是組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)還是組間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)（CV）均≤2%，表明該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性良好（表3）。

表3 PRV的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

2.7 符合率比較

用商品化的PRV（gE）熒光定量檢測(cè)試劑盒與本研究構(gòu)建TaqMan熒光定量PCR同時(shí)對(duì)50份PRV已知陽性樣本核酸及40份已知陰性樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，兩種方法對(duì)所有樣本的檢測(cè)符合率為100% （k=1）。

3 討論

傳染病病原精準(zhǔn)快速診斷對(duì)疫病監(jiān)測(cè)預(yù)警和在早期防控過程中制定有針對(duì)性的政策措施具有重要意義。分子生物學(xué)診斷技術(shù)是實(shí)驗(yàn)室診斷中最常見和可靠的技術(shù)手段。其中PCR、熒光定量PCR和巢式PCR技術(shù)是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的非洲豬瘟、藍(lán)耳病、豬瘟、偽狂犬病等豬重大疫病病原檢測(cè)的常用技術(shù)[10]。而在所有的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)中，熒光定量PCR具有高效、特異、靈敏、可定量、高通量、操作簡(jiǎn)便和無污染等一系列優(yōu)點(diǎn)，在病原學(xué)檢測(cè)中得以廣泛應(yīng)用。尤其是特異性TaqMan探針在熒光定量PCR中的應(yīng)用，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度，適用于低拷貝數(shù)的臨床樣本檢測(cè)[11]。因此，本研究采用探針法熒光定量PCR技術(shù)建立針對(duì)PRV野毒株的快速檢測(cè)方法是其具有良好靈敏性和特異性前提和保證。此外，目前PRV基因結(jié)構(gòu)約有近95% 已被定位和測(cè)序。PRV基因組編碼近100種蛋白質(zhì)。其中編碼gE蛋白的基因是病毒復(fù)制的非必須毒力基因，其編碼的囊膜蛋白質(zhì)可促進(jìn)感染細(xì)胞和臨近感染細(xì)胞的膜融合，從而促進(jìn)病毒的擴(kuò)散，gE基因的缺失會(huì)導(dǎo)致病毒的嗜神經(jīng)性毒力降低[12]。當(dāng)前對(duì)PRV基因缺失疫苗的研究中，多采用確實(shí)gE、TK、gB等毒力基因的策略進(jìn)行缺失株的構(gòu)建。因此，對(duì)gE基因的檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)只針對(duì)PRV野毒株的檢測(cè)，而不對(duì)基因缺失疫苗株進(jìn)行檢出，可達(dá)到防止假陽性結(jié)果的目的。

本研究對(duì)PRV gE基因片段保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的引物和探針，對(duì)反應(yīng)體系和條件進(jìn)行了充分優(yōu)化，建立了一種檢測(cè)PRV野毒株的TaqMan熒光定量PCR方法。結(jié)果表明，在上下游引物濃度分別為0.2 μmol/L、探針濃度為0.05 μmol/L、退火溫度為58 ℃時(shí)擴(kuò)增效果最佳，該方法檢測(cè)下限可達(dá)到3.92 copies/μL，具有較高的敏感性。對(duì)包括PRV基因缺失疫苗在內(nèi)的11種豬病相關(guān)的細(xì)菌和病毒株均無非特異性擴(kuò)增，特異性良好。同時(shí)，該方法與商品化試劑盒同時(shí)檢測(cè)已知陽性和陰性樣本，結(jié)果符合率為100%，表明該方法檢測(cè)結(jié)果可靠，可以初步用于臨床樣本的檢測(cè)。本研究建立的PRV TaqMan熒光定量PCR方法可以為豬偽狂犬病的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供可供選擇的工具。