張炳森，趙澤安，李詠梅，李 璐，藍(lán)群盛，龐建新，吳 婷

（南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 廣東廣州 510515）

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是以血清尿酸的（Uric Acid，UA）水平異常升高為特征，由嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致的慢性代謝性疾病[1-2]。機(jī)體內(nèi)的嘌呤化合物及從外界攝取的嘌呤經(jīng)黃嘌呤氧化酶等酶的作用，最終分解為尿酸[3-4]。尿酸在體內(nèi)經(jīng)多種轉(zhuǎn)運蛋白作用完成體內(nèi)尿酸的轉(zhuǎn)運，如尿酸分泌轉(zhuǎn)運蛋白、尿酸重吸收轉(zhuǎn)運蛋白[5-6]等，最終維持機(jī)體尿酸的穩(wěn)態(tài)。機(jī)體每天產(chǎn)生的尿酸有70%由腎臟排出，其中主要負(fù)責(zé)腎臟尿酸重吸收的轉(zhuǎn)運蛋白是位于腎臟頂端的尿酸鹽轉(zhuǎn)運體 1（urate transporter 1，URAT1）[7]與位于底端的葡萄糖轉(zhuǎn)運體9（glucose transporter 9，GLUT9）[8-9]，若這些轉(zhuǎn)運體出現(xiàn)異常，引起體內(nèi)尿酸生成過多和（或）排泄減少，進(jìn)而導(dǎo)致高尿酸血癥。高尿酸是導(dǎo)致痛風(fēng)最重要的生化基礎(chǔ)，當(dāng)血尿酸濃度超過飽和濃度，尿酸則會以尿酸鹽晶體形式析出，可直接沉積于關(guān)節(jié)及周圍軟組織、腎臟等，造成組織病理學(xué)改變[10]。

目前臨床治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的藥物療效有限，且能誘發(fā)各種不良反應(yīng)，如導(dǎo)致過敏性反應(yīng)[11]、心血管事件[12]、爆發(fā)性肝炎[13]等，對機(jī)體造成不同程度的損傷。因此，亟需尋找更有效、更安全的食品或者藥物來降低高尿酸血癥和痛風(fēng)發(fā)生的風(fēng)險。由于食療具有安全性高、不良反應(yīng)少、更受患者喜愛等優(yōu)點，目前已有研究人員探究了青梅[14]、茶葉[15]、葛根[16]等提取物在改善高尿酸血癥和痛風(fēng)中的作用。此外，人們也通過調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)，如限制嘌呤攝入、避免飲酒及多食以新鮮蔬菜、水果為主的堿性食品來防治高尿酸血癥或痛風(fēng)[17]。

橄欖果汁凍干粉富含多酚類抗氧化劑，商品名為Hidrox?12%，由美國CREAGRI公司研制，是獲得美國FDA安全認(rèn)證（GRAS認(rèn)證）的橄欖果食品原料。研究表明，橄欖多酚在心血管健康和其他炎癥相關(guān)性疾病如關(guān)節(jié)炎中起著抗炎作用[18-19]，其對高尿酸血癥作用的研究也有報道[20]，但主要研究其抑制黃嘌呤氧化酶（XOD）活性方面，目前并無文獻(xiàn)報道其降尿酸的其他機(jī)制與抗痛風(fēng)作用。本文研究了橄欖果汁凍干粉對高尿酸血癥大鼠的降尿酸作用和緩解痛風(fēng)性大鼠的關(guān)節(jié)腫脹作用，并探究其可能的機(jī)制，為橄欖果汁凍干粉在食品中的實際應(yīng)用提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級SD雄性大鼠（體重280±20 g） 南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK 2016-0041，倫理批準(zhǔn)號：L2018050，大鼠放置鼠籠中飼養(yǎng)，溫度：23±2 ℃，相對濕度 50%～70%，室內(nèi)光照時間為12 h日夜循環(huán)交替條件下飼養(yǎng)；橄欖果汁凍干粉（Hidrox?12%） 美 國 CREAGRI； 別 嘌 呤 醇（allopurinol，AP）、尿酸（uric acid，UA）、雷西納德（Lesinurad） 美國Sigma公司；秋水仙堿片（colchicine tablets，Col） 昆明制藥廠；氧嗪酸鉀（potassium oxazinate，PO）、羥基酪醇、原兒茶酸、香草酸、咖啡酸、香豆酸、胡椒堿、橄欖苦苷、木犀草素 上海阿拉丁生物有限公司；尿酸（UA）、肌酐（creatinine，CR）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測定試劑盒美國BioAssay Systems公司；黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；抗URAT1、GAPDH抗體 愛必信（上海）生物科技有限公司；BCA試劑盒 美國Thermo Fisher公司；HEK-293T細(xì)胞、pcDNA3.1（+）-T2AEGFP質(zhì)粒 本實驗保存；培養(yǎng)基、胎牛血清 美國Hyclone公司；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑 美國Invitrogen公司；14C-尿酸 美國ARC公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）與白介素 1β（IL-1β）ELISA 測定試劑盒 武漢JYMBIO。

Mill-iQ型純水系統(tǒng) 美國Millipore；Sigma 3K30高速低溫離心機(jī) 德國Sigma；Infinite M200型酶標(biāo)儀 瑞士TECAN；FluorChem R化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng) 美國ProteinSimple；足趾腫脹儀 成都泰盟；Micro Beta2液體閃爍/化學(xué)發(fā)光檢測儀 美國Perkin-Elmer；UPLC-ESI-MS/MS 美國 Thermo Fisher。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠高尿酸血癥模型制備與給藥 高尿酸血癥大鼠模型的制備參考文獻(xiàn)中的方法，并做適當(dāng)調(diào)整[21-22]。具體方法：稱取適量PO溶于0.5%羧甲基纖維素鈉（sodium carboxyl methyl cellulose，CMCNa）并超聲30 min使其充分混懸，制成300 mg/kg PO混懸液。40只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對照組、模型組、別嘌呤醇組（20 mg/kg）、橄欖果汁凍干粉低劑量組（40 mg/kg）和橄欖果汁凍干粉高劑量組（80 mg/kg），每組8只動物。造模前，給橄欖果汁凍干粉處理組大鼠分別灌胃不同劑量橄欖果汁凍干粉（溶于0.9%生理鹽水），每天早上9點灌胃1次，持續(xù)7 d。第8 d開始早上8點，除正常組給予CMC-Na，其余各組均腹腔注射PO溶液，持續(xù)7 d。造模1 h后除空白組和模型組以等體積溶劑灌胃外，各給藥組分別給以相應(yīng)藥物灌胃（整個實驗共持續(xù)14 d）。第14 d末次給藥后1 h，眼眶采血后處死大鼠，血樣室溫靜置40 min后進(jìn)行離心（3000 ×g，15 min，室溫）并分離出血清。腎臟與肝臟組織在冰上快速分離，并保存于-80 ℃，待測。

1.2.2 大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型制備與給藥 尿酸鈉晶體（Monosodium Urate，MSU）的制備參考文獻(xiàn)報道的方法[23]。具體方法：將0.5 g氫氧化鈉與1 g尿酸加入100 mL雙蒸水中，于80 ℃水浴鍋中加熱20 min，獲得澄清溶液，并用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至約7.2，再置于4 ℃過夜冷卻，可見大量晶體析出。將獲得的晶體溶液進(jìn)行離心（1500 ×g，5 min，室溫），棄去上清，于真空干燥箱中充分干燥獲得晶體，分裝并稱重。使用前用適量磷酸鹽緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）溶液溶解并進(jìn)行滅菌處理。

40只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對照組、模型組、秋水仙堿組（0.3 mg/kg）、橄欖果汁凍干粉低劑量組（40 mg/kg）和橄欖果汁凍干粉高劑量組（80 mg/kg），每組8只動物。造模前，給橄欖果汁凍干粉兩組大鼠分別灌胃不同劑量橄欖果汁凍干粉（溶于0.9%生理鹽水），持續(xù)28 d。從第25 d開始，給秋水仙堿組大鼠灌胃秋水仙堿（用研缽充分研碎后溶于0.9%生理鹽水）。第27 d給藥后，用6號針在正常組大鼠右腳踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.2 mL PBS溶液，其余組均注射0.2 mL MSU溶液（25 mg/mL）。在MSU注射前，后8、12、24 h分別測定各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度（評價指標(biāo)為注射MSU后各時間點的容積減去注射MSU前容積）。末次給藥后，進(jìn)行眼眶取血并處死大鼠。按1.2.1所述處理血清樣品。

1.2.3 指標(biāo)分析 按照說明書方法，用相應(yīng)的試劑盒分別測定1.2.1中血清的UA、CR和BUN水平，測定血清與肝臟XOD活性，并測定1.2.2所得血清中的TNF-α與IL-1β水平。

1.2.4 Western Blot測定腎臟URAT1蛋白表達(dá)水平利用蛋白提取試劑盒提取大鼠腎臟組織總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白含量。取40 μg總蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠分離；使用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)模；將膜在5%的脫脂奶粉溶液封閉2 h；分別加入URAT1一抗（1:1000）、GAPDH一抗（1:1000）后在 4 ℃ 條件下孵育過夜；用TBST洗3次后，對應(yīng)加入二抗于室溫孵育2 h；TBST洗膜后用ECL顯色。掃描后使用Image J軟件分析條帶灰度值[24]。

1.2.5 超高效液相色譜-電噴霧/四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-ESI-MS/MS）分析橄欖果汁凍干粉成分 本實驗中的UPLC-ESI-MS/MS系統(tǒng)由ACQUITY I-Class UPLC和Q Exactive? Plus MS組成，利用該設(shè)備分離并鑒定橄欖果汁凍干粉中的成分。其具體參數(shù)為：色譜柱為 ACQUITYUPLC?CSH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為 0.1% 甲酸水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脫程序為：30 min內(nèi)B相比例從0%升至100%，30～35 min將B相比例降為0%，并維持5 min，整個運行時間持續(xù)40 min。流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣體積為5 μL，柱溫與進(jìn)樣器溫度分別為35與4 ℃。質(zhì)譜檢測器為電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式，離子源溫度350 ℃，輔助加熱器溫度350 ℃；噴射電壓3.0 kV，碰撞氣：氮氣。掃描質(zhì)量范圍 m/z 80～200。

1.2.6 橄欖果汁凍干粉成分對URAT1轉(zhuǎn)運14C-尿酸的活性測定 為檢測1.2.5中分離鑒定出的成分的降尿酸活性，通過14C-尿酸吸收實驗檢測化合物對URAT1轉(zhuǎn)運尿酸的影響，具體方法參考本課題組前期發(fā)表文章[13,25]。將HEK-293T細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并放于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，將HEK-293T細(xì)胞接種到包被了多聚賴氨酸的24孔板，培養(yǎng)24 h后，將pcDNA3.1（+）-EGFP-hURAT1 質(zhì)粒進(jìn)行 DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物瞬時轉(zhuǎn)染，18 h后分別加入1.2.5分析確定的化合物成分：羥基酪醇、原兒茶酸、香草酸、咖啡酸、香豆酸、胡椒堿、橄欖苦苷和木犀草素八個單體進(jìn)行14C-尿酸吸收實驗。向孔內(nèi)加入37 ℃預(yù)熱的尿酸吸收緩沖液500 μL潤洗細(xì)胞，再加入等量的緩沖液在37 ℃孵育10 min，棄液后加入含25 μmol/L14C-尿酸的尿酸吸收緩沖液，吸收12 min后棄液，再依次加入500、700 μL、1 mL冰冷的DPBS洗三次，棄液后加入0.1 mol/L NaOH裂解液100 μL，室溫裂解 20 min，加入 1 mL閃爍液，用振蕩儀振蕩15 min，使用液體閃爍計數(shù)儀測定放射值（CPM），重復(fù)測定三次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖果汁凍干粉對高尿酸血癥大鼠血清UA、CR與BUN水平的影響

如表1所示，造模7 d后模型組大鼠血清UA與空白組相比高度顯著增加（P＜0.001），表明大鼠高尿酸血癥模型造模成功；橄欖果汁凍干粉（80 mg/kg）能極顯著降低大鼠血清UA水平（P＜0.01）。

血清CR與BUN是臨床評估腎臟損傷的常用指標(biāo)，腎臟受損會伴隨兩者水平升高。由表1可得，與空白組相比，造模7 d后模型組大鼠血清CR與BUN水平高度顯著和極顯著升高（P＜0.001和P＜0.01）；而與模型組相比，橄欖果汁凍干粉給藥2周的大鼠兩者水平明顯降低，表明橄欖果汁凍干粉具有一定的腎臟保護(hù)作用；與模型組比較，陽性藥AP雖能高度顯著降低高尿酸血癥大鼠血清UA水平（P＜0.001），但持續(xù)使用1周后加重其CR與BUN水平（P＜0.05和P＜0.01），表明持續(xù)使用AP可能對腎臟產(chǎn)生損傷，與文獻(xiàn)報道相符[26-27]。

表1 橄欖果汁凍干粉對氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥大鼠血清UA、CR與BUN水平的影響Table 1 Effects of olive juice freeze dried powder on the serum UA , CR and BUN levels in PO-induced hyperuricemic rats

2.2 橄欖果汁凍干粉對高尿酸血癥大鼠血清與肝臟XOD活性的影響

XOD是體內(nèi)尿酸生成的關(guān)鍵酶，體內(nèi)XOD活性受到抑制可減少體內(nèi)尿酸的生成。如表2所示，與空白組相比，模型組中血清和肝臟XOD活性極顯著和高度顯著升高（P＜0.01和P＜0.001）；而與模型組比較，陽性藥AP與橄欖果汁凍干粉（80 mg/kg）能高度顯著降低高尿酸血癥大鼠血清與肝臟XOD活性（P＜0.001）。

表2 橄欖果汁凍干粉對高尿酸血癥大鼠血清與肝臟XOD活性的影響Table 2 Effects of olive juice freeze dried powder on serum and hepatic XOD activities in PO-induced hyperuricemic rats

2.3 橄欖果汁凍干粉對高尿酸血癥大鼠腎臟尿酸重吸收轉(zhuǎn)運體URAT1蛋白表達(dá)水平的影響

如圖1所示，與空白組相比，模型組腎皮質(zhì)URAT1蛋白表達(dá)水平高度顯著增加（P＜0.001）；與模型組相比，橄欖果汁凍干粉（80 mg/kg）則能高度顯著下調(diào)URAT1蛋白表達(dá)水平（P＜0.001），提示橄欖果汁凍干粉可能通過抑制URAT1轉(zhuǎn)運蛋白活性，減少尿酸重吸收，促進(jìn)尿酸排泄，最終降低其血清UA水平。

圖1 橄欖果汁凍干粉對高尿酸血癥大鼠腎皮質(zhì)URAT1蛋白表達(dá)水平的影響Fig.1 Effects of olive juice freeze dried powder on the protein expression of URAT1 in the kidney cortex tissues

2.4 橄欖果汁凍干粉對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、血清TNF-α與IL-1β水平的影響

如圖2 A所示，與空白組相比，右腳踝關(guān)節(jié)注射MSU晶體后的8、12和24 h，模型組的關(guān)節(jié)出現(xiàn)高度顯著腫脹（P＜0.001），其中模型組12 h時腫脹度最明顯；而與模型組比較，給藥組大鼠右腳踝關(guān)節(jié)的腫脹情況均出現(xiàn)了不同程度的緩解，其中橄欖果汁凍干粉（80 mg/kg）在8 h時便能極顯著緩解其腫脹癥狀（P＜0.01），緩解作用在 24 h 時最強(qiáng)（P＜0.001），且其緩解效果優(yōu)于陽性藥秋水仙堿。

根據(jù)文獻(xiàn)報道，使用MSU刺激關(guān)節(jié)會引起各種致炎癥因子（如 TNF-α、IL-8 和 IL-1β）的產(chǎn)生，從而引起急性炎癥反應(yīng)[28-29]。目前，痛風(fēng)的臨床治療主要依賴于降低血尿酸水平和控制炎癥反應(yīng)。由圖2B與2C可得，與空白組比較，模型組血清中TNF-α和IL-1β水平極顯著升高（P＜0.01）；而與模型組相比，陽性藥秋水仙堿和橄欖果汁凍干粉給藥組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平均出現(xiàn)了不同程度的降低，其中橄欖果汁凍干粉組對降低血清IL-1β水平與秋水仙堿相當(dāng)，表明其在一定程度能改善MSU誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。

圖2 橄欖果汁凍干粉對MSU誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠右踝關(guān)節(jié)腫脹度（A）、血清 TNF-α（B）與 IL-1β（C）水平的影響Fig.2 Effects of olive juice freeze dried powder on paw swelling(A) as well as serum TNF-α(B) and IL-1β (C)levels in MSU-induced rats

2.5 UPLC-ESI-MS/MS檢測橄欖果汁凍干粉成分

如圖3和表3所示，根據(jù)其保留時間、質(zhì)量數(shù)和質(zhì)量碎片數(shù)據(jù)及與公開文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對[30-31]，鑒定出8種單體化合物，分別為羥基酪醇（1）、原兒茶酸（2）、香草酸（3）、咖啡酸（4）、香豆酸（5）、胡椒堿（6）、橄欖苦苷（7）和木犀草素（8）。

表3 UPLC-ESI-MS/MS鑒定橄欖果汁凍干粉中的活性化合物Table 3 Mass spectral characteristics and quantification of bioactive compounds detected in olive juice freeze dried powder by using UPLC-ESI-MS/MS

圖3 橄欖果汁凍干粉的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of olive juice freeze dried powder

2.6 橄欖果汁凍干粉對URAT1轉(zhuǎn)運尿酸活性的影響

8 個單體（50 μmol/L）對 URAT1 體外轉(zhuǎn)運尿酸活性如圖4所示，其中胡椒堿與木犀草素對URAT1有很強(qiáng)的抑制活性，能明顯抑制其轉(zhuǎn)運14C-尿酸，其 IC50值分別為 21.46和 23.42 μmol/L，與 URAT1抑制劑雷西納德活性相當(dāng)（16.09 μmol/L）。

圖4 胡椒堿與木犀草素對URAT1轉(zhuǎn)運尿酸的影響Fig.4 Effects of piperine and luteolin on uric acid transport by URAT1

3 討論與結(jié)論

尿酸是嘌呤分解的產(chǎn)物，機(jī)體內(nèi)約70%～80%的尿酸由體內(nèi)嘌呤化合物產(chǎn)生，還有20%～30%來源于飲食等外來因素[23]，因而，飲食控制在高尿酸血癥和痛風(fēng)的長期控制和治療過程中也占有重要的地位[32]。本研究從天然食品橄欖果汁凍干粉Hidrox?12%中發(fā)現(xiàn)其具有降尿酸及抗痛風(fēng)的作用。

機(jī)體尿酸的生成主要依賴于關(guān)鍵酶XOD，抑制XOD的活性可減少UA的生成[33]。本研究發(fā)現(xiàn)橄欖果汁凍干粉能夠顯著抑制血清和肝臟中的XOD活性，發(fā)揮降尿酸作用。雖然橄欖果汁凍干粉的降尿酸作用不及AP，但進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，與AP組相比，其能夠明顯降低高尿酸血癥大鼠中血清CR和BUN水平，表明其具有腎臟保護(hù)作用[34]，能夠減少目前臨床用藥中出現(xiàn)的腎損害等不良反應(yīng)。

腎臟是尿酸重吸收與分泌的主要調(diào)節(jié)器官，其依賴于腎臟中多種藥物轉(zhuǎn)運體如URAT1的作用[35-36]。大鼠體內(nèi)研究表明，橄欖果汁凍干粉可下調(diào)URAT1蛋白表達(dá)水平，抑制尿酸重吸收，促進(jìn)尿酸鹽的排泄，從而降低實驗動物的血尿酸水平。體內(nèi)尿酸水平高于溶解溶度時，會形成的MSU晶體沉積在關(guān)節(jié)中，誘發(fā)細(xì)胞炎癥因子（如IL-1β和TNF-α）的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致急性炎癥。因此，抑制炎癥反應(yīng)是治療痛風(fēng)的另一個途徑[10]。本研究同時發(fā)現(xiàn)，橄欖果汁凍干粉可以緩解MSU引起的關(guān)節(jié)腫脹，同時降低血清中IL-1β和TNF-α的水平，從而改善痛風(fēng)。

為尋找橄欖果汁凍干粉中能有效作用于URAT1的成分，本研究進(jìn)一步對其進(jìn)行活性化合物的分離與鑒定。實驗結(jié)果表明，它主要包含8種單體，其中胡椒堿與木犀草素在50 μmol/L時能在體外有效抑制URAT1的尿酸轉(zhuǎn)運活性，這也是本研究首次發(fā)現(xiàn)兩者具有URAT1抑制活性，為橄欖果汁凍干粉的降尿酸作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)橄欖果汁凍干粉具有較好的降尿酸作用，并與抑制XOD活性、減少UA生成、降低腎臟URAT1蛋白表達(dá)、促進(jìn)UA排泄有關(guān)。同時，橄欖果汁凍干粉還能明顯改善MSU晶體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)腫脹，降低大鼠體內(nèi)炎癥因子水平來發(fā)揮抗痛風(fēng)的作用。本研究為將橄欖果汁凍干粉開發(fā)為新的降尿酸/抗痛風(fēng)食品或食品添加劑提供了理論依據(jù)。