許 靜，李 晶，張雨溪

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安710065)

杏樹(shù)是一種宜林宜果的果樹(shù)，不僅能起到抵御風(fēng)沙、保護(hù)農(nóng)田、改善環(huán)境的生態(tài)作用，其果實(shí)還具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。杏樹(shù)在我國(guó)主要分布在東北、華北和西北地區(qū)，其中，陜西杏樹(shù)栽培面積約有 10.7 萬(wàn)hm2，是全國(guó)第三大產(chǎn)區(qū)[1-3]。

流膠病是杏樹(shù)最主要的病害之一，流行范圍廣泛，輕者引起杏減產(chǎn)，重者可造成絕收，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。杏樹(shù)流膠病可分為生理性流膠和侵染性流膠2種，其中生理性流膠主要由蟲(chóng)傷、切口等機(jī)械性傷口引起，而侵染性流膠則是由輪枝孢菌、葡萄座腔菌等真菌侵染造成[4-6]。流膠主要發(fā)生在杏樹(shù)的枝干上，在病害處流出透明的樹(shù)膠，與空氣接觸后，樹(shù)膠逐漸變成褐色，成為晶瑩柔軟的膠塊，最后變成深褐色硬質(zhì)膠塊。此外，流膠處常呈腫脹狀，病部皮層及木質(zhì)部逐漸褐化腐朽，嚴(yán)重時(shí)可造成整株樹(shù)死亡[5,7]。其果實(shí)也會(huì)流膠, 多在有蟲(chóng)傷的傷口處發(fā)生, 樹(shù)膠糊在果面上, 導(dǎo)致果實(shí)停止生長(zhǎng)。該病在春季到秋季均可發(fā)生，每年5月下旬至6月中旬和8月下旬至9月中旬出現(xiàn)發(fā)病高峰[7]。流膠病的防治主要有以下方法：首先是農(nóng)業(yè)防治，包括及時(shí)清理果園移走感染源，及時(shí)排澇防旱減少發(fā)病條件，合理施肥以改善杏樹(shù)長(zhǎng)勢(shì)，適度修剪以減少傷口和病原侵入口[8-9]。其次是生物防治，楊艷敏[10]和Li等[11]分別篩選出1株對(duì)桃樹(shù)流膠病有較好防治效果的解淀粉芽孢桿菌；董施源等[12]從健康桃樹(shù)葉片中分離篩選到1株枯草芽孢桿菌，其對(duì)造成桃流膠病的可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)有較強(qiáng)的拮抗作用。再次，合理應(yīng)用病毒也是潛在的生防手段，Yang等[13]鑒定了一種可感染葡萄座腔菌的正義單鏈RNA病毒。最后是化學(xué)防治，將病部流膠和潰爛組織刮除干凈后，用殺菌劑涂抹傷口，也可進(jìn)行噴灑或灌根處理[7-8]。但目前最有效、最直接和最穩(wěn)定的防治方法還是依賴于殺菌劑的化學(xué)防治。

近幾年流膠病在陜西周至杏樹(shù)果園廣泛流行，對(duì)果農(nóng)造成較大經(jīng)濟(jì)損失，但其病因尚不明確。因此，本研究通過(guò)對(duì)發(fā)病果園內(nèi)杏樹(shù)流膠病枝取樣，用組織培養(yǎng)法進(jìn)行病原菌的分離純化，采用形態(tài)學(xué)和ITS序列分析法進(jìn)行病原菌鑒定，再用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定3種市面常用殺菌劑對(duì)該病菌的抑制作用，以期為該病的診斷和田間有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與純化

從陜西周至杏李研究所采集有流膠病癥的杏樹(shù)枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，自來(lái)水沖洗后用體積分?jǐn)?shù)75%酒精擦拭表面，用滅菌解剖刀切成小塊后置于PDA平板中心，25 ℃培養(yǎng)，定期觀察菌落生長(zhǎng)情況并及時(shí)轉(zhuǎn)接新的PDA平板進(jìn)行純化，得到分離病原菌的純培養(yǎng)。

1.2 病原菌的致病性測(cè)定

取幼嫩健康的杏樹(shù)枝條，用體積分?jǐn)?shù)75%酒精進(jìn)行表面消毒后，切成9 cm枝條段，用無(wú)菌解剖刀小心刮掉表皮，露出木質(zhì)層。用滅菌的直徑9 mm打孔器從培養(yǎng)4 d的PDA平板上取帶有新鮮菌絲的菌餅，有菌絲一面貼緊枝條傷口處，覆蓋吸有無(wú)菌水的無(wú)菌脫脂棉，用封口膜固定。將接種后的枝條放入裝有100 mL無(wú)菌水的組培瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中(溫度25 ℃，光照周期16 h/8 h，相對(duì)濕度70%)培養(yǎng)6 d，每天更換培養(yǎng)枝條用水，以無(wú)菌的純PDA培養(yǎng)基瓊脂塊接種為對(duì)照，定期觀察病癥發(fā)展情況。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 將分離純化的菌株接種于PDA平板中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察菌落顏色、表面紋飾、形態(tài)與質(zhì)地，描述其培養(yǎng)特征。將菌株接種在水瓊脂培養(yǎng)基上，光照條件下培養(yǎng)2周后在顯微鏡(Nikon)下觀察其分生孢子形態(tài)。

1.3.2 ITS序列分析 收集長(zhǎng)滿平板的新鮮菌絲，用天根公司植物全基因組抽提試劑盒提取總DNA，然后使用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：ITS1 和ITS4各1 μL,2×PCR Mix(天根公司) 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次；最后72 ℃延伸10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并將擴(kuò)增后的ITS片段送至上海生工生物股份有限公司測(cè)序。

將獲得的ITS序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)，根據(jù)序列覆蓋率確定該菌所屬種類，然后用MEGA軟件通過(guò)鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.4 病原菌對(duì)3種藥劑的敏感性測(cè)定

1.4.1 供試藥劑 供試3種藥劑分別為：70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(山東百農(nóng)思達(dá)生物科技有限公司),2.6%靚果安水劑(主要成分為生物堿和梔子甙，山東濰坊奧豐作物病害防治有限公司),2%潰腐靈水劑(主要成分為蒼術(shù)素和厚樸酚，山東濰坊奧豐作物病害防治有限公司)。

1.4.2 含藥培養(yǎng)基的制備 配制含藥培養(yǎng)基時(shí)，3種藥劑均設(shè)置6個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度有10個(gè)平板，3次重復(fù)。其中70%甲基硫菌靈可濕性粉劑先用無(wú)菌水溶解后再按比例加入培養(yǎng)基，終質(zhì)量濃度分別為0.25，0.5，1，2，4，8 μg/mL；2.6%靚果安水劑直接按比例加入PDA培養(yǎng)基中倒平板，終質(zhì)量濃度分別為10.835，21.67，43.3，86.7，173.3，520 μg/mL；2%潰腐靈水劑直接按比例加入PDA培養(yǎng)基，終質(zhì)量濃度分別為10.45，20.83，41.67，166.67，666.7，20 000 μg/mL。以不加藥的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.4.3 敏感性的測(cè)定 將分離得到的病原菌轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，用直徑4 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，轉(zhuǎn)接到含藥和對(duì)照平板中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)照平板基本長(zhǎng)滿菌絲，采用十字交叉法測(cè)量各平板上的菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率(抑制率=(對(duì)照菌落直徑-含藥菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%)。用SPSS 23對(duì)不同處理的菌落直徑進(jìn)行差異顯著性分析。將藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換為以10為底的對(duì)數(shù)值(X)，菌絲生長(zhǎng)抑制率轉(zhuǎn)換為概率值(Y)，通過(guò)Excel軟件對(duì)藥劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值和菌絲生長(zhǎng)抑制率概率值進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算各藥劑對(duì)病原菌的半最大效應(yīng)濃度(concentration of 50% of maximal effect,EC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏樹(shù)流膠病病原菌分離物SXZZ的致病性

用實(shí)驗(yàn)室人工接種分離的杏樹(shù)流膠病病原菌病原菌(編號(hào)為SXZZ)接種健康杏樹(shù)枝條3 d后，接種部位呈黑褐色，有少許白色或灰白色菌絲生長(zhǎng)；6 d后接種處呈黑色并開(kāi)始出現(xiàn)流膠癥狀；對(duì)照枝條僅傷口處略呈深褐色，無(wú)菌絲生長(zhǎng)或流膠癥狀(圖1)。用接種后發(fā)病的枝條重新進(jìn)行病原菌分離純化，得到的病原菌菌落形態(tài)和分生孢子與接種所用的病原菌完全一致，根據(jù)柯赫氏法則，可以確定分離得到的病原菌就是引起杏樹(shù)流膠病的病原菌。

A.對(duì)照枝條；B.接種SXZZ 3 d后的枝條；C.接種SXZZ 6 d后的枝條A.Control twig;B.Twig inoculated with SXZZ for 3 d; C.Twig inoculated with SXZZ for 6 d圖1 杏樹(shù)流膠病病原菌SXZZ的致病性觀察Fig.1 Evaluation of the pathogenicity of the apricot gummosis pathogen SXZZ

2.2 杏樹(shù)流膠病病原菌分離物SXZZ的形態(tài)特性

杏樹(shù)流膠病病原菌分離物SXZZ在PDA平板上菌落為圓形，菌絲為絨毛狀，培養(yǎng)初期菌落呈白色或灰白色(圖2-A)，隨后逐漸變?yōu)榛疑僚囵B(yǎng)后期呈黑色(圖2-B)。在顯微鏡下觀察，菌絲無(wú)色有隔(圖2-C)；分生孢子紡錘形，無(wú)色，單孢，基部鈍圓，頂部稍尖(圖2-D)。根據(jù)病原菌形態(tài)特征，參照葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)真菌相關(guān)文獻(xiàn)，初步鑒定其為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)。

A.培養(yǎng)4 d后的菌落形態(tài)；B.培養(yǎng)2周后的菌落形態(tài)；C.菌絲形態(tài)；D.分生孢子形態(tài)A.Colony morphology after 4 days culture;B.Colony morphology after 2 weeks culture; C.Mycelium morphology;D.Conidia morphology

2.3 杏樹(shù)流膠病病原菌分離物SXZZ的ITS序列分析

對(duì)杏樹(shù)流膠病病原菌分離物SXZZ的通用引物PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將獲得的序列上傳至GenBank(序列登錄號(hào)為MW250225)， Blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其與葡萄座腔菌的同源性高達(dá)99%(圖3)。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，可以確定陜西周至地區(qū)杏樹(shù)流膠病病原菌為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，其分類地位為子囊菌門腔菌綱格孢腔菌目葡萄座腔菌科葡萄座腔菌屬。

圖3 杏樹(shù)流膠病病原菌分離物SXZZ的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of apricot gummosis pathogen SXZZ

2.4 杏樹(shù)流膠病病原菌對(duì)3種藥劑的敏感性

甲基硫菌靈、靚果安和潰腐靈為市面常用的防治果樹(shù)流膠病的3種藥劑，為探究其能否用于防治由葡萄座腔菌引起的杏樹(shù)流膠病，本研究測(cè)定了這3種藥劑對(duì)杏樹(shù)流膠病病原菌的抑制作用，并計(jì)算了相應(yīng)EC50值，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，與對(duì)照組相比，甲基硫菌靈質(zhì)量濃度為1 μg/mL時(shí)能顯著抑制杏樹(shù)流膠病病原菌菌絲生長(zhǎng)，其EC50為2.831 5 μg/mL；而靚果安和潰腐靈分別在質(zhì)量濃度達(dá)到86.7和20.83 μg/mL時(shí)，才能顯著抑制杏樹(shù)流膠病病原菌菌絲的生長(zhǎng)，且抑制率較低，二者的EC50非常高。這說(shuō)明甲基硫菌靈對(duì)葡萄座腔菌菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，但靚果安和潰腐靈的抑制效果較差，即該菌對(duì)靚果安和潰腐靈不敏感。

表1 杏樹(shù)流膠病病原菌對(duì)3種藥劑的敏感性Table 1 Susceptibility of apricot gummosis pathogen to three fungicides

3 討論與結(jié)論

流膠病是杏樹(shù)最主要的病害之一，可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究采集有流膠病癥的杏樹(shù)枝條，分離純化得到分離物的純培養(yǎng)，根據(jù)分離物的致病性，其菌落、菌絲和分生孢子的形態(tài),以及ITS序列分析結(jié)果，認(rèn)為引起陜西周至地區(qū)杏樹(shù)流膠病的病原菌為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，其分類地位為子囊菌門腔菌綱格孢腔菌目葡萄座腔菌科葡萄座腔菌屬。這與Li等[14]報(bào)道的浙江省杏樹(shù)流膠病病原菌一致。

葡萄座腔菌屬真菌分布廣泛、寄主多樣，是農(nóng)林業(yè)上重要的病原菌或內(nèi)生菌，尤其是葡萄座腔菌可在桃、杏、櫻桃、核桃、柳樹(shù)、橡樹(shù)、桉樹(shù)等45個(gè)屬的木本植物上引起潰瘍、枯梢、葉斑病、花果腐爛枯萎等病害，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[15-18]。目前對(duì)于葡萄座腔菌引起的植物病害主要依賴化學(xué)防治，即噴灑、涂抹或灌根各種殺菌劑，主要有氟硅唑、撲海因、多菌靈、三唑類殺菌劑和有機(jī)氯類殺菌劑等[19-28]。研究表明，甲基硫菌靈在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)葡萄腔座菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)都有很好的抑制效果，在田間試驗(yàn)中也有較好的防治效果，但其對(duì)不同菌株的敏感性有所差異[24-29]。另外，靚果安和潰腐靈也是市面常見(jiàn)的用于防治流膠病的藥劑，也曾被報(bào)道可用于防治葡萄座腔菌引起的果樹(shù)流膠病[5]。本研究通過(guò)測(cè)試這3種藥劑對(duì)陜西周至地區(qū)杏樹(shù)流膠病病原菌的抑制效果發(fā)現(xiàn)，甲基硫菌靈對(duì)該菌株有較好的抑制作用，因此針對(duì)陜西周至地區(qū)杏樹(shù)流膠病的防治可采用甲基硫菌靈噴霧或傷口涂抹等處理；靚果安和潰腐靈雖然在高質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)有一定抑制作用，但結(jié)合EC50值來(lái)看，其抑制效果不佳，但這2種藥劑的有效成分均為植物源生物堿，除了對(duì)病原菌生長(zhǎng)有直接影響外，此類化合物還可促進(jìn)植物的生理生長(zhǎng)[30]，所以不排除靚果安和潰腐靈可以促進(jìn)杏樹(shù)長(zhǎng)勢(shì)，從而增強(qiáng)其對(duì)流膠病抵抗性的可能。在后續(xù)研究中，將進(jìn)行活體試驗(yàn)以驗(yàn)證這一推測(cè)。