魏春華，徐 葉，鄧小鶯，林志峰，毛 婉， 黃夏玲，戴愛玲，楊小燕，李 娜，羅滿林，劉建奎

(1 龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364000；2 福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室，福建 龍巖 364000； 3 福建農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院，福建 福州 350002；4華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

PCV2是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員，為無囊膜的單股閉合環(huán)狀DNA病毒，其基因組大小為1 766～1 777 bp。根據(jù)抗原性和基因型的不同，前人將PCV分為PCV1、PCV2和PCV3等3個血清型[1-2]，2019年我國學(xué)者證實豬群中存在PCV4[3]。PCV1對豬不具有致病作用，PCV2和PCV3在豬群中廣泛存在。PCV2對豬具有致病性，由其引起的疾病稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus associated diseases，PCVAD), 主要包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)和母豬繁殖障礙等多種疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[4-6]。研究表明，盡管豬場廣泛使用滅活疫苗或亞單位疫苗來防控PCV2，但是其感染率在豬場仍呈現(xiàn)上升趨勢。此外，PCV2基因組具有高突變性和重組性的特點，導(dǎo)致PCV2變異毒株不斷出現(xiàn)，給豬場防控PCV2帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[7-8]。

PCV2基因組包含11個潛在的開放閱讀框(ORF1～ORF11)，其中對ORF1～ORF4的功能研究較為清楚。ORF1基因全長945 bp，是PCV2最大的開放閱讀框，編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep和Rep’蛋白[9-10]。ORF2基因全長為702，705或717 bp，編碼病毒的核衣殼(Cap)蛋白，是主要的免疫保護性抗原，變異性較高，也是進行遺傳變異分析和疫苗開發(fā)的靶基因[6,11-12]。ORF3、ORF4基因編碼的蛋白與細(xì)胞凋亡相關(guān)[13-14]。目前，基于ORF2基因構(gòu)建的遺傳進化樹將PCV2分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e等5種基因型，其中PCV2a、PCV2b和PCV2d在世界范圍內(nèi)廣泛分布，PCV2c僅存在于丹麥和巴西[15-18]。PCV2e基因型于2015年在美國首次報道，其基因組全長1 777 bp，ORF2基因長度717 bp，其末端比PCV2a～PCV2d基因型毒株的ORF2基因多12～15 bp[15]。

目前，我國豬場PCV2呈現(xiàn)多種基因型(包括重組毒株)并存的局面，優(yōu)勢毒株是否發(fā)生變異需要從全基因組角度進一步研究，不能僅僅依靠ORF2基因。此外，PCV2e基因型在豬場的流行情況還不清楚，因此需要進一步了解當(dāng)前PCV2的流行動態(tài)及主要流行毒株。東南地區(qū)是我國重要的養(yǎng)豬區(qū)域，為深入了解該區(qū)域豬群中PCV2的流行動態(tài)及其遺傳演化，本研究對2012-2018年在福建、江西、廣東、江蘇及浙江等省規(guī)?；i場采集的649份疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合癥(PMWS)豬只的臨床樣本(淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、血清等)進行PCV2檢測，明確各個基因型毒株的流行情況，同時選取54份不同年份、不同地區(qū)的PCV2陽性樣本進行PCV2全基因組的擴增，從全基因組角度分析我國部分地區(qū)PCV2的分子特征，以期為該病毒的致病機制、疫苗研究和PCVAD的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣 本

2012-2018年在福建、江西、廣東、江蘇及浙江等省規(guī)?；i場采集疑似PMWS豬只的組織(淋巴結(jié)、脾臟、腎臟等)樣本及血清樣本，總計649份(福建278份，江西102份，廣東98份，江蘇90份，浙江81份)，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試 劑

Universal Genomic DNA Extraction Kit、DNA Marker 2000、ExTaqDNA聚合酶和pMD19-T克隆載體，購自TaKaRa公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自天根生化科技有限公司。

1.3 引 物

為了解PCV2各基因型的流行特點，參照文獻[19-21]合成可以區(qū)分PCV2a、PCV2b、PCV2d和PCV2e的鑒別引物；參照文獻[22-24]合成用于擴增PCV2全基因組的引物。上述引物均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCV2 DNA的提取及基因分型檢測

對649份樣品進行PCV2特異性PCR擴增。組織(淋巴結(jié)、脾臟和腎臟等)樣品和血清樣品的DNA提取按照DNA提取試劑盒說明書進行。以提取的DNA為模板進行PCV2基因分型檢測，同時設(shè)不加模板的陰性對照。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：10×EXTaqBuffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，DNA模板2.0 μL，10 mmol/L PCV2a、PCV2b、PCV2d或PCV2e的上、下游引物各1.0 μL，EXTaq(5 U/μL) 0.25 μL，用ddH2O補至25.0 μL。PCR擴增程序為：95 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，54.5～56.5 ℃(具體溫度依引物而定，見參考文獻[19-21])退火45 s，72 ℃ 延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCV2全基因組序列的擴增與分析

選取54份檢測陽性的樣品(福建21份，江西9份，廣東9份，江蘇8份，浙江7份)進行PCV2全基因組的擴增。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：10×EXTaqBuffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，DNA模板2.0 μL，10 mmol/L PCV2全基因組的上、下游引物各1.0 μL，EXTaq(5 U/μL) 0.25 μL，用ddH2O補至25.0 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，50～55 ℃(具體溫度依引物而定，見參考文獻[22-24])退火45 s，72 ℃ 延伸120 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。同時設(shè)不加模板的陰性對照。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。通過膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物并克隆至pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。對轉(zhuǎn)化后的菌液進行PCR鑒定，并提取質(zhì)粒進行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切(pMD19-T載體的酶切位點)鑒定，將鑒定正確的陽性重組菌株送往北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。利用DNAStar軟件對54株P(guān)CV2全長序列與國內(nèi)外19株P(guān)CV2參考毒株序列進行全基因組同源性比對分析及Cap蛋白氨基酸序列比對；利用Mega 6.0軟件對PCV2全基因組及ORF2基因進行遺傳進化分析；利用Simplot 3.51軟件和RDP 4.24重組分析軟件對本研究中54株P(guān)CV2進行重組分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2基因分型檢測結(jié)果

PCR檢測結(jié)果(表1)表明，649份樣品中有272份為PCV2陽性，陽性率為41.9%(272/649)，表明豬群感染PCV2較為普遍，應(yīng)當(dāng)引起重視。在PCV2陽性樣品中，PCV2a檢出率為12.5%(34/272)，PCV2b檢出率為24.3%(66/272)，PCV2d檢出率為67.6%(184/272)，PCV2e檢出率為1.1%(3/272)；部分豬場存在2種基因型毒株，檢出率為5.5%(15/272)。

表1 2012-2018年中國東南地區(qū)規(guī)?；i場的PCV2檢測結(jié)果Table 1 PCV2 genotypes identified in 649 samples obtained from pig farms in Southeast China from 2012 to 2018

2.2 PCV2全基因組序列分析

全基因組序列分析結(jié)果顯示，PCV2基因組長度為1 766～1 777 bp；尤其值得注意的是，本研究在福建省發(fā)現(xiàn)了新基因型PCV2e，其基因組全長為1 777 bp，與PCV2其他基因型序列差異較大。將54株P(guān)CV2全基因序列與國內(nèi)外19株參考毒株進行同源性比較和遺傳進化分析，結(jié)果表明54株P(guān)CV2全基因序列核苷酸同源性為91.6%～99.9%，基因組之間差異性較大，與PCV2a代表毒株SZ-AY(181948)、BF(AF381175)、AF055392、DQ397521的核苷酸同源性為91.2%～99.5%，與PCV2b代表毒株Zhuji2003(AY579893)、France(AF055394)、GD-TS(AY181945)、NL Control 1(AY484407)和16845(EU340258)的核苷酸同源性為91.0%～99.9%，與PCV2c代表毒株DK1980PMWSfree(EU148503)、DK1987PMWSfree(EU148504)和DK1990PMWSfree(EU148505)的核苷酸同源性為92.5%～95.0%，與PCV2d代表毒株BDH(HM038017)、22625-33(JX535296)、Shenzhen02(HQ113117)和TJ-AY(181946)的核苷酸同源性為92.5%～100%，與PCV2e代表毒株USA-45358(KT795290)、MEX-41238(KT795287)的核苷酸同源性為91.3%～99.7%。

將54株P(guān)CV2全基因組序列與19株國內(nèi)外參考毒株進行比對構(gòu)建系統(tǒng)遺傳進化樹，結(jié)果(圖1)表明，54株P(guān)CV2分為PCV2a、PCV2b、PCV2d和PCV2e 4個基因型，其中6株屬于PCV2a基因型，16株屬于PCV2b基因型，2株屬于PCV2e基因型，其余30株分離毒株屬于PCV2d基因型。

●代表本研究毒株；括號內(nèi)為序列的GenBank登錄號。下圖同●indicate virus in this study;The data in brackets is the GenBank accession number of sequence.The same below

2.3 PCV2 ORF2序列分析

對54株P(guān)CV2 ORF2基因序列進行分析可知，基因長度為702 bp的有23株，為705 bp的有29株，為717 bp的有2株。

將54株P(guān)CV2 ORF2基因序列與國內(nèi)外19株參考毒株的ORF2基因序列進行同源性比較和遺傳進化分析，結(jié)果顯示54株P(guān)CV2 ORF2基因序列的核苷酸同源性為81.8%～100%，差異性較大，其中與PCV2a代表毒株SZ(AY181948)、BF(AF381175)、AF055392、DQ397521的核苷酸同源性為81.5%～99.3%，與PCV2b代表毒株Zhuji2003(AY579893)、France(AF055394)、GD-TS(AY181945)、NL Control 1(AY484407)和16845(EU340258)的核苷酸同源性為84.8%～99.6%，與PCV2c代表毒株DK1980PMWSfree(EU14-8503)、DK1987PMWSfree(EU148504)和DK1990-PMWSfree(EU148505)的核苷酸同源性為84.8%～90.7%，與PCV2d代表毒株BDH(HM038017)、22625-33(JX535296)、Shenzhen02(HQ113117)和TJ(AY181946)的核苷酸同源性為84.0%～100%，與PCV2e代表毒株USA-45358-2015(KT795290)、MEX-41238-2014(KT795287)的核苷酸同源性為81.6%～99.9%。

將54株P(guān)CV2 ORF2序列與國內(nèi)外19株參考毒株的ORF2序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)遺傳進化樹，結(jié)果(圖2)表明基于ORF2核苷酸序列所繪制的遺傳進化樹結(jié)果與基于 PCV2 全長基因組的結(jié)果基本一致，即54株P(guān)CV2可分為4個基因型，屬于PCV2a、PCV2b、PCV2d和PCV2e的毒株數(shù)分別為6，16，30和2株，說明PCV2d基因型為豬場的優(yōu)勢毒株。

圖2 基于ORF2基因的PCV2遺傳進化分析Fig.2 Phylogenetic trees based on sequences of PCV2 ORF2 sequences

2.4 PCV2 Cap蛋白序列分析

本研究54株P(guān)CV2基因編碼的Cap蛋白長度為233個氨基酸的有23株，為234個氨基酸的有29株，為238個氨基酸的有2株，氨基酸同源性為82.1%～100%，與參考毒株的氨基酸同源性為81.6%～100%。

對54株P(guān)CV2 Cap蛋白的氨基酸序列進行分析，結(jié)果表明不同基因型PCV2 Cap蛋白差異顯著，同一基因型毒株則存在一些特征性的突變位點(圖3)。

由圖3可以看出，與其他PCV2基因型毒株相比，PCV2a基因型的毒株主要發(fā)生了N77D、V91I和T151P突變，PCV2b基因型的毒株主要發(fā)生了V57I、L89R和D210E突變，PCV2d 基因型的毒株主要發(fā)生了F53I和A68N突變。PCV2e基因型毒株ORF2基因全長為717 bp，是編碼238個氨基酸的Cap 蛋白，與PCV2a～PCV2d核苷酸和氨基酸的同源性較低(約為85%)，主要發(fā)生了K58V、K59T、N77G、T131N、A133T、A135N、T137S、T170I、V196T、N204H、Y207L和L226M突變。

此外，5個PCV2基因型中Cap蛋白唯一的糖基化位點NYS(143-145位氨基酸)非常保守，沒有發(fā)生突變。

方框示氨基酸主要突變情況，灰色部分標(biāo)示糖基化位點The regions marked with solid box are representative mutation sites. Experimentally confirmed glycolysation sites are marked with grey rectangles

圖3 PCV2 Cap蛋白氨基酸多序列比對分析(續(xù))Fig.3 Multiple alignment of amino acid sequences of PCV2 Cap protein (continued)

2.5 PCV2重組分析

重組分析結(jié)果表明，CN-PCV2-FJ1145毒株來自PCV2b基因型毒株(代表毒株Zhuji2003)和PCV2d基因型毒株(代表毒株BDH)的自然重組，PCV2-FJBZ05毒株來自PCV2a基因型毒株(代表毒株AF055392)和PCV2b基因型毒株(代表毒株Zhuji2003)的自然重組。經(jīng)重組檢測軟件分析，CN-PCV2-FJ1145重組位點(nt 1 040、nt 165) 和PCV2-FJBZ05重組位點(nt 1 061)均發(fā)生在ORF2 區(qū)域。基于重組區(qū)域序列構(gòu)建的進化樹進一步證實了重組的可能性，重組毒株CN-PCV2-FJ1145和PCV2-FJBZ05在基因組斷裂點前后的不同區(qū)域分別處于遺傳進化樹中不同的進化分支，CN-PCV2-FJ1145在基因組斷裂點兩側(cè)的堿基序列(nt 1-1 040和nt 1 652-1 794)與PCV2d基因型毒株處于同一進化分支(圖4-A)，而基因組裂點之間的堿基序列(nt 1 041-1 651)與PCV2b基因型毒株處于同一進化分支(圖4-B)。PCV2-FJBZ05在基因組斷裂點前的堿基序列(nt 1-1 061)與PCV2a基因型毒株處于同一進化分支(圖4-C)，而基因組斷裂點后的堿基序列(nt 1 062-1 794)與PCV2b基因型毒株處于同一進化分支(圖4-D)。

3 討 論

PCV2是引起PCVAD的主要病原，給各國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[4-6,24-29]。研究表明，PCV2侵入動物機體后，主要破壞豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機體出現(xiàn)免疫抑制，從而引起PCV2與其他病毒混合感染，增加豬只的發(fā)病率和死亡率。PCV2于2000年在我國大陸首次被檢測到，隨后該病迅速蔓延至全國，成為我國規(guī)?；B(yǎng)豬場主要疫病之一。東南地區(qū)是我國重要的生豬產(chǎn)業(yè)基地，因此研究該區(qū)域豬場PCV2的流行特征具有非常重要的意義。本研究對2012-2018年從福建、江西、廣東、江蘇及浙江等省規(guī)?；i場疑似PMWS豬只收集的組織樣本(淋巴結(jié)、脾臟、腎臟等)及血清樣本，采用PCR方法進行系統(tǒng)檢測，結(jié)果表明樣本中PCV2的陽性率為41.9%(272/649)，說明東南地區(qū)豬場PCV2感染已非常普遍，應(yīng)引起豬場高度重視，加強對PCV2的防控。

A.基于CN-PCV2-FJ1145斷裂點前(nt 1-1 040)后(nt 1 652-1 794)序列的聚類分析；B.基于CN-PCV2-FJ1145斷裂 點之間(nt 1 041-1 651)序列的聚類分析；C.基于PCV2-FJBZ05斷裂點前(nt 1-1 061)序列的聚類分析； D.基于PCV2-FJBZ05斷裂點后(nt 1 062-1 794)序列的聚類分析A.Cluster analysis based on the sequence before (nt 1-1 040) and after (nt 1 652-1 794) the breakpoint of CN-PCV2-FJ1145;B.Cluster analysis based on the sequence between the breakpoint (nt 1 041-1 651) of CN-PCV2-FJ1145； C.Cluster analysis based on the sequence before the breakpoint (nt 1-1 061) of PCV2-FJBZ05; D.Cluster analysis based on the sequence after the breakpoint (nt 1 062-1 794) of PCV2-FJBZ05圖4 CN-PCV2-FJ1145 和PCV2-FJBZ05毒株的分段遺傳進化分析Fig.4 Incongruent phylogenetic trees between two strains(CN-PCV2-FJ1145 and PCV2-FJBZ05) and representative viruses

目前PCV2至少存在5種基因型，其中PCV2e是最近新發(fā)現(xiàn)的一種基因型毒株，其核苷酸序列與其他4種基因型毒株P(guān)CV2a～PCV2d的核苷酸序列差異較大，而PCV2c基因型毒株僅在少數(shù)國家流行。研究表明，PCV2基因組核苷酸替換情況為每年每位點1.2×10-3～6.6×10-3個替換，其突變率與單鏈RNA病毒相近[7,26-27]。新基因型PCV2e的出現(xiàn)進一步支持PCV2是目前變異速度最快的DNA病毒，但是該基因型病毒的復(fù)制和感染機制研究尚不清楚，需進一步研究。本研究表明，雖然我國東南地區(qū)豬場存在4種基因型毒株，但是以PCV2d型為主(67.6%)，這與之前研究結(jié)果[28-29]相似。PCV2e基因型毒株檢出率僅為0.46%(3/649)，表明PCV2e在豬場流行范圍較小，可能與其復(fù)制水平及傳播能力較低有關(guān)[15]。PCV2可通過毒株之間的基因重組持續(xù)進化，導(dǎo)致變異毒株不斷出現(xiàn)[27-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，部分豬場存在2個或2個以上基因型毒株，這為毒株發(fā)生重組提供了可能，CN-PCV2-FJ1145和PCV2-FJBZ05可能來源于2種不同基因型毒株(PCV2b和PCV2d、PCV2a和PCV2b)之間的自然重組，導(dǎo)致PCV2持續(xù)進化，從而出現(xiàn)新的變異株。不同基因亞型PCV2重組產(chǎn)生的毒株的抗原性和復(fù)制能力會發(fā)生改變，這進一步加劇了PCV2的變異，為豬場防控PCV2帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[27-31]。

ORF2編碼的衣殼蛋白即Cap蛋白，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒的復(fù)制和宿主的免疫應(yīng)答。研究表明，Cap蛋白部分氨基酸突變可能導(dǎo)致毒株抗原變異或致病力增強[12,30,32]。本研究測得54株Cap蛋白之間的氨基酸同源性為 82.1%～100%，與參考毒株的同源性為81.6%～100%，其中PCV2a、PCV2b、PCV2d型毒株與PCV2c和PCV2e型毒株的同源性較低。氨基酸序列分析表明，不同亞型毒株的Cap 蛋白差異明顯，即使是同一基因型的毒株也存在一些代表性突變位點，這可能導(dǎo)致PCV2不斷進化和變異毒株的出現(xiàn)[12,30,32]。與其他亞型毒株相比，PCV2e基因型毒株ORF2基因編碼238個氨基酸，發(fā)生了K58V、K59T、N77G、T131N、A133T、A135N、T137S、T170I、V196T、N204H、Y207L和L226M突變，尤其是在抗體識別關(guān)鍵點N77G和Y207L的突變可能會影響PCV2 產(chǎn)生中和抗體的能力[33]。此外，所有基因型毒株Cap蛋白唯一的糖基化位點NYS(143-145位氨基酸)非常保守，未發(fā)生變異。目前，國內(nèi)豬場為防控PCV2 感染接種的商品化疫苗多基于PCV2a和PCV2b基因型而研制，其是否會對新出現(xiàn)的PCV2e起到交叉保護作用，尚需深入研究。

4 結(jié) 論

我國東南地區(qū)豬場PCV2感染非常普遍，PCV2d為優(yōu)勢基因型，出現(xiàn)了新基因型PCV2e，但其檢出率較低。部分豬場存在2個以上的毒株，應(yīng)引起豬場高度重視，本研究為PCVAD的防控提供了參考依據(jù)。