宋 璟 岑慧芳,2 劉華玥 王 慧 張?zhí)N薇

（1中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，100193，北京；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，030801，山西晉中）

1 冷等離子體概述

在物理學(xué)中，等離子體是除固、液、氣體外的物質(zhì)第四態(tài)[1]，根據(jù)系統(tǒng)溫度可分為高溫等離子體和低溫等離子體。低溫等離子體又分為熱等離子體和冷等離子體，其中熱和冷表征的是粒子的熱力學(xué)平衡狀態(tài)。熱等離子體中的所有粒子溫度都很高，處于局部熱力學(xué)平衡狀態(tài)（LTE）。而冷等離子體中電子溫度相對較高，重粒子溫度相對較低，處于非局部熱力學(xué)平衡狀態(tài)（NLTE）[2]。冷等離子體主要由離子、電子、激發(fā)態(tài)的原子分子、自由基等活性粒子及可見光、紫外線等組成，各組分比例隨冷等離子體產(chǎn)生方式、放電電壓和氣源種類不同有所差異。冷等離子體可通過介質(zhì)阻擋放電、輝光放電、射頻放電和電暈放電等方式產(chǎn)生。由于冷等離子體可在不同壓強下產(chǎn)生，據(jù)此又將其分為非常壓（低氣壓/真空）冷等離子體和常壓冷等離子體[3]。清華大學(xué)團隊研發(fā)了一種廣泛用于生物誘變育種的新型大氣壓射頻輝光放電冷等離子體發(fā)生器，并將其產(chǎn)生的冷等離子體命名為常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）[4]。

2 冷等離子體在種子處理上的研究進展

冷等離子體在植物上的研究應(yīng)用主要集中在作物栽培領(lǐng)域。冷等離子體種子處理技術(shù)最早由俄羅斯科學(xué)家提出并在蔬菜種子上應(yīng)用，隨后各國科學(xué)家也陸續(xù)開展相關(guān)研究，但均未深入機理層面。截至目前，研究仍多集中于糧食作物、經(jīng)濟作物、飼料作物等種子播前處理，以及處理后種子萌發(fā)、植株生長及生理生化觀測層面。處理效應(yīng)與樣品種類、冷等離子體的激發(fā)方式、氣體源和處理時間等多個變量相關(guān)[1]。數(shù)分鐘內(nèi)的冷等離子體處理對植物起到更多的是激活作用，即在不改變基因序列的背景下誘導(dǎo)植物產(chǎn)生表觀遺傳變異。作用效應(yīng)主要體現(xiàn)在改善種子發(fā)芽率和生長勢等萌發(fā)特性，影響幼苗的生長狀態(tài)、成株的表型及生理生化指標，提高產(chǎn)量并改善作物品質(zhì)等[5]。而長時間的處理效果更傾向于物理誘變，造成基因?qū)用娴淖兓Ｓ捎诶涞入x子體源的多樣性和物理效應(yīng)的復(fù)雜性，對其具體效應(yīng)機理仍有待進一步深入研究。

2.1 非常壓冷等離子體對作物種子的處理效應(yīng)

較多研究都表明非常壓冷等離子體種子處理在種子萌發(fā)、作物生長及生產(chǎn)性能提升等方面具有正向作用。歸納后發(fā)現(xiàn)，較適合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的非常壓冷等離子放電方式主要為射頻放電、輝光放電和介質(zhì)阻擋放電 3種。射頻放電冷等離子體是通過高頻高壓電離氣體產(chǎn)生的，其放電能量高、范圍大[6]。輝光放電屬于低氣壓放電的一種，當粒子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，會以光的形式釋放能量。非常壓輝光放電冷等離子體會通過與種子表面發(fā)生互作，改變種子表面形態(tài)[7]，促進種子萌發(fā)及植株生長。而介質(zhì)阻擋放電則是通過擊穿放電電極間的工作氣體（絕緣介質(zhì)）達到產(chǎn)生冷等離子體的目的[6]。但不同放電方式對同種種子處理效應(yīng)的橫向比較還未見報道。

2.1.1 對種子萌發(fā)及幼苗生長的影響 有研究采用非常壓冷等離子體在糧食、蔬菜、油料及其他經(jīng)濟作物種子上進行了多年室內(nèi)和田間試驗，發(fā)現(xiàn)冷等離子體處理能增加小麥胚根和胚芽長度[8]；提高蔬菜種子出苗率、幼苗整體均一性和強壯度；促進春播大豆出苗等。張娜等[9]發(fā)現(xiàn)，真空氦氣介質(zhì)冷等離子體處理在促進小麥種子萌發(fā)和幼苗生長方面作用明顯，經(jīng)處理，小麥種子發(fā)芽率、成苗率、出苗整齊度顯著提高。用真空輝光放電冷等離子體處理大豆、油菜、花生和芝麻4種油料作物種子后，種子活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、幼苗莖長和根長顯著增加[10]。處理紫花苜蓿種子后，種子活力指數(shù)、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)明顯提高[11]。

冷等離子體還可以改善種子表面形態(tài)及濕潤性。Nalwa等[12]采用低壓輝光放電氧氣冷等離子體處理甜椒種子后，種子表面形態(tài)發(fā)生改變，播種后幼苗特性更優(yōu)。用低真空射頻冷等離子體處理小扁豆、菜豆和小麥種子后含氧官能團會富集到種子表面，顯著改善種子表面吸水性及濕潤性，提高種子發(fā)芽速度[13]。研究[8]還發(fā)現(xiàn)，冷等離子體源（真空射頻冷等離子體輝光放電）處理對恢復(fù)老化種子活力有一定的正向作用。老化種子初始發(fā)芽率相對越低，處理后種子活力提高幅度越大。且單、雙子葉作物老化種子對處理的敏感程度不同。

2.1.2 對作物生長及生理的影響 一定劑量的非常壓冷等離子體種子播前處理還會影響作物的生長、生理及產(chǎn)量。采用冷等離子體處理小麥種子，小麥的株高、分蘗數(shù)、穗粒數(shù)及籽粒產(chǎn)量顯著提高[8]。短時間內(nèi)隨處理時間延長，小麥光合相關(guān)色素含量增加，光合速率提高，淀粉和籽粒蛋白質(zhì)含量增加[14]。春播大豆種子經(jīng)處理后，株高、側(cè)根比和干重也均增加[8]。一定劑量的射頻真空冷等離子體處理松果菊種子后，植株葉片中維生素C、酚酸含量及自由基清除活性大幅提高[15]。冷等離子體處理對向日葵種子參與光合途徑或其調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)表達具有一定刺激作用，處理后種子赤霉素含量提高，蛋白質(zhì)出現(xiàn)差異性表達[16]。冷等離子體處理還能打破葡萄芽的休眠。將葡萄芽暴露于氦氣介質(zhì)阻擋放電冷等離子體中能打破其休眠，使芽裂更加均勻迅速，營養(yǎng)生長更加旺盛。對葡萄芽組織進行生化分析后發(fā)現(xiàn)，冷等離子體處理觸發(fā)了瞬時氧化應(yīng)激，進而提高了游離脯氨酸、丙二醛和過氧化氫含量，其中脯氨酸含量的提高可能是細胞結(jié)構(gòu)受自由基損害減少和打破葡萄芽休眠的主要原因[17]。

綜上，從非常壓冷等離子體對作物種子的處理效應(yīng)來看，該處理能改變種子表面的粗糙度及濕潤性，影響種子萌發(fā)、植株生理生化及生產(chǎn)性能。非常壓冷等離子體對種子產(chǎn)生的積極生物學(xué)作用：處理后種皮表面形成的活性氧自由基會改變種皮結(jié)構(gòu)，增加種皮親水性和通透性，使外部的水和氧迅速進入種子，促進萌發(fā)；同時，冷等離子體與細胞內(nèi)帶電離子互作后被吸收部分的電子振動并轉(zhuǎn)化為熱能，使種子內(nèi)生物大分子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，提高種子內(nèi)酶活性，改變種子萌發(fā)及生長時期的代謝水平[18]。

2.2 常壓冷等離子體對作物種子的處理效應(yīng)

2.2.1 對作物生長及生理的效應(yīng) 在種子處理中應(yīng)用較多的常壓冷等離子放電方式為大氣壓介質(zhì)阻擋放電（atmospheric pressure dielectric barrier discharge，APDBD）。對APDBD冷等離子體開展生物學(xué)效應(yīng)研究[19]發(fā)現(xiàn)，處理后細胞膜蛋白含量發(fā)生變化，細胞破裂，同時胞內(nèi)流出物會進一步被冷等離子體降解為小分子。APDBD處理后作物種子發(fā)芽率、植株生長及品質(zhì)均有不同程度的提高。此外，處理還促進了非健康種子生理機能的恢復(fù)，處理不同健康程度的大豆種子后，其發(fā)芽勢、生長勢和產(chǎn)量均有所提高[20]，故將該技術(shù)用于種子播前處理可能有助于減少化肥農(nóng)藥的使用。王敏等[21-22]采用自制的APDBD冷等離子體裝置對生菜和黃瓜種子進行處理，發(fā)現(xiàn)種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率以及幼苗株高、莖粗、品質(zhì)等指標得到提高。用大氣壓冷等離子體處理茄子種子后，植株表型指標與產(chǎn)量得到了提高[23]。常壓冷等離子體還能穿透番茄種子的莢膜，降低細胞膜的相對滲透率，提高番茄幼苗根系的活力和產(chǎn)量，影響植株的部分植物學(xué)特性[24]。處理后番茄單果重、果長、果粗也較對照有明顯提高[25]。但強度大、時間久的處理也會對種子萌發(fā)及生長發(fā)育產(chǎn)生副作用。研究[26]發(fā)現(xiàn)，1.6kV、1min內(nèi)的大氣壓氬氣冷等離子體處理能有效促進芥菜種子萌發(fā)，而2.2kV、2min內(nèi)的處理則表現(xiàn)出對芥菜種子萌發(fā)的抑制作用。

采用常壓冷等離子體短時間處理4d苗齡擬南芥幼苗后，其生長受到明顯促進，植株體內(nèi)活性氧、丙二醛、脯氨酸積累量提高，抗氧化酶表達水平提高，表明抗氧化防御系統(tǒng)在冷等離子體處理促進擬南芥幼苗生長過程中起作用[27]。隨常壓冷等離子體處理時間增加，豌豆幼苗期黃酮醇糖苷譜提高[28]。長春花種子受氬氣APDBD冷等離子體處理后，光合色素、可溶性酚和脯氨酸含量提高，同時次生代謝過程和生物堿合成相關(guān)基因DAT的表達受到影響[29-30]。

2.2.2 在作物抗逆境脅迫中的效應(yīng) 關(guān)于常壓冷等離子體種子處理技術(shù)在提高作物抗逆性方面也有一定研究。高濃度銅脅迫下，大氣壓輝光放電冷等離子體處理小麥種子后會促使幼苗將 Cu2+從根部轉(zhuǎn)運到地上部分，以減輕其對根部的毒害和對幼苗生長的抑制作用，同時提高根、苗的活力指數(shù)。但低濃度銅脅迫下，冷等離子體會促進根和苗對銅的吸收，不利于幼苗生長[31]。此外，常壓冷等離子體處理對降低鹽脅迫效應(yīng)、提高水稻的耐鹽性具有促進作用。常壓冷等離子體處理能提高鹽脅迫下水稻幼苗光合氣體交換和葉綠素熒光程度，提高光合色素含量、抗氧化酶及次生代謝酶活性，降低細胞中Na+積累，增加K+和Ca2+含量，使細胞膨壓得到恢復(fù)[32]。較低劑量的常壓冷等離子體處理會對穿心蓮種子蛋白質(zhì)積累、抗氧化酶類活性及其同工酶的表達起到促進作用，減輕逆境脅迫下過氧化物對細胞造成的損傷，提高其應(yīng)對非生物脅迫的能力[33]。

3 新型常壓非平衡放電等離子體（ARTP）處理技術(shù)

3.1 ARTP概述

由表1可知，不同冷等離子體有不同特點，相較于非常壓冷等離子體，常壓冷等離子體處理無需創(chuàng)造真空環(huán)境，產(chǎn)生的紫外線、強電場、帶電粒子等復(fù)雜效應(yīng)的可控性更強。而ARTP是綜合了已有常壓冷等離子體相關(guān)研究背景提出的一種較優(yōu)產(chǎn)生方式組合的常壓室溫冷等離子體源，它結(jié)合了常壓和射頻輝光放電的優(yōu)點，使高純度氦氣在高頻電場中放電，是在常壓狀態(tài)下產(chǎn)生的溫度在 25℃～40℃之間的一種高能冷等離子體[34]。

表1 不同類型冷等離子體性質(zhì)及處理效應(yīng)的比較Table 1 Generalization and comparison of properties and treatment effects of different cold plasma

不同于短時間非常壓冷等離子體和傳統(tǒng)常壓冷等離子體處理對生物體造成的表觀遺傳效應(yīng)，ARTP自產(chǎn)生以來，主要作為一種優(yōu)良的物理誘變劑應(yīng)用于微生物及植物誘變領(lǐng)域。其產(chǎn)生的活性粒子可透過細胞壁引起菌株或植物細胞膜通透性和蛋白結(jié)構(gòu)的改變，造成遺傳物質(zhì)的損傷等。同時細胞啟動 SOS修復(fù)機制產(chǎn)生種類豐富的錯配位點，進一步形成能穩(wěn)定遺傳的基因突變[42]。故ARTP具有基因損傷強度高、誘變速度快、突變范圍廣等優(yōu)點。其拓寬了冷等離子體的應(yīng)用領(lǐng)域，在生物誘變育種中具有較好的應(yīng)用前景。

3.2 ARTP技術(shù)在作物種子處理上的應(yīng)用

近年來，ARTP正逐步被應(yīng)用在原核、真核生物的誘變育種中，但已有研究大多都是圍繞微生物展開的。ARTP最早應(yīng)用于阿維菌素高產(chǎn)菌株的篩選[43]，此后逐漸在多種細菌和真菌選育中推廣。以促進細胞生長、增強各種次生代謝物產(chǎn)量、提高酶活性及增強微生物對極端條件耐受性為目的的微生物ARTP誘變已成功在生物酶、氨基酸和有機酸等藥物制備業(yè)、食品制造業(yè)和能源加工業(yè)中得到應(yīng)用[42]。

目前 ARTP應(yīng)用在植物上的研究處于起步階段，已有研究初步表明其會對植物種子萌發(fā)、生理生化和抗逆性等產(chǎn)生影響。ARTP處理玉米種子5～30min對出苗率無顯著影響，但隨處理時間延長，幼苗干重增加；處理30min后幼苗長度顯著增加[37]。對藥用植物懷牛膝和昆侖雪菊種子進行適宜劑量的ARTP處理，懷牛膝的種子發(fā)芽率、株高、最大冠幅、最大葉長、葉寬及產(chǎn)量有所提高，處理后昆侖雪菊種子的發(fā)芽勢和幼苗生物量也有所提高，且處理后兩者的次生代謝物含量也發(fā)生了變化，其中懷牛膝有效藥用成分β-蛻皮甾酮含量及昆侖雪菊花朵總黃酮、木犀草苷和綠原酸含量提高[38]，一定程度上表明ARTP技術(shù)具有選育高含量有效次生代謝物植株的應(yīng)用潛力。ARTP處理也有助于提高鹽脅迫下植物種子及幼苗的抗性。采用ARTP處理二月蘭種子，可緩解鹽脅迫對出苗率和根鮮重的脅迫作用，提高株高和地上部分鮮重，而未處理的對照出苗率、株高、地上和地下部分鮮重均降低[39]。有研究[40]還表明，ARTP處理通過提高多種氧化酶活性及可溶性蛋白含量、降低丙二醛含量及質(zhì)膜相對透性，促進NaCl脅迫下胡麻種子發(fā)芽和幼苗生長，但對不同品種胡麻的促進效應(yīng)存在差異。

ARTP的處理效應(yīng)受處理劑量的直接影響，一般通過控制處理時間、功率、氣流量、轉(zhuǎn)速及樣品距噴射口距離來調(diào)控[4]。ARTP處理在植物上的報道大多是通過控制處理時間造成處理效應(yīng)的差異。如黃忠興等[41]發(fā)現(xiàn)，不同 ARTP處理時間下的甘蔗胚性愈傷組織平均活愈率差異顯著。此外，不同植物、同種植物不同部位的最適誘變劑量也不同，通常隨誘變時間增加，處理效應(yīng)呈先正向后負向的趨勢。

4 展望

通過概述冷等離子體作物種子處理技術(shù)在國內(nèi)外的研究成果及應(yīng)用進展，發(fā)現(xiàn)已有研究大多圍繞栽培作物展開，所處理的植物樣品大多為種子。對處理效應(yīng)的研究集中在表型和生理層面，對機理的探究仍有待深入。這可能是由于冷等離子體源處理具有非定向性，產(chǎn)生的現(xiàn)象是多種效應(yīng)的綜合結(jié)果，其機理難以從某一或某些角度單獨闡述。此外，冷等離子體的產(chǎn)生方式、處理時間、設(shè)備及操作等具有不同的特點和傾向性，所處理的不同作物本身也存在特性差異，上述不同組合方式產(chǎn)生的效應(yīng)難以統(tǒng)一化、規(guī)律化。因此，在未來冷等離子體作物處理技術(shù)發(fā)展過程中，還需結(jié)合具體研究條件和實際需要進行較多的配套應(yīng)用技術(shù)研究，以期探索建立更加普適高效的冷等離子體處理體系。

相比而言，非常壓和常壓冷等離子體處理對作物種子萌發(fā)、生長及生理生化的整體效應(yīng)無明顯差異，但常壓冷等離子體處理無需創(chuàng)造真空環(huán)境及反復(fù)添加樣品，操作更為簡便，在實際應(yīng)用中更易推廣。ARTP作為常壓冷等離子體的一種，產(chǎn)生和作用條件更加溫和，且對細胞內(nèi)基因的損傷強度高于傳統(tǒng)物理化學(xué)誘變方法。ARTP的突變位點分布廣、類型多樣、豐度高，是一種更加簡單、高效、安全的新型冷等離子體處理技術(shù)，已經(jīng)在工業(yè)微生物育種中得到了廣泛應(yīng)用并取得良好效果，相信未來也會在植物育種和栽培上得到更多應(yīng)用。