李 旭 付立東 王 宇 隋 鑫 任 海 呂小紅 馬 暢 杜 萌 毛 艇

（遼寧省鹽堿地利用研究所，124010，遼寧盤錦）

氮素是水稻生長發(fā)育的必需元素，適量施氮可以提高產(chǎn)量，而過量施氮不僅造成氮素浪費，還會增加植株倒伏和病蟲害發(fā)生的風(fēng)險[1-3]。已有研究[4-5]表明，我國水稻生產(chǎn)的氮肥利用效率在25%～35%之間，較國際平均水平低 5%～10%。因此，提高氮素利用效率成為水稻遺傳改良的重點攻關(guān)方向。

培育氮高效水稻品種是提升氮素利用的有效途徑[6-7]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，AMT、GOGAT、GS、NR、NRT、DEP1、NRT1.1B等參與水稻氮代謝調(diào)控的基因被成功克隆[8-12]，為進一步標記輔助育種工作提供了堅實基礎(chǔ)。其中，DEP1及NRT1.1B基因被證實具有較大的應(yīng)用價值[13-14]。Hu等[13]利用秈粳稻雜交后代群體，成功克隆了氮素吸收與利用的關(guān)鍵基因NRT1.1B，該基因在秈、粳亞種間存在1個堿基變化，導(dǎo)致了相應(yīng)氨基酸的變化，使得秈亞種氮素利用效率高于粳亞種。相比于NRT1.1B基因，DEP1是一個同時影響植株形態(tài)、稻谷粒型及氮素利用的多效基因，Huang等[15]、Yan等[16]和Zhou等[17]相繼于第9條染色體上克隆了該基因，命名為DEP1、EP1或qPE9-1。Sun等[14]研究表明，直立穗等位基因dep1使得水稻營養(yǎng)生長對氮素的響應(yīng)變得遲鈍，因此可以同化更多的氮素，從而提高氮素利用效率。

由于通風(fēng)透光好和易于密植的群體特征，直立穗等位基因dep1被廣泛應(yīng)用于我國的超高產(chǎn)水稻育種[18-19]。因此，深入解析dep1與NRT1.1B基因的遺傳互作對水稻氮素利用的影響，對培育氮高效水稻品種具有重要指導(dǎo)意義。本文以攜帶不同DEP1與NRT1.1B基因型組合的重組自交系為供試材料，在低、中及高氮條件下，分析了DEP1與NRT1.1B基因的遺傳互作對水稻氮素利用、產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響，并探討了氮高效水稻品種培育的有效途徑，為氮高效利用分子設(shè)計育種提供優(yōu)異種質(zhì)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與種植方法

供試材料為粳稻品種鹽豐47（YF47）與秈稻品種黃花占（HHZ）雜交構(gòu)建的142個F10代重組自交系（RIL）群體。試驗于2020年在遼寧省鹽堿地利用研究所試驗田（遼寧盤錦，41.07°N，122.03°E）進行。設(shè)置低、中及高 3個氮肥處理，分別記為LN、MN和HN，對應(yīng)的氮肥施入量分別為100、200和300kg/hm2，均按照底肥:分蘗肥:穗肥=5:3:2施用，P2O5（90kg/hm2）和K2O（60kg/hm2）均作底肥一次性施入。隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，小區(qū)面積20m2，行距30cm，株距13.3cm。

1.2 DEP1與NRT1.1B的基因型鑒定

以重組自交系親本及后代為DNA模板，利用基因DEP1-1及1nrt/1NRT的分子標記進行鑒定[20-21]，引物詳細信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.3 指標測定及方法

1.3.1 莖鞘及籽粒中氮素含量、積累量及氮素收獲指數(shù) 參考趙明珠[22]的方法，于黃熟期取長勢較一致的10株水稻，將莖鞘和籽粒分開，烘干至恒重，計算單株莖鞘和籽粒的生物量；并取0.6g樣品，通過全自動碳氮分析儀（Elementar，Vario MAX CN，德國）測定莖鞘及籽粒中氮素含量。利用公式氮素收獲指數(shù)=籽粒氮素積累量/（籽粒氮素積累量+莖鞘氮素積累量），計算氮素收獲指數(shù)。

1.3.2 氮代謝關(guān)鍵酶活性 于DEP1/NRT1.1B、DEP1/nrt1.1b、dep1/NRT1.1B及dep1/nrt1.1b4個基因型組合中分別選取 10個典型株系，于抽穗前用紅色馬克筆標記同一天開花的穎花100個，于齊穗后10d進行標記穎花胚乳取樣，參照趙明珠[22]的方法測定硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）及谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性。

1.3.3 產(chǎn)量及其構(gòu)成因素 于黃熟期對每個重復(fù)取長勢較一致的10株水稻，調(diào)查有效穗數(shù)、穗粒數(shù)及千粒重；黃熟期后收獲，取1m2測產(chǎn)，折算成14.5%含水量的產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Graph Pad Prism ver.5.0和Microsoft Office Excel 2007進行圖表繪制及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEP1與NRT1.1B基因在重組自交系群體中的分布

利用表1中的標記進行檢測，RIL中存在4種基因型組合，分別為DEP1/NRT1.1B、DEP1/nrt1.1b、dep1/NRT1.1B及dep1/nrt1.1b，對應(yīng)株系數(shù)分別為36、35、44及27（圖1）。鹽豐47攜帶高氮素利用等位基因dep1及低氮素等位基因NRT1.1B，黃花占攜帶低氮素利用等位基因DEP1及高氮素等位基因nrt1.1b。

圖1 RIL群體中DEP1與NRT1.1B不同基因型組合株系數(shù)Fig.1 Number of lines of different combinations of DEP1 and NRT1.1B genes in RILs

2.2 DEP1與NRT1.1B基因?qū)ηo鞘及籽粒中氮素含量的影響

由圖2a～c可得，LN水平下，dep1及nrt1.1b導(dǎo)入均可顯著增加莖鞘中氮素含量，同時聚合dep1及nrt1.1b基因型品系莖鞘中氮素含量最高；MN水平下，dep1基因型的導(dǎo)入可顯著增加莖鞘中氮素含量，而nrt1.1b基因型導(dǎo)入未顯著增加莖鞘中氮素含量；HN水平下，dep1及nrt1.1b對莖鞘中氮素含量影響均較小，4種基因型組合間差異均未達到顯著水平。由圖2d～f可得，LN和MN水平下，不同基因型組合間籽粒中氮素含量差異不顯著；HN水平下，dep1基因型的引入顯著提升了籽粒中氮素含量，而nrt1.1b對籽粒中氮素含量的影響未達到顯著水平。

圖2 RIL群體中不同DEP1與NRT1.1B基因組合對氮素含量的影響Fig.2 Effects of different combinations of DEP1 and NRT1.1B genes on N contents in RILs

2.3 DEP1與NRT1.1B基因?qū)Φ厥斋@指數(shù)的影響

由圖3可知，LN條件下，dep1及nrt1.1b對氮素收獲指數(shù)提高均有一定貢獻，但未達到顯著水平，2個基因型共同作用下，其氮素收獲指數(shù)顯著提高；MN和HN水平下，nrt1.1b基因?qū)Φ厥斋@指數(shù)的影響未達到顯著水平，而攜帶dep1基因型株系氮素收獲指數(shù)顯著提升，dep1/nrt1.1b組合的氮素收獲指數(shù)最高。

圖3 RIL群體中不同DEP1及NRT1.1B基因組合對氮素收獲指數(shù)的影響Fig.3 Effects of different combinations of DEP1 and NRT1.1B genes on nitrogen harvest indexes in RILs

2.4 DEP1與NRT1.1B基因?qū)Φx關(guān)鍵酶活性的影響

從4種基因型組合中各選取了10個株系進行硝酸還原酶及谷氨酰胺合成酶活性的比較。由圖4a可知，在LN條件下，nrt1.1b基因型有利于提高硝酸還原酶活性，dep1基因?qū)ο跛徇€原酶活性無顯著影響；而MN和HN條件下，4種基因型組合間硝酸還原酶活性無顯著差異。同樣條件下比較谷氨酰胺合成酶活性（圖4b），不同氮素水平下，dep1基因均有利于提高谷氨酰胺合成酶活性，而nrt1.1b基因?qū)劝滨０泛铣擅富钚詿o顯著影響。

圖4 RIL群體中不同DEP1與NRT1.1B基因組合對硝酸還原酶及谷氨酰胺合成酶活性的影響Fig.4 Effects of different combinations of DEP1 and NRT1.1B genes on NR and GS activities in RILs

2.5 DEP1與 NRT1.1B基因?qū)Ξa(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響

由表2可知，不同氮肥水平下，dep1基因引入均有利于單株有效穗數(shù)的增加，而NRT1.1B基因?qū)沃暧行霐?shù)未產(chǎn)生顯著影響；同樣dep1基因引入也顯著提升了穗粒數(shù)；NRT1.1B基因?qū)ηЯＶ責(zé)o顯著影響，而dep1基因引入則顯著降低了千粒重。攜帶dep1基因株系產(chǎn)量均值高于其他株系，而NRT1.1B基因未對產(chǎn)量產(chǎn)生顯著影響。

表2 RIL群體中不同DEP1及NRT1.1B基因組合對產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響Table 2 Effects of different combinations of DEP1 and NRT1.1B genes on yield and its components in RILs

3 討論

氮素利用效率在秈稻與粳稻間存在顯著差異，秈稻的氮素利用效率高于粳稻，其中，NRT1.1B是產(chǎn)生上述現(xiàn)象的關(guān)鍵基因[13]。秈粳稻雜交育種是我國水稻育種的重要方法之一[23-24]，而源于秈稻的高氮素利用率基因型nrt1.1b在粳稻中極少被檢測到[13]的原因值得深入分析。從本研究來看，LN條件下，nrt1.1b基因型提升氮素利用效率的作用更為顯著，且nrt1.1b基因型對產(chǎn)量的影響未達到顯著水平；因此，在目前連年施氮、土壤氮素含量較高的情況下，nrt1.1b基因型未體現(xiàn)出其高氮素利用的功能優(yōu)勢，導(dǎo)致在育種過程中未被特意選擇，因此較少在粳稻中被檢測到，這與Hu等[13]及趙明珠[22]的研究結(jié)果較為一致。

本文通過 RIL群體分析了不同氮素施入條件下，dep1及nrt1.1b基因在氮素利用效率提升方面的應(yīng)用價值。綜合分析，LN條件下，nrt1.1b基因的引入可顯著提升氮素利用效率，這源于其硝酸還原酶活性的提升，增加了硝態(tài)氮的利用效率；而MN和HN條件下，dep1提升氮素利用效率的作用更為顯著，谷氨酰胺合成酶活性的提升增強了其氮素轉(zhuǎn)運能力是其主要原因。dep1等位基因的應(yīng)用有利于進一步提升有效穗數(shù)和穗粒數(shù)，這也是該基因在粳稻高產(chǎn)育種被廣泛應(yīng)用的主要原因。

氮素利用是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多個基因位點的調(diào)控[22]，利用RIL群體開展研究，可能受到其他未知氮素利用基因的影響。因此，計劃構(gòu)建dep1及nrt1.1b不同組合的近等基因系，進一步明確上述基因在粳稻育種氮素利用效率提升中的應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

源于秈稻的高氮素利用率基因nrt1.1b在粳稻育種中具有一定的應(yīng)用價值。nrt1.1b基因在中、高氮水平下作用較小，但不同氮素條件下，dep1/nrt1.1b組合均具有最大的氮素收獲指數(shù)，在育種工作中可以利用dep1及nrt1.1b基因的加性效應(yīng)提高其氮素利用效率，較單一利用dep1基因更具優(yōu)勢；針對中、低產(chǎn)田，可以利用nrt1.1b基因提高氮素利用效率，從而減少氮肥施入。