吳 積，靳 楨，謝 浩，王彬彬，覃 健，劉 軍

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院骨科，南京 211100

2.南京醫(yī)科大學(xué)研究生院，南京 211166

3.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，南京 211100

硬膜外瘢痕形成是椎板切除術(shù)的常見并發(fā)癥，易引起術(shù)后復(fù)發(fā)性疼痛，如何預(yù)防或減少椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕形成是目前骨科研究的熱點之一［1-2］。NLRC5是高度保守的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（NLR）家族成員之一，有研究［3-6］表明其參與肝纖維化、皮膚纖維化等的發(fā)展過程，可能是治療瘢痕形成的一個理想靶點。本研究初步探討NLRC5在大鼠硬膜外瘢痕形成的表達與作用，為預(yù)防或減少椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕形成提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只雄性SD大鼠（3月齡，體質(zhì)量約400 g）購自南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)在無特定病原體（SPF）環(huán)境中。在實驗過程中，控制溫度（22±2）℃、光照（早上7點至晚上7點）及相對濕度為（50±5）%。所有實驗程序均在南京醫(yī)科大學(xué)動物保護與使用機構(gòu)委員會（IACUC）的批準(zhǔn)和監(jiān)督下進行。

1.2 動物模型制備

實驗大鼠正常飲水進食，隨機分為手術(shù)組（n=30）和假手術(shù)組（n=30），適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照每400 g體質(zhì)量注射1.0 mL 2%戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，俯臥位固定。在L1棘突水平做后正中切口，剝離兩側(cè)豎脊肌，顯露L1~3椎板。手術(shù)組切除L1~2全椎板，暴露硬膜，徹底止血；假手術(shù)組不做任何特殊處理。之后將切口層層縫合。術(shù)后大鼠單獨分籠飼養(yǎng)，允許正?；顒印?/p>

1.3 硬膜外瘢痕纖維化評估

術(shù)后4周，每組隨機選取6只大鼠進行肉眼觀察。重新開放手術(shù)切口，根據(jù)Rydell標(biāo)準(zhǔn)［7］評估硬膜外瘢痕纖維化程度：0級，瘢痕組織少，不粘連硬膜；1級，瘢痕組織輕度粘連硬膜；2級，瘢痕組織緊密粘連硬膜，難以分離；3級，瘢痕組織牢固粘連硬膜，不能解剖。

1.4 Masson染色

術(shù)后4周，每組隨機選取6只大鼠，處死后取硬膜外組織標(biāo)本，將標(biāo)本于10%中性甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片后作Masson染色，置于光鏡下觀察硬膜外組織病理學(xué)變化。

1.5 實時熒光定量PCR法檢測mRNA表達水平

術(shù)后4周，每組隨機選取6只大鼠，處死后取硬膜外組織標(biāo)本，采用TRIzol試劑（賽默飛世爾科技公司，中國）提取組織總RNA，取2 μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（愛必夢生物科技有限公司，中國）說明進行操作。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，進行實時熒光定量PCR檢測。引物序列：β-actin上游引物5′-CCCATCTGAGGGTTACGC-3′，下游 引 物5′-TTTAATGTCACGACGATTTC-3′；NLRC5上游引物5'-CGCTCTGTGGCCACTTTCAG-3′，下游引 物5′-TGCCCGCTGTGAGACTTCAT-3′；α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）上游引物5′-GAGCGTGGCTATT CCTTCGTG-3′，下游引物5′-CAGTGGCCATCTCATTT TCAAAGT-3′；結(jié)締組織生長因子（CTGF）上游引物5′-GGCAGGGCCAACCACTGTGC-3′，下游引物5′-CA GTGCACTTGCCTGGATGG-3′；Ⅰ型膠原（COLⅠ）上游引物5′-TACAGCACGCTTGTGGAGATG-3′，下游引物5′-TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC-3′。PCR引 物 由 南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析NLRC5、α-SMA、CTGF、COLⅠ的mRNA表達量。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達水平

術(shù)后4周，每組隨機選取6只大鼠，處死后取硬膜外組織標(biāo)本，用RIPA裂解緩沖液提取硬膜外組織總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，計算上樣量，配制分離膠與濃縮膠進行電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，經(jīng)PBS洗滌后加入β-actin抗體（8H10D10，CST，美國）、NLRC5抗體（sc-515668，Santa Cruz Biotechnology，美國）、α-SMA抗體（ab32575，Abcam，英國）和CTGF抗體（ab6992，Abcam，美國），工作濃度均為1∶1 000，于4℃孵育過夜。取出后用TBST洗滌，加入相應(yīng)二抗（工作濃度1∶10 000），搖床孵育1 h，TBST洗滌。用化學(xué)發(fā)光法進行曝光并拍照保存，采用Image J軟件對條帶的灰度值進行分析，以β-actin為內(nèi)參照計算目的蛋白的相對表達量。

1.7 ELISA檢測COLⅠ含量

術(shù)后4周，每組隨機選取6只大鼠，處死后取硬膜外組織標(biāo)本，勻漿后取上清液，嚴(yán)格按照COLⅠ ELISA試劑盒（北京龍?zhí)炜萍加邢薰荆袊┦褂谜f明書檢測上清液中COLⅠ含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠模型建立和大體觀評價

動物模型建立4周后，假手術(shù)組大鼠未發(fā)現(xiàn)瘢痕組織，Rydell瘢痕纖維化評估均為0級；手術(shù)組硬膜外瘢痕組織增生，Rydell瘢痕纖維化評估1級2只、2級4只（圖1）。

圖1 大鼠腰椎椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕Fig. 1 Epidural scar formation after lumbar laminectomy in rats

2.2 大鼠硬膜外組織Masson染色

Masson染色顯示，假手術(shù)組大鼠硬膜外組織結(jié)構(gòu)完整，界限清晰，無異常纖維增生；手術(shù)組大鼠硬膜外組織結(jié)構(gòu)破壞，可見大量纖維細胞（圖2）。

圖2 2組大鼠硬膜外組織Masson染色（×400）Fig. 2 Masson staining of epidural tissues in 2 groups of rats（×400）

2.3 NLRC5在大鼠硬膜外組織中的表達

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，手術(shù)組大鼠硬膜外組織NLRC5、CTGF、α-SMA和COLⅠ的mRNA表達水平均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，手術(shù)組大鼠硬膜外組織NLRC5、CTGF、α-SMA的蛋白表達水平均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。ELISA法檢測結(jié)果顯示，手術(shù)組大鼠硬膜外組織中COLⅠ含量高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。

圖3 實時熒光定量PCR檢測2組大鼠硬膜外組織中 NLRC5、CTGF、α-SMA 和 COLⅠ的mRNA的表達Fig. 3 Expressions of NLRC5，CTGF，α-SMA and COLⅠ mRNA of epidural tissues in 2 groups of rats detected by real-time quantitative PCR

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測2組大鼠硬膜外組織中 NLRC5、CTGF、α-SMA的蛋白表達Fig. 4 Expressions of NLRC5，CTGF and α-SMA protein of epidural tissues in 2 groups of rats detected by Western blotting

圖5 ELISA法檢測2組大鼠硬膜外組織中COLⅠ的含量Fig. 5 Content of COLⅠ of epidural tissues in 2 groups of rats detected by ELISA

3 討 論

椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕形成具體的發(fā)生機制尚不明確，與血腫形成、炎性細胞因子積累、成纖維細胞增殖和膠原合成等多種因素加速手術(shù)創(chuàng)傷后硬膜外手術(shù)區(qū)纖維粘連的形成有關(guān)。椎板切除術(shù)后，硬膜外組織在各種免疫細胞因子刺激下，成纖維細胞趨向于廣泛增殖，產(chǎn)生膠原，釋放細胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致硬膜外瘢痕粘連的形成［8-9］。除了通過改進術(shù)式減少損傷外，目前應(yīng)用于術(shù)后瘢痕防治的方法主要包括藥物防治和人工材料防治，例如五味子提取物［1］、絲裂霉素C［10-11］、新型防粘膜E8004［12］、生物蛋白膠［13］等。多數(shù)藥物作用時間較短，長期使用副作用大，而人工材料在體內(nèi)作為異物遠期療效欠佳，都有一定的局限性，國內(nèi)外學(xué)者仍在探索更好的高分子材料及藥物來防治硬膜外瘢痕形成［14］。目前，抑制參與膠原蛋白過度合成和細胞增殖因素是治療硬膜外瘢痕粘連的一種策略。

近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)NLRC5可能是治療瘢痕的新靶點，沉默NLRC5可通過抑制TGF-β1/Smad信號通路減少細胞外基質(zhì)過度表達，抑制瘢痕形成的表型和標(biāo)志物 CTGF、α-SMA和COLⅠ的表達［6］。NLR是一組細胞內(nèi)蛋白，介導(dǎo)對病原體相關(guān)分子模式或其他胞質(zhì)危險信號的識別［15-17］。NLRC5是高度保守的NLR家族成員之一，主要在骨髓和淋巴譜系細胞中表達，能夠有效抑制機體的天然免疫和炎性反應(yīng)［18］。有研究［19］發(fā)現(xiàn)，NLRC5在人纖維化肝臟組織及CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化組織中表達量均升高，而抑制NLRC5的表達可明顯抑制肝星狀細胞的活化增殖，提示NLRC5可能與肝纖維化形成有關(guān)。

目前NLRC5在硬膜外瘢痕組織的表達及作用尚不清楚。本研究結(jié)果表明，大鼠椎板切除術(shù)后4周發(fā)生了明顯的硬膜外瘢痕形成，且手術(shù)組NLRC5、CTGF、α-SMA和COLⅠ的mRNA表達較假手術(shù)組增高，NLRC5、CTGF和α-SMA的蛋白表達和COLⅠ含量也較假手術(shù)組增高，提示NLRC5可能參與椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕形成的過程，但具體的分子機制仍有待于后期研究進一步闡明。本研究為研究預(yù)防硬膜外瘢痕形成的治療靶點提供了新的思路。