鄢雨中，陳 蕾，張國文

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

大豆(Soybean)是一種具有很高食用價值和經(jīng)濟(jì)價值的農(nóng)作物，在食品中非常常見。大豆也是蛋白質(zhì)含量很高的農(nóng)作物，含有約為40%的蛋白質(zhì)，其中的大豆分離蛋白(Soybean protein isolate,SPI)不僅包含了人體所需要的8種氨基酸，而且其含量也能滿足人體所需要。大豆分離蛋白具有營養(yǎng)豐富、綠色健康等優(yōu)點，可以有效補充人體所需的蛋白，且消化率可高達(dá)93%～97%。在健康方面可幫助人體制造對抗病毒的抗體，補充免疫細(xì)胞，增強免疫力，還可以降低膽固醇、血糖，促進(jìn)鈣元素吸收[1]。

芹菜素(Apigenin，API)是一種黃酮類化合物，常被稱為芹黃素和洋芹素[2]，在西芹、水芹、橙子和洋甘菊等綠色蔬菜、新鮮水果及菊科植物中含量豐富，具有抗腫瘤、抗炎、降壓和舒張血管等藥理活性[3]，是一種治療效果優(yōu)良、安全低毒的植物活性成分，已被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中。

近年來黃酮類化合物與蛋白質(zhì)相互作用的研究受到了普遍關(guān)注。江名等[4]采用熒光光譜法結(jié)合分子模擬技術(shù)研究了API與人血清蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)芹菜素能猝滅人血清蛋白內(nèi)源性熒光，API的結(jié)合位點位于ⅡA亞域處，分子模擬顯示二者主要通過疏水作用結(jié)合。劉勤勤[5]利用熒光光譜茶多酚與大豆分離蛋白之間的相互作用，結(jié)果表明，茶多酚對大豆分離蛋白有較強的熒光猝滅作用且為靜態(tài)猝滅，二者反應(yīng)的作用力主要是范德華力和氫鍵作用，同步熒光光譜顯示茶多酚與大豆分離蛋白中色氨酸殘基發(fā)生相互作用，使其周圍的疏水作用減少。本文研究黃酮類化合物API與SPI的結(jié)合性質(zhì)、結(jié)合模式以及對SPI結(jié)構(gòu)的影響，旨在為API-SPI包載體系的構(gòu)建以及SPI功能性質(zhì)的改善提供理論基礎(chǔ)。

圖1 芹菜素的分子結(jié)構(gòu)

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；F-7000型熒光光度計(日本日立公司)；MOS-450圓二色譜儀(法國Bio-Logic公司)；Varioskan LUX型酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)；pHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)；5430R型高速臺式離心機(德國艾本德股份公司)。

1.2 實驗試劑

大豆分離蛋白(上海源葉生物科技公司，純度≥99.5%)；芹菜素(陜西慧科植物開發(fā)有限公司，純度98%)；8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS)；pH 7.07的PBS緩沖溶液(以Na2HPO4·12H2O與NaH2PO4·2H2O配制而成)；十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O，西隴化工股份有限公司，純度≥99.0%)；磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O，上海精析化工科技有限公司純度，≥99.0%)；其他試劑的純度均為分析純，實驗用水為超純水。

1.3 試驗方法

1.3.1 熒光猝滅光譜的測定

移取3.0 mL質(zhì)量濃度為3 mg·mL-1的SPI溶液于比色皿中，在280 nm的激發(fā)波長下掃描其熒光光譜后，再向裝有SPI溶液的比色皿中依次加入API(3.7×10-3mol·L-1，3 μL/次，共10次)，每次加入API后將溶液混合均勻，去除氣泡后靜置2 min，再掃描其290～500 nm的熒光光譜，共測得11條光譜曲線。按照上述操作，分別測定25，31和37 ℃ 3個溫度下的熒光光譜，并記錄數(shù)據(jù)，所有的熒光數(shù)據(jù)都需經(jīng)過以下公式進(jìn)行校正以扣除“內(nèi)濾光效應(yīng)”所帶來的實驗誤差[6]：

Fc=Fme(A1+A2)/2

(1)

式中Fc為校正后的熒光強度值；Fm為實驗所測得的熒光強度值；A1為API在激發(fā)波長下的紫外吸光度值；A2為API在發(fā)射波長下的紫外吸光度值。

1.3.2 同步熒光光譜的測定

移取3.0 mL質(zhì)量濃度為3.0 mg·mL-1的SPI溶液于熒光池中，逐次滴加3 μL的API溶液10次，在25℃下，設(shè)置激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為2.5 nm，掃描290～420 nm波長范圍內(nèi)發(fā)射和激發(fā)波長間隔Δλ分別為15和60 nm的同步熒光光譜，各得到11條光譜曲線。

1.3.3 三維熒光光譜的測定

移取3.0 mL質(zhì)量濃度為3.0 mg·mL-1的SPI溶液于熒光池中，在200～600 nm的激發(fā)和發(fā)射波長下，記錄游離的SPI溶液和加入了15 μL 3.7×10-3mol·L-1API的SPI-API復(fù)合物溶液的三維熒光光譜。

1.3.4 紫外-可見吸收光譜的測定

移取3.0 mL質(zhì)量濃度為3.0 mg·mL-1的SPI溶液于比色皿中，紫外光譜掃描之后，依次加入3.7×10-3mol·L-1的API(5 μL/次)，混合均勻并靜置2 min，然后測定220～320 nm范圍的吸收光譜，并掃描對應(yīng)游離濃度的API的吸收光譜。

1.3.5 蛋白質(zhì)表面疏水性測定

采用ANS熒光探針法測定蛋白質(zhì)疏水性。先將SPI溶液溶于PBS溶液中，取SPI溶液2 mL，加入20 μL 8.0 mmol·mL-1ANS，混合均勻后，靜置3 min。設(shè)置激發(fā)波長λex=390 nm，發(fā)射波長λem=470 nm，二者狹縫均設(shè)為5 nm，測定熒光強度后，依次加入3.7×10-3mol·L-1的API(5 μL/次，共4次)，混合均勻并靜置2 min，測定熒光強度，每組測定3次，取平均值。重復(fù)以上操作，分別測量在SPI溶液質(zhì)量濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg·mL-1時的熒光強度，將計算后所得的平均熒光強度作為因變量，SPI溶液的質(zhì)量濃度作為自變量，繪制線性回歸曲線，所得的相應(yīng)曲線斜率即為蛋白質(zhì)表面疏水指數(shù)S0，再以曲線的斜率對API濃度作圖，即可獲得蛋白質(zhì)表面疏水性的變化。

1.3.6 蛋白質(zhì)游離巰基含量測定

采用Dong等[7-8]的方法測定蛋白質(zhì)游離巰基含量。配制尿素-Tris-Gly緩沖液(0.086 mol·L-1Tris，0.09 mol·L-1Gly，4 mmol·L-1EDTA，pH 8.0，8 mol·L-1尿素)，然后配制Ellman試劑(4 mg DTNB溶解于1 mL的Tris-Gly緩沖液)，先取11個小管，分別加入1 mL 3.0 mg·mL-1的SPI溶液，按照梯度分別加入2 μL 3.7×10-3mol·L-1API，混合均勻。再取11個小管分別加入1 mL尿素-Tris-Gly緩沖液，10 μL Ellman試劑，250 μL不同濃度的API-SPI混合液，用PBS緩沖溶液作空白，在412 nm處測定吸光度，巰基含量的計算公式如下。

巰基含量/(μmol·g-1)=73.53×A412/ρ

(2)

其中A412為412 nm處吸光值；73.53=106/(1.36×104)，1.36×104為摩爾消光系數(shù)(L·cm·mol-1)；ρ為蛋白質(zhì)量濃度(mg·mL-1)。

1.3.7 圓二色光譜的測定

分別移取2 mL質(zhì)量濃度為3.0 mg·mL-1的SPI溶液，0，6，48 μL濃度為3.7×10-3mol·L-1的API溶液，配制[API]:[SPI]摩爾比率為0:1，2:1，16:1的樣品，在190～250 nm范圍內(nèi)掃描樣品的圓二色光譜，每組掃描3次，通過在線Dichroweb網(wǎng)站求出加入不同濃度的API后SPI的二級結(jié)構(gòu)含量(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量)，分析API對SPI二級結(jié)構(gòu)的影響。

1.3.8 分子模擬

采用Discovery studio軟件對SPI-API復(fù)合物進(jìn)行分子建模。SPI中含有的蛋白類型主要為7s型與11s型。兩種類型蛋白的晶體結(jié)構(gòu)從Protein Data Bank網(wǎng)站下載(1h9z)，去除水分子再進(jìn)行加氫及加電荷處理。從PubChem數(shù)據(jù)庫中獲得API的3D結(jié)構(gòu)。利用分子模擬中的CDOCKER程序分別進(jìn)行API與兩種蛋白的對接模擬，獲得API與SPI結(jié)合的最佳模式以及周圍氨基酸殘基的相互作用情況。

2 實驗結(jié)果

2.1 熒光猝滅機理

圖2為向SPI中不斷滴加API后SPI的熒光光譜。隨著滴加的API濃度的不斷升高，SPI在347 nm處的熒光強度逐漸降低，表明API與SPI相互作用導(dǎo)致了SPI的熒光猝滅。

λ/nm

溫度是影響熒光猝滅的一個關(guān)鍵因素，可利用不同溫度下的熒光數(shù)據(jù)通過計算得出猝滅常數(shù)來判斷猝滅類型[9]。熒光猝滅可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[10]，動態(tài)猝滅是指激發(fā)態(tài)熒光分子與猝滅劑發(fā)生能量轉(zhuǎn)移或物理碰撞使其熒光猝滅；靜態(tài)猝滅是指熒光分子與猝滅劑相互結(jié)合形成一種復(fù)合物，該復(fù)合物使熒光分子熒光強度降低，從而產(chǎn)生了熒光猝滅現(xiàn)象[11]。一般而言，當(dāng)猝滅常數(shù)值隨溫度的上升而減小時，將其判定為靜態(tài)猝滅，反之則為動態(tài)猝滅[12]。本實驗測定了25，31和37 ℃ 3個溫度下API對SPI的熒光猝滅數(shù)據(jù)，運用Stern-Volmer方程進(jìn)行計算[13]。

F0/F=1+KSVc=1+Kqτ[API]

(3)

式中:F0和F分別代表API加入前后SPI的熒光強度；Kq為猝滅速率常數(shù)；Ksv為猝滅常數(shù)；τ0為不含有猝滅物質(zhì)時熒光分子的平均壽命，為10-8s[14]。

通過F0/F對[API]作線性回歸方程可得出Ksv值，結(jié)果如圖3與表1所示，Ksv值隨溫度的上升稍有增大，但是Kq的值遠(yuǎn)高于最大擴(kuò)散碰撞常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)，超過了擴(kuò)散控制的極限，所以推斷API對SPI的熒光猝滅是一個靜態(tài)猝滅過程[15]。

AP/(10-6 mol·L-1)圖3 在25、31和37 ℃三個溫度條件下的Stern-Volmer曲線

表1 不同溫度下API與SPI作用的結(jié)合參數(shù)

2.2 結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點數(shù)

如果小分子與蛋白質(zhì)二者之間的猝滅方式是靜態(tài)的過程，可運用公式(4)對數(shù)據(jù)進(jìn)一步計算得到API與SPI相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n[16]：

lg(F0-F)/F=lgKa+nlg[Q]

(4)

式中：F和F0分別表示加入了和還未加入API時SPI的熒光強度；Ka為表觀結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點數(shù)，[Q]為API的濃度。

以lg[Q]為橫坐標(biāo)，lg(F0-F)/F為縱坐標(biāo)作圖，經(jīng)過擬合后得到回歸曲線(圖4)，三條線的斜率即為結(jié)合位點數(shù)n，截距為lgKa，通過計算可得出表觀結(jié)合常數(shù)Ka。如表1所示，n值近似為1，說明API于SPI上僅有一個結(jié)合位點；隨著溫度的上升，結(jié)合常數(shù)Ka呈現(xiàn)下降趨勢，表明溫度升高使SPI-API結(jié)合體系的穩(wěn)定性下降。

2.3 熱力學(xué)參數(shù)與作用力

小分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用力主要有疏水作用、范德華力、氫鍵和靜電作用[17]。如果焓變?yōu)檎怠㈧刈優(yōu)檎担瑒t兩者之間主要是疏水作用；如果焓變?yōu)樨?fù)值、熵變?yōu)樨?fù)值，則兩者之間主要是范德華力與氫鍵作用；如果焓變?yōu)樨?fù)值，熵變?yōu)檎?，則兩者之間主要是靜電作用[18]，可采用反應(yīng)的焓變ΔH°和熵變ΔS°判斷API與SPI之間的相互作用力類型。熱力學(xué)參數(shù)可通過以下公式計算得出[19]：

圖4 在25，31和37 ℃三個溫度條件下API猝滅SPI的雙對數(shù)圖

(5)

ΔG°=ΔH°-TΔS°

(6)

公式(5)中R表示氣體常數(shù)(8.31 J·mol-1·K-1)，T為熱力學(xué)溫度(298，304，310 K)，Ka為結(jié)合常數(shù)。計算得到的ΔH°、ΔS°和ΔG°值列于表1中。ΔG°<0，表明反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的，ΔS°和ΔH°均<0，表明API與SPI的結(jié)合是一個放熱的過程，二者之間的作用力主要是氫鍵和范德華力。

2.4 同步熒光光譜

同步熒光光譜法常用來探測小分子與蛋白質(zhì)相互作用后對蛋白質(zhì)氨基酸微環(huán)境的影響，波長差為15 nm顯示的是酪氨酸殘基的熒光光譜，波長差為60 nm顯示的是色氨酸殘基的熒光光譜，由此可判斷API與SPI相互作用對兩種氨基酸殘基微環(huán)境的影響[20]，最大熒光發(fā)射峰的紅移和藍(lán)移分別表明對應(yīng)氨基酸殘基周圍微環(huán)境的極性和疏水性變化[21]。

圖5表示常溫下SPI-API的同步熒光光譜圖，從圖中可以看出，隨著API濃度的不斷增大，酪氨酸、色氨酸的熒光強度都逐漸下降，最大發(fā)射峰位置都有稍許移動，其中酪氨酸的發(fā)射峰位從292 nm藍(lán)移至290 nm，而色氨酸的發(fā)射峰位從285 nm紅移至287 nm，表明API與SPI作用改變了SPI上的酪氨酸殘基、色氨酸殘基所處的微環(huán)境，酪氨酸殘基周圍微環(huán)境疏水性增加，而色氨酸殘基周圍微環(huán)境極性增加[22]。

(A) Δλ=15 nm

(B) Δλ=60 nm圖5 25 ℃時SPI-API體系的同步熒光光譜圖

2.5 三維熒光光譜分析

通過三維熒光光譜實驗可以了解到更多的API對SPI構(gòu)象影響的信息。如圖6所示，peak1主要表示色氨酸和酪氨酸殘基的內(nèi)源熒光特征吸收峰，peak2主要反映蛋白質(zhì)多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的熒光特征吸收峰。通過向SPI中添加API，peak1和peak2的熒光強度顯著降低，表明API與SPI的相互作用引起了多肽鏈一定程度的伸展，一部分包埋在分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露出來，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變[23]。

(A) SPI三維熒光光譜

(B) SPI-API復(fù)合物三維熒光光譜圖6 SPI-API體系的三維熒光光譜圖

2.6 紫外-可見吸收光譜分析

圖7為向SPI溶液中依次滴加一定量的API后掃描出的紫外-可見吸收光譜圖(已扣除相應(yīng)的空白)。SPI在260 nm附近有一個強吸收峰，為蛋白質(zhì)肽鍵的特征峰，反映蛋白質(zhì)多肽鏈的變化。隨著API濃度的增加，該吸收峰的強度逐漸增大并發(fā)生紅移，表明API誘導(dǎo)SPI的肽鏈延伸，吸光度增加，構(gòu)象發(fā)生改變[24]。

2.7 圓二色光譜分析

圓二色光譜可以用來測定API誘導(dǎo)的SPI的二級結(jié)構(gòu)變化。在氮氣環(huán)境條件下，測量[SPI]:[API]分別為1:0、1:2、1:16時，復(fù)合物的圓二色光譜。圖8顯示，在200～205 nm之間有一個負(fù)峰，代表著SPI的α-螺旋的特征峰[25]，隨著API濃度的不斷增加，SPI的CD強度不斷產(chǎn)生微小減弱，峰的位置也有輕微的藍(lán)移，表明API的加入對SPI的周圍的疏水微環(huán)境和二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響[26]，通過網(wǎng)站Dichroweb在線軟件可求出加入不同濃度API后SPI的二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲)的含量。如表2所示，隨著API濃度的升高，α-螺旋含量從24.66%降至18.16%，β-折疊含量從49.33%降至35.34%，β-轉(zhuǎn)角含量從14.23%升至22.80%，無規(guī)則卷曲含量從11.69%升至23.69%，α-螺旋含量的減少表明了API與SPI結(jié)合后會導(dǎo)致蛋白質(zhì)多肽鏈部分伸展，使其暴露在疏水性環(huán)境中[27]。

λ=15 nm

λ=15 nm

表2 不同濃度API-SPI體系的二級結(jié)構(gòu)含量

2.8 API對蛋白質(zhì)表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)的表面疏水性是蛋白質(zhì)的重要特性參數(shù)，在維持蛋白質(zhì)的構(gòu)象和生物活性方面起到重要的作用[28]，采用ANS熒光探針法測定蛋白質(zhì)的疏水性。

如圖9所示，5條曲線分別代表加入的芹菜素濃度為0，6.17，12.33，18.5，24.67×10-6mol·L-1，隨著芹菜素濃度的增加，5條曲線的斜率逐漸降低，大豆分離蛋白表面疏水性指數(shù)S0逐漸下降，表明隨著加入芹菜素濃度的增大，SPI與ANS的解離能力增強，結(jié)合能力降低，ANS會更難與SPI結(jié)合，API與SPI結(jié)合會使SPI疏水性性能下降，且溶液中API濃度越大，疏水性降低越明顯[14]。

SPI/(mg·mL-1)圖9 API對ANS-SPI體系中熒光強度的影響

2.9 API對SPI游離巰基含量的影響

巰基是蛋白質(zhì)的重要功能性基團(tuán)，巰基具有抗氧化、亞硝基化、巰基-二硫鍵交換等作用。如圖11所示，隨著API含量的增加，SPI游離巰基含量明顯上升，可能是因為與API作用，使SPI的半胱氨酸殘基暴露，巰基含量增加。

API/(10-6 mol·L-1)

2.10 分子模擬

分子模擬是利用計算機以原子水平的分子模型來模擬分子的結(jié)構(gòu)和作用力[29]，通過分子模擬可以直觀地展示API與SPI的相互作用的結(jié)合模式和結(jié)合位點[30]。大豆分離蛋白不是純蛋白，其中主要成分為7s型蛋白與11s型蛋白，故分別選擇7s與11s型蛋白與芹菜素進(jìn)行結(jié)合分析。

如圖12所示，API分子插入了SPI-7s的疏水空腔中，并且被LEU226，GLN77，THR75，HIS76，ASN74等氨基酸包圍，同時，API分子與氨基酸殘基HIS76，ANS74形成2個氫鍵，鍵長分別為3.43?與4.59?。如圖13，API分子插入SPI-11s中，被THR353，THR328，MET329，LEU354，ASP342，LYS113，THR358，LYS330等氨基酸包圍，同時，API分子與氨基酸殘基ARG340，LYS330，THR358，THR328，SER339形成氫鍵，鍵長分別為5.77?，5.27?，4.55?，4.21?，3.333?。這可能是由于API本身含有3個羥基，易形成氫鍵，表明API與SPI的結(jié)合作用力主要是由范德華力和氫鍵，這與熱力學(xué)分析結(jié)果相吻合。

圖11 API與SPI-7s的結(jié)合模式圖

圖12 API與SPI-11s的結(jié)合模式圖

3 結(jié)論

本文采取了多種光譜學(xué)方法結(jié)合分子模擬技術(shù)對API與SPI的相互作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，API與SPI能夠形成復(fù)合物，其結(jié)合常數(shù)在103數(shù)量級，API的加入能使SPI的內(nèi)源熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅，氫鍵和范德華力是二者結(jié)合過程中的主要驅(qū)動力。API的加入降低了SPI的表面疏水性，增加了巰基含量，使SPI上的酪氨酸殘基與色氨酸殘基所處的微環(huán)境極性和疏水性發(fā)生改變，導(dǎo)致SPI的α-螺旋含量從24.66%降至18.16%，β-折疊含量從49.33%降至35.34%，β-轉(zhuǎn)角含量從14.23%升至22.80%，無規(guī)則卷曲含量從11.69%升至23.69%，SPI結(jié)構(gòu)變得更加疏松。分子模擬顯示API分子插入到SPI的疏水空腔中，API分子與SPI-7s的氨基酸殘基HIS76，ANS74形成2個氫鍵，與SPI-11s的氨基酸殘基ARG340，LYS330，THR358，THR328和SER339形成氫鍵。