宋璐憶，李佳輝，王 碩，郭嘉璐，鄧海潮，石 超

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌712100）

福氏志賀菌是一種棒狀、無(wú)莢膜、非運(yùn)動(dòng)、兼性厭氧的食源性致病菌，具有多種流行病學(xué)和病理學(xué)特征[1]。它是一類(lèi)具有高度危害性的微生物，人體感染試驗(yàn)表明，僅10 個(gè)福氏志賀菌即可引起成年人發(fā)病，食物和飲用水可以作為其傳播媒介[2]。它可以引起細(xì)菌性痢疾，感染的癥狀通常是腹部絞痛、腹瀉和發(fā)燒，有時(shí)伴隨其它癥狀，如嘔吐和頭痛[3]。它是在全球范圍引起腹瀉的主要原因，每年導(dǎo)致約8 000 萬(wàn)～1.65 億病例[4]。福氏志賀菌通?？蓮募词呈称分蟹蛛x，如蔬菜沙拉、冷切肉類(lèi)、熏魚(yú)、生牡蠣和海鮮等[5]，其往往會(huì)通過(guò)受污染的食物、個(gè)人、人群、學(xué)校和餐館快速傳播[6]。

傳統(tǒng)的食品殺菌技術(shù)雖然能保證食品微生物方面的安全，但是可能會(huì)影響食品的質(zhì)構(gòu)、色澤、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分等。如熱力殺菌可能會(huì)引起食品褐變、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)破壞、風(fēng)味變化等熱化學(xué)反應(yīng)[7]。物理殺菌通常對(duì)設(shè)備要求較高，投入成本較大。而化學(xué)合成防腐劑的過(guò)量使用往往具有致癌性、致畸性以及殘留毒性[8-9]。尋找高效、安全、天然的食品保鮮方法，抑制或清除食源性致病菌，延長(zhǎng)食品的貨架期，已成為食品工業(yè)的當(dāng)務(wù)之急。一些植物源抑菌物質(zhì)被證明具有良好的抑菌效果，且因具有綠色安全的優(yōu)點(diǎn)而備受研究者的關(guān)注[10]。

原兒茶醛（Protocatechuicaldehyde，PC，C7H6O3）是一種從活血化瘀中藥丹參、鼠尾草和四季青葉等中提取出的酚酸類(lèi)化合物，結(jié)構(gòu)式如圖1所示[11]。原兒茶醛具有抗菌消炎、增強(qiáng)冠狀動(dòng)脈血流量、降血脂、抑制血小板聚集和清除自由基等生物活性[12-14]。有研究表明，原兒茶醛對(duì)食源性致病菌阪崎克羅諾腸桿菌具有良好的抑制作用[15]，而對(duì)于植物病原菌青枯雷爾氏菌，原兒茶醛也表現(xiàn)出一定的抑菌活性，100 μg/mL 的原兒茶醛處理后，青枯雷爾氏菌菌體數(shù)量降低99.40%[16]。

圖1 原兒茶醛的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of protocatechualdehyde

原兒茶醛被證明對(duì)一些微生物具有抑制效果，然而，目前原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌的抑制作用及機(jī)理鮮有研究。本文探究原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌的最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）、最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）以及其對(duì)福氏志賀菌細(xì)胞形態(tài)、胞內(nèi)ATP、膜電位、蛋白合成和破壞及生長(zhǎng)曲線的影響，旨在探究原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

原兒茶醛（HPLC≥98%）購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司，本研究使用的福氏志賀菌ATCC 12022 購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection，ATCC）。該菌株混合于含有體積分?jǐn)?shù)25%甘油的LB 肉湯中置于-80 ℃保存。LB 瓊脂、LB 肉湯購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌蛋白提取試劑盒購(gòu)于上海貝博生物科技有限公司；試驗(yàn)所用其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-160B 細(xì)菌培養(yǎng)箱，上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；SmartSpecTMPlus 分光光度計(jì)，美國(guó)Bio-Rad 公司；微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，芬蘭Bioscreen 公司；S-4800 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本Hitachi 公司；SCIENTZ-IID 超聲波裂解儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；ChemiDoc MP蛋白凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；Victor X3多功能酶標(biāo)儀，珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化 將凍存于-80 ℃冰箱的福氏志賀菌ATCC 12022 菌株采用平板劃線法于LB 瓊脂培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)18 h，然后挑取單菌落于LB肉湯中，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h（130 r/min）。用磷酸鹽緩沖鹽溶液（Phosphate-buffered saline，PBS，pH 7.0）離心清洗菌株兩次（8 000×g、4 ℃、5 min），隨后用LB 肉湯調(diào)整菌懸液濃度使得菌懸液在600 nm 處的光密度（Optical density，OD）即OD600nm=0.5（約3×108CFU/mL），得到備用菌懸液。

1.3.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測(cè)定 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測(cè)定具體方法參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)采用的肉湯微量稀釋法[17]，具體方法如下：菌液制備同1.3.1 節(jié)，首先使用PBS 洗滌菌體兩次，用LB 肉湯重懸浮后調(diào)整菌懸液的OD600nm=0.5，將上述菌液用LB 肉湯稀釋600 倍（使菌液濃度為5×105CFU/mL）。在96 孔酶標(biāo)板中接種福氏志賀菌ATCC 12022 懸浮液，每孔100 μL。配制原兒茶醛溶液，將原兒茶醛溶解于體積分?jǐn)?shù)1%的DMSO 水溶液中，利用等倍稀釋法使原兒茶醛的質(zhì)量濃度分別為4.0，2.0，1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625 mg/mL，每孔100 μL 加入96 孔酶標(biāo)板中，將原兒茶醛溶液與菌懸液吹打均勻于37 ℃培養(yǎng)24 h。以不含有原兒茶醛的菌懸液作為陰性對(duì)照，含有體積分?jǐn)?shù)0.5% DMSO 的LB肉湯為陽(yáng)性對(duì)照。測(cè)定培養(yǎng)前、后樣品的OD600nm，若測(cè)定值相差小于0.05，則認(rèn)為測(cè)試濃度能夠抑制菌體生長(zhǎng)，抑制菌體生長(zhǎng)的原兒茶醛的最小濃度即為MIC。然后從能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的不同質(zhì)量濃度的原兒茶醛孔中吸取100 μL 涂布于LB 瓊脂平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后觀測(cè)培養(yǎng)皿中菌的生長(zhǎng)狀況，在LB 平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)的最小濃度定義為MBC。

1.3.3 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022 生長(zhǎng)曲線的影響 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定按照Guo 等[18]描述的方法。菌液制備同1.3.1 節(jié)，調(diào)整菌懸液的濃度為106CFU/mL。在百孔板中每孔接種125 μL 福氏志賀菌ATCC 12022 菌懸液，然后每孔加入等量的原兒茶醛溶液（溶解于含體積分?jǐn)?shù)1% DMSO的LB 肉湯中），使最終原兒茶醛質(zhì)量濃度為2×MIC、MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC 和0。以不添加原兒茶醛的菌懸液為對(duì)照組，并設(shè)置含有體積分?jǐn)?shù)0.5% DMSO 的LB 肉湯作為背景空白對(duì)照組。樣品放置在微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，每隔1 h 檢測(cè)記錄

OD600nm，用培養(yǎng)時(shí)間和OD600nm繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022 細(xì)胞形態(tài)的影響 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)福氏志賀菌細(xì)胞形態(tài)的觀測(cè)參照Lü 等[19]的方法，具體過(guò)程如下：首先按照1.3.1 節(jié)所述方法制備菌懸液，配制原兒茶醛溶液質(zhì)量濃度為（0、2×MIC、4×MIC），菌懸液與原兒茶醛溶液混合后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在3 h 和6 h 取出樣品。將菌液進(jìn)行離心（5 000×g、4 ℃、5 min），用PBS 清洗菌體2次。隨后用PBS 重懸浮，離心去上清液（5 000×g、4℃、5 min），加入體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛于4 ℃初步固定12 h。用PBS 和無(wú)菌水先后清洗菌體一次，置于體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸中再次固定8 h。使用30%，50%，70%，80%，90%和100%體積分?jǐn)?shù)的乙醇梯度洗脫菌體，10 min/次。最后吸取5 μL 樣品于潔凈的玻片上并晾干，玻片在真空狀態(tài)下進(jìn)行鍍金處理，在場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀測(cè)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.3.5 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022 胞內(nèi)ATP 濃度的影響 菌液制備同1.3.1 節(jié)，用LB 肉湯調(diào)整菌懸液濃度使OD600nm=0.5，用不同質(zhì)量濃度（0、2×MIC、4×MIC）的原兒茶醛處理菌體，空白對(duì)照組與菌懸液等體積的PBS 溶液，所有樣品于37 ℃恒溫培養(yǎng)30 min。隨后在冰上用超聲波破碎細(xì)菌樣品以提取胞內(nèi)ATP，超聲時(shí)每個(gè)樣品超聲7 min，工作3 s，間隔6 s，探頭位于樣品液面下0.7 cm。每輪超聲結(jié)束后立即將樣品置于100 ℃下處理2 min 滅活樣品中的ATP 酶，處理后將樣品立即置于冰上。隨后離心取上清液（8 000×g、4 ℃、5 min），使用ATP 檢測(cè)試劑盒測(cè)定胞內(nèi)ATP，分別添加125 μL ATP 檢測(cè)工作液及樣品上清液于96孔白色酶標(biāo)板中，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品熒光強(qiáng)度。將ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為0.01，0.10，1.00，10.00 μmol/L，用ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算細(xì)胞內(nèi)ATP 濃度。

1.3.6 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022 膜電位的影響 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌膜電位的影響參照Shi 等[20]的方法測(cè)定，菌液制備同1.3.1 節(jié)，使用PBS 清洗菌體兩次并用PBS 重懸浮使OD600nm=0.5。向96 孔黑色酶標(biāo)板中加入125 μL 菌懸液，所有樣品于37 ℃恒溫培養(yǎng)40 min。隨后向每孔中加入1 μL 濃度為1 μmol/L 細(xì)胞膜電位熒光探針DiBAC4（3），37 ℃孵育30 min。加入不同質(zhì)量濃度的原兒茶醛【0（對(duì)照組）、2×MIC、4×MIC】處理5 min，隨后使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)為492 m/515 nm 下的熒光強(qiáng)度。其中背景對(duì)照組為不含有菌懸液的原兒茶醛（0、2×MIC 和4×MIC）溶液，通過(guò)計(jì)算處理組檢測(cè)所得熒光強(qiáng)度與背景對(duì)照組檢測(cè)所得熒光強(qiáng)度的差值，得到原兒茶醛作用組的相對(duì)熒光強(qiáng)度，細(xì)菌膜電位以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示。

1.3.7 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022 菌體蛋白的影響 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌胞內(nèi)可溶性蛋白的影響按照Wang 等[21]的方法測(cè)定，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。按照1.3.1 節(jié)所述方法制備菌懸液，用原兒茶醛溶液【0（對(duì)照組）、2×MIC 和4×MIC】處理福氏志賀菌，將樣品置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用PBS（8 000×g、4 ℃、5 min）進(jìn)行離心清洗，收集上清液。隨后制備裂解液（2 mL 蛋白提取液，8 μL 蛋白酶抑制劑，20 μL 蛋白穩(wěn)定劑）與樣品充分混勻后置于冰上振蕩30 min，再將樣品于室溫持續(xù)振蕩至澄清。利用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白樣品濃度，并調(diào)整所有樣品的蛋白濃度為一致，加入上樣緩沖液 【25 μL 100 mmol/L pH 6.8 的Tris-HCl，體積分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS），體積分?jǐn)?shù)0.5%溴酚藍(lán)，體積分?jǐn)?shù)50%甘油，200 mmol/L 二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）】，100 ℃加熱5 min 后冰封，進(jìn)行SDS-PAGE 分析。電泳后，用考馬斯亮藍(lán)R-250 對(duì)蛋白條帶進(jìn)行染色，最后脫色得到分離的蛋白條帶。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示（n＝3），利用IBM SPSS 軟件（version 19.0；SPSS，Inc.，Chicago，IL）處理數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。若P＜0.05 認(rèn)為樣本存在顯著差異，P＜0.01 則認(rèn)為樣本存在極顯著差異。所有試驗(yàn)均獨(dú)立進(jìn)行，重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌的MIC 和MBC

本文通過(guò)測(cè)定MIC 和MBC 反映原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌的抑菌和殺菌活性。由表1 可知，當(dāng)原兒茶醛質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 及以下時(shí)，樣品培養(yǎng)前后的OD600nm數(shù)值變化大于0.05，當(dāng)原兒茶醛質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 及以上時(shí)，培養(yǎng)前后樣品的OD600nm測(cè)定值相差小于0.05。由于樣品培養(yǎng)前與培養(yǎng)24 h 后的OD600nm測(cè)定值相差小于0.05 則可認(rèn)為該測(cè)試濃度能夠抑制菌體生長(zhǎng)，因此原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022 的MIC 為0.5 mg/mL。

表1 不同質(zhì)量濃度原兒茶醛處理前、后的福氏志賀菌ATCC 12022 菌懸液的OD600nm 數(shù)值變化Table 1 Changes of OD600nm values in bacterium suspension with different mass concentrations of protocatechualdehyde before and after against Shigella flexneri ATCC 12022

圖2 為不同質(zhì)量濃度的原兒茶醛處理后的福氏志賀菌菌落生長(zhǎng)情況，當(dāng)原兒茶醛質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL 和4.0 mg/mL 時(shí)，LB 培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)（圖2a 和b），表現(xiàn)出原兒茶醛的殺菌作用。當(dāng)原兒茶醛質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，LB 培養(yǎng)基上出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)（圖2c），且隨著原兒茶醛質(zhì)量濃度的減小，菌落數(shù)量逐漸增加。根據(jù)MBC 的判定原則（1.3.2 節(jié)中的描述），原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022 的MBC 為4.0 mg/mL。

圖2 不同質(zhì)量濃度原兒茶醛處理后福氏志賀菌ATCC 12022 的菌落分布Fig.2 Colony distribution of Shigella flexneri ATCC 12022 after treatment with different mass concentrations of protocatechualdehyde

2.2 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌生長(zhǎng)曲線的影響

試驗(yàn)測(cè)定了質(zhì)量濃度2×MIC～1/8×MIC 的原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌生長(zhǎng)曲線的影響。從圖3 可以看出，質(zhì)量濃度為2×MIC 和MIC 的原兒茶醛完全抑制了福氏志賀菌的生長(zhǎng)。此外，與對(duì)照組相比，當(dāng)原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/2×MIC、1/4×MIC 和1/8×MIC 時(shí)，福氏志賀菌的最大生長(zhǎng)量有所下降。并且隨著原兒茶醛質(zhì)量濃度的減小，細(xì)菌生長(zhǎng)延滯期減小。

圖3 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022生長(zhǎng)曲線的影響Fig.3 Effects of protocatechualdehyde on growth curve of Shigella flexneri ATCC 12022

2.3 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌細(xì)胞形態(tài)的影響

原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌細(xì)胞形態(tài)的影響如圖4所示，未經(jīng)原兒茶醛處理的福氏志賀菌細(xì)胞完整，菌體呈短桿狀，形態(tài)飽滿，表面光滑（圖4a 和d），經(jīng)原兒茶醛處理后（圖4b、4c、4e、4f），福氏志賀菌表面粗糙，細(xì)胞皺縮。隨著原兒茶醛質(zhì)量濃度和孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞受損程度增大。經(jīng)4×MIC的原兒茶醛處理6 h 后（圖4f），福氏志賀菌菌體出現(xiàn)大面積塌陷，喪失了其固有形態(tài)。

圖4 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀測(cè)原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022 細(xì)胞形態(tài)的影響（20 000×）Fig.4 Effects of protocatechuic aldehyde on the morphology of Shigella flexneri ATCC 12022 cells observed by field emission scanning electron microscope（20 000×）

2.4 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌胞內(nèi)ATP 的影響

試驗(yàn)利用螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌胞內(nèi)ATP 的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x）與相對(duì)熒光強(qiáng)度（y）具有良好的線性關(guān)系（y＝91376x＋7171.4，R2＝0.9999），因此，可以根據(jù)ATP 的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣品中胞內(nèi)ATP 的濃度。如圖5所示，不經(jīng)原兒茶醛處理的對(duì)照組胞內(nèi)ATP 濃度為（1.66±0.02）μmol/L，經(jīng)2×MIC 質(zhì)量濃度的原兒茶醛處理的細(xì)菌胞內(nèi)ATP濃度為（0.25±0.02）μmol/L，而經(jīng)4×MIC 質(zhì)量濃度的原兒茶醛處理的細(xì)菌胞內(nèi)ATP 濃度為（0.13±0.01）μmol/L。數(shù)據(jù)分析可知，原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌胞內(nèi)ATP 濃度具有極顯著的降低作用（P＜0.01）。而對(duì)比2×MIC 和4×MIC 濃度的原兒茶醛處理，細(xì)菌胞內(nèi)ATP 濃度之間無(wú)顯著差異（P≥0.05）。

圖5 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022胞內(nèi)ATP 的影響Fig.5 Effects of protocatechualdehyde on intracellular ATP production by Shigella flexneri ATCC 12022

2.5 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌膜電位的影響

試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)DiBAC4（3）熒光染料與細(xì)菌胞漿內(nèi)蛋白結(jié)合后發(fā)出的熒光強(qiáng)度，來(lái)指示細(xì)胞膜電位的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，原兒茶醛處理后，福氏志賀菌細(xì)菌膜電位相比于對(duì)照組有極顯著的差異（P＜0.01）。如圖6所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)原兒茶醛處理的福氏志賀菌細(xì)胞顯示出熒光強(qiáng)度降低，表示細(xì)菌細(xì)胞膜電位出現(xiàn)超極化現(xiàn)象，且經(jīng)質(zhì)量濃度為4×MIC 原兒茶醛處理比質(zhì)量濃度為2×MIC 原兒茶醛處理后的變化現(xiàn)象更加明顯。

圖6 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022細(xì)胞膜電位的影響Fig.6 Effects of protocatechualdehyde on the membrane potentials of Shigella flexneri ATCC 12022

2.6 原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌菌體蛋白的影響

原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌菌體蛋白的影響如圖7所示。未經(jīng)處理的福氏志賀菌細(xì)胞有清晰度較高的蛋白條帶。與對(duì)照組相比，2×MIC 和4×MIC質(zhì)量濃度的原兒茶醛處理后的細(xì)菌細(xì)胞的蛋白條帶清晰度明顯減弱，且質(zhì)量濃度為4×MIC 原兒茶醛處理后的變化現(xiàn)象比2×MIC 明顯。

圖7 SDS-PAGE 分析原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022 菌體蛋白的影響Fig.7 SDS-PAGE analysis of the effect of protocatechualdehyde on intracellular proteins of Shigella flexneri ATCC 12022

3 討論

植物源活性物質(zhì)是從植物中提取的有效活性成分。近年來(lái)，一些食源性致病菌已被證明可利用植物源活性物質(zhì)進(jìn)行抑制和殺滅，如沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、副溶血性弧菌和銅綠假單胞菌等[22-23]，這為食源性致病菌的控制提供了新的方法。福氏志賀菌作為一種重要的食源性致病菌，是引起人類(lèi)腹瀉的重要原因之一，具有高度傳染性并且嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康和生命安全[24]。目前，天然植物源活性物質(zhì)對(duì)福氏志賀菌的抑殺作用及機(jī)理研究報(bào)道較少。本文旨在探究原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌的抑制作用及可能的機(jī)理。

本試驗(yàn)結(jié)果表明原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌ATCC 12022 有良好的抑殺作用，其MIC 為0.5 mg/mL，MBC 為4.0 mg/mL。前期一些研究也探究了部分天然化合物對(duì)福氏志賀菌的抑殺作用，Kang 等[25]通過(guò)肉湯稀釋法測(cè)定了沒(méi)食子酸對(duì)福氏志賀菌的MIC 為2.0 mg/mL，MBC 為8.0 mg/mL。Chan 等[26]證明了巴丹桂皮、中國(guó)肉桂和牛至提取物對(duì)福氏志賀菌具有一定的抑菌效果，且MIC 都大于2.5 mg/mL。Oh 等[27]發(fā)現(xiàn)綠茶提取物對(duì)福氏志賀菌有抗菌作用，其MIC 為10.0 mg/mL。對(duì)比于以上已報(bào)道的對(duì)福氏志賀菌有抑菌效果的物質(zhì)，原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌具有良好的抑殺效果。

本研究利用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀測(cè)了原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌細(xì)胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)原兒茶醛可使福氏志賀菌表面干癟皺縮，但沒(méi)有造成細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞以及細(xì)胞破碎（圖4）。Shi 等[15]發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為4×MIC 原兒茶醛作用于阪崎克羅諾桿菌后，菌體表面粗糙凹陷，且受損程度和數(shù)量隨原兒茶醛質(zhì)量濃度的增加而增大。Becerril 等[28]觀測(cè)發(fā)現(xiàn)月桂酰精氨酸乙酯處理5 min 時(shí)大腸桿菌細(xì)胞外觀發(fā)生不規(guī)則改變，表面有明顯的孔隙形成，菌體嚴(yán)重皺縮并出現(xiàn)破裂的細(xì)菌。本研究未發(fā)現(xiàn)福氏志賀菌表面破裂，推測(cè)細(xì)胞形態(tài)改變是由于原兒茶醛處理后菌體細(xì)胞膜透性增強(qiáng)，從而使內(nèi)容物流出，使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。

原兒茶醛可以極顯著降低（P＜0.01）福氏志賀氏菌ATCC 12022 細(xì)胞內(nèi)ATP 的濃度，且呈質(zhì)量濃度依賴性（圖5）。Peng 等[29]發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，經(jīng)質(zhì)量濃度為MIC 和2×MIC 橄欖油多酚提取物處理細(xì)菌2 h 后，細(xì)菌胞內(nèi)ATP 濃度顯著降低（P＜0.05），推測(cè)可能是細(xì)菌細(xì)胞膜完整性受到破壞以及驅(qū)動(dòng)ATP 合成的質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)的消耗導(dǎo)致胞內(nèi)ATP 丟失。Burt 等[30]報(bào)道了香芹酚作用于蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞后，細(xì)菌胞內(nèi)ATP 濃度下降，而細(xì)胞外ATP 濃度沒(méi)有相應(yīng)增加，認(rèn)為可能是由于ATP水解速率增加造成的。同樣的，Paul 等[31]研究了MIC 質(zhì)量濃度的沙棘果精油處理枯草芽孢桿菌ATCC 6633 30 min 后，細(xì)胞外ATP 濃度顯著增加（P＜0.05），并觀察到細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)被精油破壞，表明這種現(xiàn)象是由于精油引起的細(xì)胞膜損傷或者細(xì)胞膜通透性增加所致。在本研究中，胞內(nèi)ATP 濃度的降低可能是由于原兒茶醛增加了福氏志賀菌自身ATP 水解的速度，另一方面可能是由于原兒茶醛使細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，使得細(xì)胞內(nèi)ATP 流出，此原因與場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡試驗(yàn)中推測(cè)原因相同。

膜電位在細(xì)胞對(duì)抗生素的吸收和殺菌過(guò)程中起著重要的作用，膜電位的變化與細(xì)胞的通透性有關(guān)[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，經(jīng)原兒茶醛處理后的細(xì)菌細(xì)胞膜電位降低，即引起細(xì)胞膜超極化。Zhang 等[33]用羅丹明123 熒光染料測(cè)定膜電位的變化，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，經(jīng)0.5×MIC～2×MIC質(zhì)量濃度的香附香精油處理的金黃色葡萄球菌細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05），即精油作用后的金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜呈現(xiàn)超極化。Cho 等[34]研究表明野山藥中提取的薯蕷皂苷對(duì)白色念珠菌膜電位呈現(xiàn)去極化作用，推測(cè)熒光強(qiáng)度的增加可能是由于細(xì)胞膜受損，導(dǎo)致膜電位發(fā)生去極化所致。Bot 等[32]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜電位發(fā)生超極化或去極化是由于抑菌物質(zhì)影響了細(xì)菌細(xì)胞膜上離子的運(yùn)動(dòng)，特別是K＋，從而影響胞體的自動(dòng)調(diào)節(jié)，使得菌體細(xì)胞膜電位出現(xiàn)極化現(xiàn)象。

蛋白質(zhì)是生物合成的基礎(chǔ)，在細(xì)菌細(xì)胞的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。Wang 等[21]利用SDS-PAGE 研究了乳酸對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌等可溶性蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)乳酸能夠通過(guò)破壞或抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成導(dǎo)致細(xì)菌死亡。Chen 等[35]報(bào)道稱金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌經(jīng)甜菜糖蜜多酚處理后蛋白質(zhì)含量明顯降低。本試驗(yàn)利用SDS-PAGE 分析發(fā)現(xiàn)原兒茶醛能夠破壞福氏志賀菌的蛋白質(zhì)或抑制蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而干擾細(xì)菌的能量代謝。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究結(jié)果表明原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌具有較好的抑制作用，其通過(guò)降低細(xì)菌胞內(nèi)ATP 濃度，作用于細(xì)胞膜改變細(xì)胞膜電位使其出現(xiàn)超極化現(xiàn)象，影響菌體形態(tài)使細(xì)胞表面干癟皺縮，破壞蛋白質(zhì)或抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)菌正常的生理功能紊亂從而達(dá)到抑菌效果。研究結(jié)果為原兒茶醛作為一種有潛力的、天然安全的抑菌物質(zhì)提供了理論依據(jù)。然而，原兒茶醛對(duì)福氏志賀菌的其它抑菌作用機(jī)制以及其在食品生產(chǎn)加工中的應(yīng)用方式需要在實(shí)際應(yīng)用前進(jìn)一步探討。