岳慧敏，李海鑫，羅瑞平，趙 亮,4,

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院, 北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)（興化）健康食品產(chǎn)業(yè)研究院, 江蘇興化 225700；3.泰州安井食品有限公司, 江蘇興化 225700；4.食品質(zhì)量安全北京實(shí)驗(yàn)室, 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院, 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 北京 100083）

速凍肉糜類制品即我們熟知的“火鍋料制品”，是速凍調(diào)制食品中的一大類別，其主要原料為畜禽肉、水產(chǎn)品及其制品[1-3]。我國是速凍肉糜類制品產(chǎn)銷大國，其市場銷售規(guī)模由2010年160億元提升至2017年近273億元，復(fù)合年均增長率為8%[4]。隨著食物結(jié)構(gòu)和食物消費(fèi)的變化，速凍肉糜類制品市場規(guī)模還將不斷擴(kuò)大[5]。然而速凍肉糜類制品在加工過程熱處理強(qiáng)度低且儲(chǔ)運(yùn)過程需要冷鏈支持，具有較高的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是速凍肉糜類制品中的主要食源性致病菌，據(jù)調(diào)查顯示，此類產(chǎn)品的原料污染率高，生肉中單增李斯特菌檢出率為19.1%[8]，海產(chǎn)品中檢出率為31%[9]。在生產(chǎn)、食用過程中加熱不足則易存活，引發(fā)食物中毒[10-12]。因此開展單增李斯特菌的檢測對(duì)速凍肉糜類制品安全保障具有重要意義[13-15]。

目前我國常用的檢驗(yàn)方法是傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測法，該方法準(zhǔn)確度高，但其操作復(fù)雜，檢測時(shí)間長，檢測結(jié)果滯后性不能滿足食品中，尤其是加工環(huán)節(jié)樣本的單增李斯特菌的快速檢測和追溯[15-16]。因此需要建立一種速凍肉糜類制品中單增李斯特菌的快速檢測方法。檢測食品中單增李斯特菌的快速檢測方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）及相關(guān)改良方法等。其中，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification），簡稱LAMP，具有快速簡便、成本低、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[17-19]，已在食源性致病菌的快速檢測中得到廣泛應(yīng)用[20-25]。對(duì)于食品中單增李斯特菌的LAMP檢測，在乳制品[26]、生雞肉樣品中[27]已有報(bào)道，然而針對(duì)速凍肉糜類制品的研究甚少。作為一種速凍調(diào)理肉制品，其中復(fù)雜成分對(duì)增菌、DNA提取、后續(xù)LAMP反應(yīng)的影響尚不明確。本研究基于已建立的速凍肉糜類制品單增李斯特菌LAMP檢測技術(shù)基礎(chǔ)上，通過四種增菌培養(yǎng)基的比較，篩選出一種增殖效果最佳的增菌培養(yǎng)基，以降低LAMP方法的檢出限，并實(shí)現(xiàn)單增李斯特菌LAMP檢測方法在速凍肉糜類制品中的應(yīng)用，預(yù)期一個(gè)工作日完成檢測，以期為食品企業(yè)快速檢測速凍肉糜類制品中單増李斯特菌提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，F(xiàn)SCC 178006/ATCC 19115 ） 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、SYBR Green I （10000×）、6×DNA 電泳 Loading Buffer 北京天根生化科技有限公司；含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）、李氏菌增菌肉湯（LB1，LB2）基礎(chǔ)、Half-Fraser培養(yǎng)基、Fraser培養(yǎng)基

青島海博生物技術(shù)有限公司；Bst 2.0 DNA Polymerase（8000 U/mL）、dNTP Mixture、Gelred核酸染料、DEPC水 北京言必信科技有限公司；雞小胸原料、親親腸（速凍機(jī)入口處）、親親腸（速凍機(jī)出口處）、包心魚丸（速凍機(jī)入口處）、包心魚丸（速凍機(jī)出口處） 樣本采集自速凍肉糜類制品工廠生產(chǎn)線；速凍肉糜類樣品 具體采樣信息如表1所示。

表1 樣本種類及數(shù)量Table 1 Type and number of samples

1300 SERIES A2生物安全柜 美國Thermo Fisher Scientific公司；ZDX35BI自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-C恒溫振蕩器 江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱、DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Infinite?M200 Pro多功能酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；SILVER拍擊式均質(zhì)機(jī) 西班牙IUL公司；165-8001電泳儀、Sub-Cell?GT水平電泳槽 美國Bio-rad公司；ChampGel 5000全自動(dòng)凝膠成像儀 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將-80 °C保藏的甘油菌種用TSBYE液體培養(yǎng)基活化，于恒溫振蕩器中37 °C，220 r/min培養(yǎng)8 h，連續(xù)活化至第三代作為實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)液。

1.2.2 人工污染不同濃度菌液樣品的制備 用于人工污染的速凍肉糜類樣品經(jīng)GB 4789.30-2016檢測證實(shí)不含有單增李斯特菌。在生物安全柜中無菌操作，取速凍肉糜類樣品25 g加入到含225 mL的TSB-YE 液體培養(yǎng)基的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)機(jī)上連續(xù)均質(zhì)2 min，此溶液即為速凍肉糜類樣品均質(zhì)液。

依據(jù)國標(biāo)和ISO標(biāo)準(zhǔn)[28]，本實(shí)驗(yàn)選用LB1、LB2、Fraser和Half-Fraser四種增菌培養(yǎng)基作為篩選對(duì)象，將已知濃度的初始菌液（6.4×109CFU/mL）通過10倍梯度稀釋，首先制備濃度分別為6.4×104～6.4×102CFU/mL的菌液。

然后取上述不同濃度的初始菌液1 mL分別加入到9 mL速凍肉糜類樣品均質(zhì)液中，混合均勻后分別接種到 90 mL四種增菌培養(yǎng)基中，使增菌培養(yǎng)基中的菌液終濃度分別大于102CFU/mL（640 CFU/mL）、101CFU/mL（64 CFU/mL）、小于10 CFU/mL（6.4 CFU/mL），于恒溫振蕩器中 37 °C培養(yǎng)。

以O(shè)D600nm值和平板計(jì)數(shù)活菌數(shù)為檢測指標(biāo)，在2、4、6、8 h監(jiān)測目標(biāo)菌的生長情況。

1.2.3 基因組 DNA 提取 使用細(xì)菌基因組提取試劑盒（TIANGEN）提取DNA，按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 LAMP反應(yīng)操作程序 LAMP反應(yīng)體系：外引物：內(nèi)引物濃度比 1:4，Mg2+濃度為 6 mmol/L，dNTPs濃度 1.4 mmol/L，Bst DNA聚合酶濃度為800 U/mL，DNA 模板，無酶無菌水，體系 25 μL。選擇hly A基因作為靶基因[29]，引物序列如表2所示。

表2 LAMP引物序列[29]Table 2 Sequences of LAMP primers[29]

加入各反應(yīng)物于200 μL離心管中，混合均勻，在 61 °C 恒溫水浴鍋中反應(yīng) 40 min。取產(chǎn)物 5 μL與1 μL Loading Buffer混合均勻，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察特征性電泳圖譜，同時(shí)在產(chǎn)物中加入1 μL SYBR Green I熒光染料[30]，觀察顏色變化。

1.2.5 增菌時(shí)間的確定 當(dāng)接種量為64 CFU/mL時(shí)，在Half Fraser培養(yǎng)基增菌過程中，分別取0、2、4、6、8 h的菌液，提取DNA模板后，LAMP方法檢測，以電泳檢測出現(xiàn)梯形條帶及SYBR Green I 熒光染料呈現(xiàn)陽性綠色為檢測指標(biāo)，確定該方法的最短增菌時(shí)間。

1.2.6 增菌優(yōu)化前LAMP檢出限評(píng)價(jià) 將已知濃度的初始菌量（6.4×109CFU/mL）通過10倍梯度稀釋，使菌液濃度分別為 6.4×109～6.4×101CFU/mL，分別污染到速凍肉糜類樣品中，模擬食物中的初始菌量分別為6.4×109～6.4×101CFU/g，分別提取其基因組DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否產(chǎn)生梯形條帶，同時(shí)進(jìn)行SYBR Green I顏色反應(yīng)，探究增菌優(yōu)化前LAMP方法的檢出限。

1.2.7 增菌優(yōu)化后LAMP檢出限評(píng)價(jià) 將已知濃度的初始菌量（6.4×109CFU/mL）通過10倍梯度稀釋，使菌液濃度分別為 6.4×108～6.4×100CFU/mL，分別污染到速凍肉糜類樣品中，模擬食物中的初始菌量分別為 6.4×108～6.4×100CFU/g。再分別接種于增菌培養(yǎng)基中（依據(jù)國標(biāo)，樣品與增菌培養(yǎng)基比例按1:9添加），均質(zhì)后于37 °C增菌6 h，分別提取其基因組DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否產(chǎn)生梯形條帶，同時(shí)進(jìn)行SYBR Green I顏色反應(yīng)，探究增菌優(yōu)化后LAMP方法的檢出限。

1.2.8 人工污染速凍肉糜類盲樣檢測 從市場隨機(jī)采樣，購買速凍肉丸10份，速凍魚丸10份，速凍香腸制品10份，共計(jì)30份。“火鍋料制品”種類繁多，包括牛肉丸、香菇貢丸、包心魚丸、親親腸等，按產(chǎn)品主要原料及加工工藝將其主要分為三類，即速凍肉丸、速凍魚丸、速凍香腸制品。30份樣品經(jīng)GB 4789.30-2016檢測，均不含單增李斯特菌，為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP方法的準(zhǔn)確度，人工污染10份樣品（污染濃度和數(shù)量分別為：6.4×101CFU/g 三份樣品，6.4×102CFU/g 三份樣品，6.4×103CFU/g四份樣品）后隨機(jī)混合制成盲樣，分別用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和LAMP方法重新檢測這30份樣品。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法按照 GB 4789.30-2016[15]進(jìn)行操作。LAMP方法檢測按照無菌操作，取速凍肉糜類樣品25 g，放入無菌均質(zhì)袋，加入225 mL Half-Fraser增菌液，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)2 min，于恒溫振蕩器中37 °C增菌6 h，用試劑盒提取DNA模板。LAMP反應(yīng)體系按照1.2.4操作。

1.2.9 企業(yè)生產(chǎn)線樣本檢測 某食品企業(yè)提供生產(chǎn)線樣本30份，包括雞小胸原料、親親腸（速凍機(jī)入口處）、親親腸（速凍機(jī)出口處）、包心魚丸（速凍機(jī)入口處）、包心魚丸（速凍機(jī)出口處）。分別用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和LAMP方法進(jìn)行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用單因素方差分析（one way ANOVA）伴隨LSD多重比較，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為組間具有顯著性差異。之后使用Origin Pro軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 增菌培養(yǎng)基的選擇

2.1.1 不同接種量的菌在Half Fraser中的增菌情況如圖1所示，單增李斯特菌的增菌效果與初始菌量有關(guān)系，初始菌量越大，生長速度越快。使用SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one way ANOVA）分析，當(dāng)接種量為640 CFU/mL時(shí)，生長至4 h，其OD值為0.49，與初始菌量有顯著性差異（P＜0.05）；當(dāng)接種量為 64 CFU/mL 時(shí)，生長至 4 h，其OD值為0.38，與初始菌量差異不顯著（P＞0.05），增菌至 6 h，其 OD 值為 0.58，差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)接種量為6.4 CFU/mL時(shí)，與64 CFU/mL增殖情況類似，生長至6 h，其OD值為0.45，此時(shí)與初始菌量有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 不同接種量的菌在Half Fraser中的增菌情況Fig.1 Bacteria increase with different inoculation amounts in Half Fraser

2.1.2 不同接種量的菌在Fraser中的增菌情況 如圖2所示，與 Half Fraser對(duì)比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種量為640 CFU/mL時(shí)，生長至6 h，其OD值為0.47，此時(shí)與初始菌量有顯著性差異（P＜0.05）；當(dāng)接種量為64 CFU/mL時(shí)，增菌至6 h，其OD值為0.43，差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)接種量為 6.40 CFU/mL 時(shí)，需增菌至8 h，目標(biāo)菌才會(huì)有顯著性的生長情況（P＜0.05），此時(shí)OD值為0.48，初步判定Half Fraser增菌效果更好。通過對(duì)比兩種增菌液培養(yǎng)基成分發(fā)現(xiàn)，Half Fraser和Fraser基本成分一致，后者的抑菌劑是前者的兩倍，高濃度的抑菌劑使目標(biāo)菌生長速度變慢。

圖2 不同接種量的菌在Fraser中的增菌情況Fig.2 Bacteria increase with different inoculation amounts in Fraser

2.1.3 不同接種量的菌在LB1中的增菌情況 如圖3所示，當(dāng)接種量小于等于640 CFU/mL時(shí)，其OD值與初始菌量均無顯著性差異（P＞0.05），這表明單增李斯特菌8 h內(nèi)在LB1中增菌效果不佳，這可能與培養(yǎng)基中添加的抑菌劑有關(guān)，與Half Fraser和Fraser相比，LB1中添加的抑菌劑吖啶黃素和萘啶酮酸濃度較高，抑制雜菌效果好，但卻造成了單增李斯特菌生長速度較慢，如果要達(dá)到較好的增菌效果，可能需要更長的增菌時(shí)間。GB 4789.30-2016檢測中一般增菌（24±2） h，本實(shí)驗(yàn)預(yù)篩選一種增菌速度快的增菌培養(yǎng)基（一個(gè)工作日即可完成檢測），因此LB1可能不適合作為本實(shí)驗(yàn)的前增菌培養(yǎng)基。

圖3 不同接種量的菌在LB1中的增菌情況Fig.3 Bacteria increase with different inoculation amounts in LB1

2.1.4 不同接種量的菌在LB2中的增菌情況 如圖4所示，當(dāng)接種量小于等于640 CFU/mL時(shí)，其OD值與初始菌量均無顯著性差異（P＞0.05），單增李斯特菌8 h內(nèi)在LB2增菌液中生長受到了抑制。與LB1相比，LB2中添加的抑菌劑吖啶黃素和萘啶酮酸濃度不同，但與Half Fraser和Fraser相比，抑菌劑濃度仍然較高，這可能是造成8 h內(nèi)Half Fraser肉湯對(duì)單增李斯特菌的增菌效果優(yōu)于LB肉湯的主要原因，因此Half Fraser肉湯更適合作為本實(shí)驗(yàn)的增菌培養(yǎng)基。

圖4 不同接種量的菌在LB2中的增菌情況Fig.4 Bacteria increase with different inoculation amounts in LB2

2.1.5 不同接種量的菌在四種培養(yǎng)基中的活菌數(shù)當(dāng)菌液濃度低于6.4×104CFU/mL，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒（TIANGEN）提取DNA，核酸提取濃度不能滿足LAMP檢測，因此需增菌至6.4×104CFU/mL以上。結(jié)果如表3、表4所示，單增李斯特菌在四種增菌液中的平板計(jì)數(shù)結(jié)果與OD600nm值結(jié)果趨勢一致。單增李斯特菌的增菌效果與初始菌量有關(guān)系，初始菌量越大，生長速度越快?？梢钥吹剑姆N增菌培養(yǎng)基中，Half Fraser的增菌效果最好，當(dāng)接種量為640 CFU/mL時(shí)，增菌 4 h，菌液濃度可達(dá)到 1.2×104CFU/mL；當(dāng)接種量為64 CFU/mL時(shí)，增菌6 h，菌液濃度可達(dá)到 9.4×104CFU/mL；當(dāng)接種量為6.4 CFU/mL時(shí)，8 h內(nèi)菌液濃度與0 h無顯著性差異。綜上所述，選取Half Fraser為本實(shí)驗(yàn)的增菌培養(yǎng)基，檢出限最低降至64 CFU/mL。

表3 接種量640 CFU/mL時(shí)單增李斯特菌在四種增菌液中生長差異性比較Table 3 Comparison of growth situation of Listeria monocytogenes in four kinds of culture medium at 640 CFU/ mL

表4 接種量64 CFU/mL時(shí)單增李斯特菌在四種增菌液中生長差異性比較Table 4 Comparison of growth situation of Listeria monocytogenes in four kinds of culture medium at 64 CFU/mL

2.2 增菌時(shí)間的確定

結(jié)果如圖5所示，至少增菌6 h才可滿足后續(xù)DNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳可檢測出梯形條帶，核酸熒光染料的染色結(jié)果呈陽性綠色。因此，確定該方法的最短增菌時(shí)間為6 h 。

圖5 增菌優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間的確定Fig.5 Determination of reaction time for enrichment

2.3 增菌優(yōu)化前LAMP方法的檢出限

結(jié)果如圖6所示，當(dāng)菌液濃度為6.4×104CFU/mL時(shí)，LAMP反應(yīng)后可檢測到梯形條帶，SYBR Green I染色結(jié)果為綠色，證明發(fā)生了特異性擴(kuò)增，檢測結(jié)果呈陽性；而當(dāng)菌液濃度為6.4×103CFU/mL時(shí)，LAMP 擴(kuò)增后未檢測到梯形條帶，SYBR Green I染色結(jié)果為橙色，檢測結(jié)果呈陰性，因此，增菌優(yōu)化前，LAMP檢測人工污染速凍肉糜類制品單增李斯特菌的檢出限為6.4×104CFU/g。

圖6 增菌優(yōu)化前LAMP方法檢出限Fig.6 Detection limit of LAMP befor enrichment

2.4 增菌優(yōu)化后LAMP方法的檢出限

結(jié)果如圖7所示，當(dāng)菌液濃度為6.4×101CFU/mL時(shí)，通過6 h的前增菌，LAMP反應(yīng)后可檢測到梯形條帶，SYBR Green I染色結(jié)果為綠色，表明發(fā)生了特異性擴(kuò)增，即結(jié)果呈陽性。當(dāng)菌液濃度為6.4 CFU/mL時(shí)，電泳未檢測到梯形條帶，SYBR Green I染色結(jié)果為橙色，即結(jié)果呈陰性，表明此菌液濃度下，沒有發(fā)生LAMP擴(kuò)增。因此，通過6 h的前增菌，本實(shí)驗(yàn)檢測人工污染速凍肉糜類制品單增李斯特菌的檢出限為6.4×101CFU/g，比增菌前降低了三個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖7 增菌優(yōu)化后LAMP方法檢出限Fig.7 Detection limit of LAMP after enrichment

2.5 人工污染速凍肉糜類盲樣檢測結(jié)果

檢測結(jié)果如表5所示。國標(biāo)的檢測結(jié)果中有10份陽性樣品，20份陰性樣品。以國標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)，LAMP 方法檢測結(jié)果與其一致，無假陽性，無漏檢情況，準(zhǔn)確度為100%。

表5 人工污染樣品檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 5 Detection results of artificially contaminated samples

2.6 企業(yè)生產(chǎn)線樣本檢測結(jié)果

檢測結(jié)果如表6所示。25份樣品同時(shí)用國標(biāo)法和LAMP方法檢測，兩種方法的檢測結(jié)果相一致。企業(yè)生產(chǎn)線質(zhì)量監(jiān)管較為嚴(yán)格，此次采集樣本檢測結(jié)果均為陰性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，速凍肉糜類制品在加工過程中交叉污染可能更為常見[31-32]。

表6 生產(chǎn)線樣本單增李斯特菌檢出情況Table 6 Listeria monocytogenes detection in production line samples

3 結(jié)論

本研究比較了四種增菌培養(yǎng)基對(duì)單增李斯特菌的增菌效果。以O(shè)D600nm和平板計(jì)數(shù)活菌數(shù)為指標(biāo)，結(jié)果顯示Half Fraser的增菌效果最好，從6.4×101CFU/mL增菌至9.4×104CFU/mL，用時(shí)6 h。增菌優(yōu)化后，LAMP檢測速凍肉糜類制品中單增李斯特菌的檢出限為 6.4×101CFU/g，比增菌前降低了三個(gè)數(shù)量級(jí)。將LAMP方法應(yīng)用于人工污染速凍肉糜類盲樣樣品和企業(yè)生產(chǎn)線樣本檢測，同時(shí)與國標(biāo)法對(duì)比，本方法與國標(biāo)法檢測結(jié)果一致。

本研究基于LAMP方法，結(jié)合6 h的前增菌，可將檢測時(shí)間縮短至8 h，無需專業(yè)設(shè)備，根據(jù)顏色的變化即可判斷檢測結(jié)果，直觀簡便，適合基層對(duì)食品中單增李斯特菌的現(xiàn)場快速檢測。目前由于技術(shù)本身的限制，LAMP方法的檢出限略高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，為了更好的檢測樣品中可能存在的少量細(xì)菌，在實(shí)際樣品處理時(shí)，可以延長增菌時(shí)間以降低 LAMP 方法的檢出限?？傊琇AMP技術(shù)將有望成為食源性致病菌檢測的有效方法，為產(chǎn)品檢測及安全追溯提供依據(jù)。