徐 麗，劉姍姍，王 敏，劉 芳，張容秀，張 凱

蚌埠醫(yī)學(xué)院1第一附屬醫(yī)院口腔科，安徽 蚌埠 233004；2蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院口腔科，安徽 蚌埠 233040

齲病是最常見(jiàn)的會(huì)影響患者身心健康的慢性感染性疾病［1-3］。第四次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)55～64 歲年齡組的恒牙患齲率高達(dá)95.60%。因此，齲病防治的任務(wù)在我國(guó)仍很艱巨［4］。變異鏈球菌（SM）是導(dǎo)致齲病發(fā)生的一種重要的微生物［5-7］。戈登鏈球菌又名格氏鏈球菌（SG），是一種牙面早期定植的先鋒菌，與齲病的形成呈負(fù)相關(guān)［8,9］。而變鏈素Ⅳ是變異鏈球菌產(chǎn)生的拮抗戈登鏈球菌的一種重要的細(xì)菌素［10］。

近年研究表明，細(xì)菌毒力因子的表達(dá)受細(xì)菌體內(nèi)小RNA（sRNAs）的廣泛調(diào)控［11,12］。細(xì)菌sRNAs通常長(zhǎng)度小于300個(gè)核苷酸，位于基因組基因間區(qū)［12］，其主要通過(guò)堿基配對(duì)與靶基因結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用［13,14］。1971年，Griffin等［15］通過(guò)在大腸埃希菌中首次發(fā)現(xiàn)了一些高度表達(dá)的sRNAs 如4.5S，轉(zhuǎn)運(yùn)-信使RNA（tmRNA），RNaseP及Spot42等。隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，sRNAs 在其他多種細(xì)菌中也得到廣泛研究。例如，Toffano等［16］測(cè)序發(fā)現(xiàn)燦爛弧菌中存在成百上千種潛在sRNAs，與其他弧菌的保守性分析發(fā)現(xiàn)，大部分sRNAs 為燦爛弧菌特異性表達(dá)，其中有28 種sRNAs在所有弧菌中均有所表達(dá)；Howden等［17］對(duì)暴露于抗生素狀態(tài)的金黃色葡萄球菌進(jìn)行RNA測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)409個(gè)潛在的sRNAs。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，變異鏈球菌中亦存在sRNAs的表達(dá)［18-20］，srn821798是其中成功鑒定的一種sRNA。然而，sRNAs是否在變異鏈球菌變鏈素Ⅳ的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，目前尚不清楚。研究報(bào)道sepM在變鏈素Ⅳ的表達(dá)中發(fā)揮重要作用［10］，鑒于3種靶基因預(yù)測(cè)軟件均提示sepM是srn821798的靶基因，本文旨在初步探索srn821798在變鏈素Ⅳ形成中的作用。

1 材料和方法

1.1 srn821798的靶基因預(yù)測(cè)和通路生物信息學(xué)分析

RNAhybrid、RNAPredator 和IntaRNA 軟件預(yù)測(cè)srn821798的候選作用靶基因；DAⅤID（http://david.ncifcrf.gov/）用于分析srn821798參與的ΚEGG通路；antiSMASH（bacterial version）（http://antismash.secondarymetabolites.org/）被用來(lái)分析srn821978用于預(yù)測(cè)變異鏈球菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

1.2 srn821798及其候選靶基因在不同變鏈素Ⅳ表達(dá)組變異鏈球菌臨床菌株中的表達(dá)水平檢測(cè)

在實(shí)驗(yàn)室前期保存的變異鏈球菌臨床株中篩選c血清型菌株，包括高變鏈素Ⅳ表達(dá)和無(wú)變鏈素Ⅳ表達(dá)的變異鏈球菌臨床菌株各10株。戈登鏈球菌是評(píng)估變鏈素Ⅳ表達(dá)水平的指示菌［21］。變異鏈球菌臨床株在腦心浸液肉湯（BHI）液體培養(yǎng)基中培育過(guò)夜，當(dāng)培養(yǎng)至A600為0.3時(shí)，從每個(gè)分離菌株中取10 μL加入BHI瓊脂板中，37 ℃培育12 h，然后再接種相等量的戈登鏈球菌，在37 ℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，指示菌株清除區(qū)代表變鏈素Ⅳ的活性。

變異鏈球菌臨床株過(guò)夜培養(yǎng)后，用miRNA Mini 試劑盒（Qiagen）提取細(xì)菌總RNA。Mir-XTMmiRNA 第一鏈合成試劑盒（Takara）和Mir-XTMmiRNA qRT-PCR TB GreenTM試劑盒（Takara）分別被用于srn821798的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RTqPCR）。srn8217978的PCR反應(yīng)條件為95 ℃10 s，95 ℃5 s 40個(gè)循環(huán)，50 ℃退火20 s。以16s rRNA的表達(dá)水平作為內(nèi)參。16s rRNA，sepM，comD，comE，nlmA，nlmB的PCR條件同之前研究［22,23］。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)株中srn821798上、下調(diào)對(duì)候選靶基因表達(dá)水平的影響測(cè)定

由上海吉瑪生物設(shè)計(jì)并合成srn821798模擬物（GAUUAGUUAUCAGAUUUU，AAUCUGAUAAC UAAUCUU）和抑制劑（AAAAUCUGAUAACUAA UC）。變異鏈球菌UA159（ATCC 700610）在37 ℃，5%CO2下1000 μL BHI液體培養(yǎng)基（1∶100體積比）中培育過(guò)夜，然后用0.9%生理鹽水洗兩次，在新鮮的BHI中重懸。將40 μL的樣品和模擬物（8 μL模擬物原液和250 μL無(wú)酶水的混合物）或抑制劑（10 μL抑制劑原液和625 μL無(wú)酶水的混合物）共同加入1 mm間隙的預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯，采用ECM（BTX，USA）進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。模擬物和抑制劑的原液濃度均為20 μmol。電轉(zhuǎn)參數(shù)：?jiǎn)蚊}沖2500 Ⅴ，電容25 μF，電阻200 Ω。細(xì)菌電穿孔后移至新鮮BHI液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8 h（指數(shù)期中期），然后進(jìn)行總RNA的提純，即刻反轉(zhuǎn)錄PCR，并檢測(cè)srn821798和候選靶基因的表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence for qPCR of srn821798 and its candidate target genes

1.4 srn821798和sepM結(jié)合實(shí)驗(yàn)

人工合成sepM 1（RNAhybrid）、sepM 2（RNApredator）、sepM 3（IntaRNA）以及srn821798小RNA片段（上海吉瑪生物），并對(duì)其分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。srn821798作為對(duì)照組；同時(shí)將（srn821798+sepM 1）、（srn821798+sepM 2）、（srn821798+sepM 3）進(jìn)行預(yù)混孵育分別電泳，作為實(shí)驗(yàn)組。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證srn821798對(duì)sepM的靶向調(diào)控作用

針對(duì)RNAhybrid、RNAPredator和IntaRNA軟件預(yù)測(cè)的sepM基因上與srn821798互作的序列，在psiCHECΚ2質(zhì)粒上構(gòu)建sepM野生型和突變型質(zhì)粒，并將這些質(zhì)粒和合成的mimic及mimic NC轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，建立如下分組：mimic NC+psiCHECΚ2-WT、mimic+psiCHECΚ2-WT組、mimic NC+psiCHECΚ2-RNAhybrid-MUT 組、mimic+psiCHECΚ2-RNAhybrid-MUT 組、mimic NC+psiCHECΚ2-RNAPredator-MUT 組、mimic+psiCHECΚ2-RNAPredator-MUT 組、mimic NC+psiCHECΚ2-IntaRNA-MUT組、mimic+psiCHECΚ2-IntaRNA-MUT組、mimic NC+psiCHECΚ2 組、mimic+psiCHECΚ2組。采用Dual-Luciferase雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用IBM SPSS20.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)方法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 已鑒定sRNAs的生物信息學(xué)分析

2.1.1 已鑒定sRNAs靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果 3種靶基因預(yù)測(cè)專用軟件RNAhybrid、RNAPredator 和IntaRNA 對(duì)srn821798進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果提示，sepM，comD，comE，nlmA，nlmB是srn821798的候選作用靶基因（表2），其中3 種軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果均提示sepM是srn821798的候選靶基因（表3）。

表2 3種軟件靶基因預(yù)測(cè)的srn821798-mRNA作用位點(diǎn)Tab.2 srn821798 mRNAaction sites predicted using 3 software

表3 3種軟件靶基因預(yù)測(cè)的srn821798-sepM作用位點(diǎn)Tab.3 srn821798-sepM action sites predicted by software

2.1.2srn821798參與的通路分析 ΚEGG通路分析提示，srn821798參與以次級(jí)代謝產(chǎn)物合成為主的多數(shù)通路，而次級(jí)代謝產(chǎn)物分析軟件antiSMASH（bacterial version）顯示變鏈素Ⅳ是變異鏈球菌中一種重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物（圖1），這與靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖1 srn821798 ΚEGG通路分析結(jié)果Fig.1 KEGG pathway analysis of srn821798.A:KEGG analysis of the target genes predicted by RNAPredator suggests that biosynthesis of secondary metabolites is one of the important pathways involving srn821798.B:KEGG analysis of the target genes predicted by IntaRNA suggests that biosynthesis of secondary metabolites is one of the important pathways involving srn821798.

2.1.3 變異鏈球菌臨床菌株中srn821798和靶基因的表達(dá)水平分析 高表達(dá)變鏈素Ⅳ組中sepM，comD，comE，nlmA及nlmB均有表達(dá)，且表達(dá)水平均顯著高于無(wú)表達(dá)變鏈素Ⅳ組（P＜0.05），而高表達(dá)變鏈素Ⅳ組srn821798的表達(dá)水平顯著低于無(wú)表達(dá)變鏈素Ⅳ組（P＜0.001）。低表達(dá)菌株，但兩組菌株中候選靶基因的表達(dá)水平均未存在顯著差異，其中sepM的表達(dá)水平在兩組間存在差異的趨勢(shì)，而前期3種靶基因預(yù)測(cè)軟件的交集結(jié)果亦提示srn821798可調(diào)控sepM的表達(dá)，并且RNAhybrid 和RNAPredator預(yù)測(cè)的srn821798-sepM結(jié)合位點(diǎn)高度一致。因此我們繼而檢測(cè)了3種軟件預(yù)測(cè)的srn821798-sepM結(jié)合能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNAhybrid和RNAPredator預(yù)測(cè)的srn821798-sepM位點(diǎn)結(jié)合能力高（結(jié)合率分別為82.84%和85.19%）（圖3）。

圖2 變異鏈球菌臨床株中srn821798和靶基因表達(dá)水平分析Fig.2 Expression analysis of srn821798 and its target gene in clinical strains of Streptococcus mutans.A:Serotype test result.B:Expression map of mutacin IV in clinical strains with high or no mutacin IV expression.C:Relative expression level of srn821798.D-H:Relative expression levels of the candidate target genes(*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001).

圖3 srn821798過(guò)、低表達(dá)株中候選靶基因表達(dá)水平的檢測(cè)及srn821798-sepM預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力分析Fig.3 Detection of relative expression levels of the candidate target genes in srn821798 high expression and low expression strains and analysis of binding ability of srn821798 with predicted binding sites of sepM.A:High expression and low expression of srn821798 in srn821798 high expression and low expression strains group(*P＜0.05 vs S.mutans).B-F:Relative expression levels of the candidate target genes in srn821798 high expression and low expression strains group.G:Analysis of binding ability of srn821798-sepM;sepM 1,sepM 2 and sepM 3 represent the binding sequences of srn821798 and sepM gene predicted by RNAhybrid,RNAPredator and IntaRNA.H:Binding rates of srn821798 with sepM 1, sepM 2 and sepM 3 analyzed with SEPM 1,SEPM 2 and SEPM 3 as controls(***P＜0.001).

2.2 srn821798對(duì)sepM靶向調(diào)控的雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證

以mimic NC+psiCHECΚ2-WT為對(duì)照，srn821798模擬物與野生型載體（psiCHECΚ2-WT）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性明顯下降（RNAhybridP=0.003；RNAPredatorP=0.002）；以mimic NC +psiCHECΚ2-MUT為對(duì)照，srn821798模擬物與突變型載體（psiCHECΚ2-RNAhybrid-MUT 或psiCHECΚ2-RNAPredator-MUT）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性未見(jiàn)明顯差異（RNAhybridP=0.800；RNAPredatorP=0.292）。針對(duì)IntaRNA的預(yù)測(cè)結(jié)果，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，以mimic NC+psiCHECΚ2-WT 為對(duì)照,以mimic NC+psiCHECΚ2-MUT 為對(duì)照，srn821798模擬物（mimic）與突變型載體（psiCHECΚ2-IntaRNA-MUT）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性亦明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014，圖4）。

圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證srn821798靶向調(diào)控sepM的結(jié)果Fig.4 Targeted regulatory role of srn821798 in sepM expression detected by dual-luciferase reporter system.A:Dual-luciferase reporter assay for examining srn821798-sepM interaction according to the RNAhybrid prediction.B:Dual-luciferase reporter assay for examining srn821798-sepM interaction according to the RNAPredator prediction.C:Dual-luciferase reporter assay of srn821798-sepM interaction according to the IntaRNAprediction.*P＜0.05;**P＜0.01.

3 討論

齲病是口腔科最常見(jiàn)最高發(fā)的疾病之一，是由變異鏈球菌等細(xì)菌為主的多種因素作用下所造成的牙體硬組織分解、破壞［24］。變異鏈球菌形成齲壞的先決條件是對(duì)牙面的黏附，從而促進(jìn)菌斑生物膜的形成，代謝碳源產(chǎn)生酸性終末產(chǎn)物，進(jìn)而導(dǎo)致牙齒表面脫礦并最終形成齲洞［25］。戈登鏈球菌是一種與齲病的形成呈負(fù)相關(guān)的早期牙面定植菌，阻止齲齒形成的關(guān)鍵可能是一方面通過(guò)釋放氨平衡變異鏈球菌產(chǎn)生的酸性環(huán)境，另一方面其可直接拮抗變異鏈球菌的生長(zhǎng)［21,26,27］。

細(xì)菌素是由細(xì)菌合成的抗菌肽，為細(xì)菌的自身生長(zhǎng)提供競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)［28］。變鏈素Ⅳ是由變異鏈球菌中的nlmA和nlmB編碼產(chǎn)生的拮抗多種非變異鏈球菌如戈登鏈球菌、血鏈球菌進(jìn)而保護(hù)變異鏈球菌生長(zhǎng)的一種細(xì)菌素［29］。文獻(xiàn)報(bào)道，ComDE雙組份調(diào)控系統(tǒng)在變鏈素Ⅳ的表達(dá)中起著重要正調(diào)控作用，而該系統(tǒng)又進(jìn)一步受上游SepM蛋白的影響［10］。且本課題組最近的研究結(jié)果表明，變異鏈球菌臨床菌株中SepM蛋白的編碼基因sepM中存在與變鏈素Ⅳ形成相關(guān)的突變類型［30］。

既往研究表明，sRNAs主要通過(guò)與目標(biāo)靶mRNAs堿基配在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細(xì)菌毒力的表達(dá)，并且sRNAs有望成為評(píng)估臨床疾病狀況和嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物［10,21,31］。已經(jīng)有許多細(xì)菌的sRNAs被證實(shí)［32］。然而，在齲病方面，關(guān)于致齲菌sRNAs的研究較少，Lee等［33］發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌中15～26個(gè)核苷酸大小的sRNAs可能有數(shù)百種；Li等［34］通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到變異鏈球菌中存在sRNA L10-Leader，繼而通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并檢測(cè)了該sRNA在不同生長(zhǎng)環(huán)境下的表達(dá)改變。我們前期在不同的糖（蔗糖和葡萄糖）濃度和初始PH5.5壓力下亦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌中可檢測(cè)到大量的sRNAs［18-20］。但是是否存在調(diào)控變鏈素Ⅳ形成的關(guān)鍵sRNAs尚不清楚。我們針對(duì)前期已鑒定的sRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)sRNAs可能參與調(diào)控變鏈素IⅤ的表達(dá)，我們隨機(jī)對(duì)其中一種sRNAsrn225147進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)comD是候選靶標(biāo)，但是進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其雖可雙向調(diào)控靶基因comD的表達(dá)，但是對(duì)變鏈素Ⅳ的調(diào)控能力微弱［29,35］。為了進(jìn)一步尋找可能在變鏈素Ⅳ形成中起調(diào)控作用的sRNAs，本實(shí)驗(yàn)中我們篩選了三種靶基因預(yù)測(cè)軟件均有相同靶標(biāo)結(jié)果的srn821798，并且RNAhybrid和RNAPredator預(yù)測(cè)的srn821798和sepM的作用位點(diǎn)高度相似，這加強(qiáng)了srn821798調(diào)控變鏈素Ⅳ的可信度，因此，本文就srn821798在變鏈素Ⅳ中的作用進(jìn)行重點(diǎn)分析。

本課題組利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)srn821798在變鏈素Ⅳ中的潛在作用后，進(jìn)而在20株臨床分離菌株（高變鏈素Ⅳ表達(dá)組n=10；變鏈素Ⅳ無(wú)表達(dá)組n=10）中進(jìn)一步檢測(cè)了srn821798和sepM，comD，comE，nlmA，nlmB候選靶基因的表達(dá)水平。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖可明顯影響變異鏈球菌小RNA的表達(dá)［10］。本次研究中，考慮到臨床菌株之間蔗糖利用率和蔗糖誘導(dǎo)毒力的差異尚不清楚，因此為了排除蔗糖可能引起的影響，我們?cè)诒敬螌?shí)驗(yàn)中均未加入蔗糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高變鏈素Ⅳ表達(dá)組中，sepM，comD，comE，nlmA，nlmB表達(dá)水平顯著高于無(wú)變鏈素Ⅳ表達(dá)組；高表達(dá)變鏈素Ⅳ組srn821798的表達(dá)水平顯著低于無(wú)表達(dá)變鏈素Ⅳ組。靶基因在高、低變鏈素Ⅳ表達(dá)組中呈正向表達(dá)，而srn821798在高、低變鏈素Ⅳ表達(dá)組中呈負(fù)向表達(dá)，這提示，srn821798可能通過(guò)調(diào)控候選靶基因在變鏈素Ⅳ中起重要作用，而且可能為負(fù)反饋調(diào)節(jié)。為進(jìn)一步驗(yàn)證我們的設(shè)想，我們進(jìn)而在變異鏈球菌UA159標(biāo)準(zhǔn)株上成功構(gòu)建了srn821798過(guò)、低表達(dá)菌株，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)srn821978的表達(dá)水平上調(diào)到約100倍時(shí)，候選靶基因在srn821798上調(diào)組和對(duì)照組中的表達(dá)均無(wú)明顯差異。電泳結(jié)果提示，RNAhybrid和RNAPredator預(yù)測(cè)的srn821798-sepM位點(diǎn)結(jié)合能力高，這與雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)結(jié)果一致。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，mimic NC+野生質(zhì)粒為對(duì)照，srn821798mimic 與野生型載體共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性明顯下降；以mimic NC+突變質(zhì)粒為對(duì)照，srn821798mimic 與RNAhybrid 或RNAPredator突變型載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性未見(jiàn)明顯差異。這驗(yàn)證了RNAhybrid 和RNAPredator軟件預(yù)測(cè)的srn821798-sepM作用位點(diǎn)的有效性。然而，srn821798mimic與IntaRNA突變型載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性亦明顯下降，并且差異倍數(shù)與mimic NC+野生質(zhì)粒組和mimic+野生質(zhì)粒組的區(qū)別差異不大，這主要是因?yàn)?，mimic與RNAhybrid 和RNAPredator 預(yù)測(cè)的位點(diǎn)有結(jié)合，但與IntaRNA預(yù)測(cè)的位點(diǎn)無(wú)結(jié)合能力或者結(jié)合效果微弱。因此，sepM確實(shí)是srn821798的直接作用靶標(biāo)，主要作用位點(diǎn)為RNAhybrid和RNAPredator預(yù)測(cè)的區(qū)域。

綜上所述，我們的研究為變異鏈球菌在轉(zhuǎn)錄后水平上產(chǎn)生變鏈素Ⅳ提供了新的視角，結(jié)果提示srn821798通過(guò)調(diào)控靶基因sepM的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)變鏈素Ⅳ的形成。然而，srn821798介導(dǎo)的變鏈素Ⅳ產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用較弱。本結(jié)果雖與srn225147的研究結(jié)論相似，但存在明顯不同的地方。首先，srn821798在臨床菌株中高變異鏈球菌表達(dá)組中的表達(dá)水平約是低變異鏈球菌表達(dá)組的1萬(wàn)倍，而srn225147在兩組的表達(dá)差異僅約4倍，這提示我們，srn821798對(duì)變鏈素Ⅳ的調(diào)控能力可能明顯優(yōu)于srn225147。其次，以往我們關(guān)于srn225147在變鏈素Ⅳ中的研究，僅針對(duì)兩個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件（RNAhybrid和RNAPredator）得出的單一靶基因comD進(jìn)行探索，而本次研究中，為了得到更精確的預(yù)測(cè)結(jié)果，我們采用三種靶基因預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行（RNAhybrid、RNAPredator 及IntaRNA）分析，對(duì)得出的所有已報(bào)道的與變鏈素Ⅳ形成相關(guān)的靶基因（sepM,comD,comE,nlmA,nlmB）進(jìn)行了表達(dá)水平的探索，并對(duì)三種靶基因預(yù)測(cè)得到較為一致的sepM結(jié)果進(jìn)行了小RNA-sepM結(jié)合片段的靶點(diǎn)驗(yàn)證分析。故，本研究是我們既往研究的擴(kuò)展和深入。雖然得到的結(jié)果也是srn821798介導(dǎo)變鏈素Ⅳ形成的能力微弱。但是，這可能與本實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株中srn821798高、低表達(dá)組中srn821798的表達(dá)差異沒(méi)有達(dá)到臨床菌株的差異水平。因此，在后續(xù)的研究中，我們需進(jìn)一步改善實(shí)驗(yàn)條件，嘗試電轉(zhuǎn)得到更高的srn821798上調(diào)倍數(shù)來(lái)驗(yàn)證我們的假設(shè)。此外，在本研究中，我們只關(guān)注srn821978，而其他未鑒定的sRNAs是否通過(guò)靶向sepM-ComDE通路相關(guān)基因在變鏈素Ⅳ的調(diào)控中發(fā)揮重要作用尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。