張剛，劉丹丹，蔡純，李瀟，曾慧儀，婁蕾，閆憲剛，俞鋼

1廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院小兒外科，廣州510150；2廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院超聲醫(yī)學科

先天性肺氣道畸形（CPAM）在先天性呼吸系統(tǒng)畸形中最常見，占比30%～40%，患病率占出生活胎的1/35 000～1/7 200［1］，近年來呈明顯上升態(tài)勢，這與CPAM產前診斷技術的進步有一定關系［2］。當前，多數(shù)患兒可在孕18～22周時通過產前超聲篩查被發(fā)現(xiàn)，敏感度達94%，特異度達95.3%［2］。CPAM的發(fā)病機制目前尚不明確，可能是由于胚胎發(fā)育過程中肺部上皮細胞與下層間充質細胞之間的信號傳導障礙，導致病變中缺乏正常的肺泡，進而形成以終末細支氣管過度增生與擴張為特征的錯構瘤樣病變。研究［2-4］顯示，肺胚胎發(fā)育涉及多種生長因子、轉錄因子和信號分子在上皮—間充質的相互作用，以及信號調控分子在肺上皮細胞和間充質細胞之間的相互作用。當前，二代測序技術所得數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，價格相對低廉，已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領域。此技術可快速獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有轉錄本的序列信息，進行疾病與正常樣本間的基因表達差異分析、可變剪切和融合基因分析，進而尋找致病基因、探索發(fā)病機制。相對于傳統(tǒng)基因芯片而言，二代測序技術無需預先設計特異性探針，具有檢測范圍廣、準確率及分辨率高等優(yōu)點［5］。本研究利用二代測序技術結合生物信息學分析，篩選了CPAM患兒病變組織中的差異表達基因，并對差異表達基因進行生物信息學分析，為深入研究CPAM的發(fā)病機制提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院小兒外科2020年1—3月收治的CPAM患兒5例。納入標準：①產前檢查、術前CT檢查、術中診斷、術后病理檢查均確定為1型CPAM；②患兒年齡0.5～1歲，病灶直徑5～10 cm，無胎兒水腫、術前無感染、未接受化療和放射治療、無合并明確的染色體畸形等情況；③患兒接受胸腔鏡微創(chuàng)手術治療，術后未留置胸管，無感染、出血、再手術等，隨診1年未見存留、復發(fā)、再發(fā)、繼發(fā)感染、氣胸等；④患兒監(jiān)護人均簽署知情同意書并支持本研究。5例患兒術中分別留取CPAM病變組織、CPAM病變旁組織（直徑5 mm）各1份，共計10個樣本，分別標記為1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、5b，樣本置于液氮中冷凍后迅速轉移至-80℃冰箱中保存。

1.2 CPAM患兒病變組織中差異表達基因的篩選

1.2.1 受檢樣本RNA-Seq文庫的構建 采用TRIzol法對樣本總RNA進行抽提，抽提所得的總RNA取樣分別進行濃度、28S/18S或23S/16S、RIN值質檢，質檢合格后，使用Total RNA-seq（H/M/R）Library Prep Kit for Illumina?構建文庫：先將設計好的DNA探針與RNA樣品進行雜交，從而將rRNA從總RNA中去除；隨后將RNA進行片段化，合成cDNA第一鏈，采用鏈特異的方法，在第二鏈cDNA合成時摻入dUTP對其進行標記，同時在此步完成末端修復；接著進行加A-尾、連接接頭、連接產物純化和片段大小分選、文庫擴增等步驟，在PCR擴增前用UDG酶消化帶dUTP的第二鏈模板，PCR擴增結束后用磁珠純化回收，即得RNA-Seq文庫。

1.2.2 RNA-Seq文庫質量評估 文庫構建完成后，先使用Qubit 3.0進行初步定量，隨后使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫進行檢測，插入的目的片段大小符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度>3 nM），以保證文庫質量［5］。

1.2.3 RNA-Seq文庫的測序 文庫質量評估合格后，將不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求測序（測序平臺：Novaseq 6000 PE150，美國Illumina?公司），測序數(shù)據(jù)量為10 G：對原始序列進行過濾，去除接頭序列、含N較多的序列及低質量的序列，獲得待分析序列，用Fast QC軟件對其進行質量評估［6］。通過與核糖體數(shù)據(jù)庫進行比對，去除核糖體RNA序列，用RSEM軟件［7］獲得基因的表達序列數(shù)。只有表達豐度足夠高的基因才是具有生物學意義的差異表達基因，反應真實的生物學現(xiàn)象，因此，需要對基因的表達進行了過濾。過濾標準為：基因的表達值（CPM值）至少在一半樣本中都大于1才被保留。然后，使用M-值的加權截尾均值法（TMM）對不同樣本每個基因的表達進行標準化，獲得有效序列。

1.2.4 異常樣本剔除 利用主成分分析來考察樣品中是否存在異常樣品：通常組內的樣本會聚類在一起，組間的樣本會分隔開，異常樣本則會和本組內樣本分隔開。選擇兩個主成分因子：分別從序列差異性最大PC1（63.6%）和次大PC2（13.4%）兩個方向提取，制作主成分分析圖。如果檢測到異常樣本，在差異分析時，該樣本應該被排除在外。

1.2.5 CPAM病變組織與CPAM病變旁組織差異表達基因的提取與篩選 剔除異常表達的樣本后，使用edgeR軟件將有效序列與參考基因組進行比對、序列預測、表達值計算，設置差異倍數(shù)foldchange=1.5、P<0.05、FDR<1，篩選出CPAM病變組織與CPAM病變旁組織的差異表達基因［8］。1.3 差異表達基因的基因本體（GO）功能富集分析和KEGG信號通路分析 使用R軟件cluster Profiler對差異表達基因進行分析［9］：通過計算差異表達基因與GO集合的交集獲得統(tǒng)計學顯著性（超幾何檢驗，P=0.05）來判斷目標基因集合是否能發(fā)揮某種功能，包括差異表達基因參與的生物學過程、細胞組成以及分子功能三個層面，取P<0.05且P值最顯著的前10個結果。利用cluster Profiler在線網站對篩選的差異基因注釋到最新的KEGG信號通路進行分析，按照P<0.05篩選出排名前10的信號通路。

2 結果

成功構建10個樣本的RNA-Seq文庫，文庫質量合格，各樣本序列數(shù)見表1。

表1 各樣本序列數(shù)（個）

2.1 CPAM病變組織與CPAM病變旁組織差異表達基因的篩選結果 依據(jù)主成分分析結果，剔除異常表達的樣本3b后，共篩選出CPAM病變組織與CPAM病變旁組織差異表達基因1 063個，其中上調的基因860個、下調的基因203個。上調的基因包括FOXJ1、Sox2、BMP8A、BMPR1B、DNAAF4、LRP2、MNS1、WT1、CRISP3、SCGB1A1、FCGBP、MSMB、SLC5A5、SPINK1、KRT17、CLCA2、UPK1B、UGT1A6、VTCN1、B3GNT3、ERN2、CCNO、KRT15、CXCL13、SPATS1、KRT5、MUC4、RHOV、RPL13AP17、MUC16、CYP2F1、SRD5A2、TMEM130、KLK13、PLEKHS1、EPN3、CDC20B、C1orf141、CCL11、RUNDC3B、SPP1、SPATA4、FUT2、TCP11X2、ANKRD66、CRISP2、CP、C12orf74、PROM1、PRR18等，下調的基因包括BMP6、BMPR2、BMPER、HBA1、Smad6、Smad7、LPL、CD52、TNFSF10、CD109、NAGS、NRG3、RAMP2、GPER1、FPR2、GBP1、C1QTNF5、WNT2B、CORO6、MFAP3L、BMPR2、EHD3、RSAD2、CRMP1、LILRA1、BMPER、MASP1、SEMA6A、DSC2、SLC16A6、ACSS3、ADAMTS7、CHRD、ZNF331、WNT2、EXOC3L1、GRIA1、ACVRL1、SMAD7、AATBC、TAL1、LOC400685、CCDC68、ABCA3、COL4A2、B3GNT8、MS4A14、DPEP2、LIN7A、GBP4、ITGA1等。

2.2 差異表達基因的GO功能富集分析和KEGG信號通路分析結果 GO功能富集分析結果顯示，差異表達基因的細胞組成主要位于軸絲、纖毛質、活動纖毛、微管、微管相關復合物、細胞頂端部分、含膠原的細胞外基質、神經元細胞體、纖毛基體等，參與的分子功能主要有微管蛋白結合功能、受體配體活性、信號受體激活劑活性、內肽酶活性、ATP酶活性、肌動活性、微管結合功能、G蛋白耦聯(lián)受體結合功能、微管運動活性、絲氨酸型肽酶活性等，涉及的生物學過程主要有纖毛組織、纖毛組裝、基于微管的運動、纖毛運動、微管束形成、多細胞機體穩(wěn)態(tài)、纖毛或鞭毛依賴性細胞運動、纖毛依賴性細胞運動、軸絲組裝、鞭毛運動等。KEGG信號通路分析結果顯示，差異表達基因參與了PI3K-Akt信號通路、血管平滑肌收縮、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、神經活性配體—受體相互作用、細胞因子—受體相互作用、亨廷頓病、轉錄失調、黏著斑、ECM-受體相互作用、病毒蛋白與細胞因子—受體相互作用、蛋白質消化吸收等信號通路的調控。

3 討論

CPAM根據(jù)病理表現(xiàn)分為5型：0型表現(xiàn)為先天性肺泡發(fā)育不良，實性外觀，肺縮小變硬，占1%～3%；1型由1個以上囊腫組成，壁厚，囊腫直徑2～10 cm，占60%～70%；2型多個小囊組成，囊腫直徑0.5～2 cm，占10%～15%；3型由蜂窩狀微囊組成，囊腫直徑<0.5 cm，約占5%；4型多為單個或分隔大囊，囊腫直徑>10 cm，約占28%。本研究為保證樣本量充足、研究結果的普惠性，選取發(fā)病率最高的1型CPAM樣本為研究對象。

CPAM的病因尚無統(tǒng)一認識，當前主要有2種假說［10］。其一為支氣管梗阻假說：STOCKER等［11］于1977年提出，MOERMAN等［12］所做的尸檢為該假說提供了解剖證據(jù)，認為支氣管功能性或器質性阻塞導致了肺發(fā)育過程中細胞增生和凋亡異常。其二為環(huán)境假說：基因缺陷或微環(huán)境變化導致調控因子異常表達而致使肺發(fā)育異常。肺發(fā)育的5個組織學階段中，內胚層上皮細胞和間充質細胞的分子表達及信號通路起到關鍵作用［13］，例如前腸腹側上皮細胞的甲狀腺轉錄因子（TTF1）的編碼基因Nkx2-1、前腸背側的性別決定區(qū)基因Y-box2、Sox2、Hoxb-5等；而BMPs和它的拮抗因子Noggin、FGF10、Wnt等則在間充質細胞內起作用［1］。當上皮細胞與間充質細胞之間的信號傳導異常時，則導致肺實質內肺泡形成障礙，終末細支氣管過度增生、擴張，形成單房、多房或蜂窩狀錯構瘤樣的CPAM［1］。

本研究中，我們利用二代測序技術順利得到了10個樣本序列，質量均合格，順利構建RNA-Seq文庫。在做樣本主成分分析時，發(fā)現(xiàn)樣本3b和其他組內樣品分隔開，為了順利進行差異分析，該樣品被排除在外。本研究共篩選出860個上調的基因和203個下調的基因，可見CPAM的發(fā)生與多個基因的上調和下調有關［1，13-15］。為明確上述差異表達基因集合的功能，我們采用R軟件cluster Profiler與GO集合進行功能富集分析［9］，包括分子功能、生物學過程和細胞組分三個部分?；蚧虻鞍踪|可以通過ID對應或者序列注釋的方法找到與之對應的GO號，而GO號可對應到隊列ID，即功能類別或者細胞定位。在GO功能富集分析結果中發(fā)現(xiàn)，細胞組分主要有軸絲、纖毛、微管、細胞頂端部分等，分子功能主要有微管蛋白結合、受體配體活性、信號受體激活、ATP酶活性、肌動活性、微管結合功能、G蛋白耦聯(lián)受體結合、微管運動活性等，生物過程主要有纖毛組織、纖毛組裝、軸絲組裝、微管束形成、纖毛及鞭毛運動等。KEGG信號通路分析結果顯示，差異表達基因參與介導了PI3K-Akt信號通路、血管平滑肌收縮、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、神經活性配體-受體相互作用、細胞因子-受體相互作用、亨廷頓病、轉錄失調、黏著斑、ECM-受體相互作用、病毒蛋白與細胞因子-受體相互作用、蛋白質消化吸收等多條信號通路，均涉及肺發(fā)育過程中的細胞增殖、遷移以及凋亡。通過GO功能富集分析和KEGG信號通路分析可預測CPAM的病理生理過程與纖毛及初級纖毛的形成、退化有關。

本研究基于二代高通量測序技術構建了穩(wěn)定可靠的CPAM患兒RNA-Seq文庫，篩選出差異表達基因1 063個：上調的基因860個，下調的基因203個。通過GO功能富集發(fā)現(xiàn)差異表達基因與纖毛形成、退化有關，KEGG信號通路分析提示差異表達基因參與了多個肺發(fā)育過程相關的信號通路。通過上述方法，初步明確各個基因的功能類別及細胞定位，預測了CPAM可能的發(fā)病機制?？梢姡镄畔W分析為研究CPAM轉錄調控網絡及篩選分子生物學標志物提供了有效手段［21］。

（收稿日期：2021-06-23）