魏延玲，劉洪巖，趙彥華*

（1.沂水縣市場(chǎng)監(jiān)督管理局，山東 臨沂276000；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京210017）

N-亞硝胺（N-nitrosamines,NAMS），是一類(lèi)含有N-N=O官能團(tuán)化合物的總稱(chēng)，一般結(jié)構(gòu)可表示為R2（R1）=N-N=O。連接在氨氮上的R1、R2官能團(tuán)可以為單個(gè)氫原子到復(fù)雜的化學(xué)取代基[1]，當(dāng)R1或R2為?；鶗r(shí)，稱(chēng)為亞硝酰胺，當(dāng)R1、R2為烷基時(shí)，稱(chēng)為亞硝胺。能夠被水蒸氣直接蒸餾出來(lái)而被測(cè)定的N-亞硝胺稱(chēng)為揮發(fā)性N-亞硝胺，否則為非揮發(fā)性N-亞硝胺[2]。

N-亞硝胺廣泛存在于腌制、風(fēng)干、烘烤等蛋白質(zhì)含量豐富的肉類(lèi)加工食品中。醫(yī)學(xué)研究證明，已知的300多種N-亞硝胺，約90%以上具有毒性、致癌性，并且該毒性可通過(guò)母嬰血胎屏障傳遞給胎兒。1978年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer）將N-亞硝胺類(lèi)化合物定義為有強(qiáng)致癌性的食源性污染源。N-亞硝胺類(lèi)化合物的致癌性具有明顯的親器官性，N-亞硝基二甲胺（NDMA）易造成動(dòng)物肝臟及腎臟的癌變，N-亞硝基二乙胺（NDEA）易造成動(dòng)物鼻腔及肝臟的癌變[2]。鑒于N-亞硝胺類(lèi)化合物的毒性及致癌性，許多國(guó)家均對(duì)食品中N-亞硝胺的限量做出了要求：美國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定腌肉制品中揮發(fā)性N-亞硝胺類(lèi)化合物總量不得超過(guò)10μg/kg[3]，俄羅斯國(guó)家的規(guī)定中要求生食品和煙熏食品中N-亞硝胺不得超過(guò)2和4μg/kg[4]，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定肉類(lèi)及肉制品和水產(chǎn)品中NDMA分別不得超過(guò)3和4μg/kg[5]。

1 N-亞硝胺的分類(lèi)

N-亞硝胺種類(lèi)繁多，其致癌性隨著烴鏈的延長(zhǎng)而逐漸降低。食品中常見(jiàn)的N-亞硝胺類(lèi)化合物見(jiàn)表1。

表1 常見(jiàn)的N-亞硝胺類(lèi)化合物

續(xù)表

2 魚(yú)肉制品中N-亞硝胺的前處理技術(shù)

魚(yú)肉制品組成基質(zhì)十分復(fù)雜，且N-亞硝胺類(lèi)化合物含量低。因此，無(wú)論何種檢測(cè)方法，樣品前處理技術(shù)都仍然是N-亞硝胺檢測(cè)的難點(diǎn)和關(guān)鍵點(diǎn)。目前魚(yú)肉制品中常用的N-亞硝胺前處理技術(shù)主要有：水蒸氣蒸餾法[6-9]、固相萃取法[10]、固相微萃 取法[11-12]、超聲波提取法[13-14]、液液萃取法[15-16]、QuEChERS法[17-21]等。

2.1 水蒸氣蒸餾法

水蒸氣蒸餾法是通過(guò)將樣品與水一起蒸餾，待測(cè)的揮發(fā)性N-亞硝胺類(lèi)化合物被蒸餾出后經(jīng)冷凝收集的前處理方法。該方法是魚(yú)肉制品中揮發(fā)性N-亞硝胺提取的傳統(tǒng)方法，不僅能有效去除魚(yú)肉制品中大部分非揮發(fā)性雜質(zhì)，還能實(shí)現(xiàn)樣品高倍數(shù)濃縮。但該法的缺點(diǎn)是樣品用量大，有機(jī)溶劑消耗量大，前處理步驟繁瑣，蒸餾時(shí)間長(zhǎng)。另外，如果魚(yú)肉制品中脂肪含量高，使用該法會(huì)有大量脂肪同時(shí)被提出，為后期的凈化造成不便，且回收率不穩(wěn)定，不適用于高通量分析。

2.2 固相萃取法

固相萃取（SPE）技術(shù)最早開(kāi)始于20世紀(jì)70年代，是一項(xiàng)集樣品分離、富集、凈化、溶劑轉(zhuǎn)換于一體的技術(shù)。該技術(shù)能有效地將待測(cè)物質(zhì)與干擾物質(zhì)分離，與傳統(tǒng)的液液萃取法相比，操作簡(jiǎn)單，待測(cè)成分回收率高。固相萃取法對(duì)環(huán)境污染小，方法簡(jiǎn)便，可操作性強(qiáng)，對(duì)樣品選擇性吸附效果好，是目前萃取、分離N-亞硝胺類(lèi)化合物最廣泛的應(yīng)用方法。

2.3 固相微萃取法

固相微萃取技術(shù)（solid-phase microextraction,SPME）是20世紀(jì)90年代開(kāi)始得到應(yīng)用的一項(xiàng)新技術(shù)[22-23]。該技術(shù)利用相似相溶的原理，通過(guò)石英纖維表面實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中待測(cè)有機(jī)成分的吸附、富集，再通過(guò)進(jìn)樣時(shí)的高溫，使待測(cè)組分從吸附劑中解吸而進(jìn)行測(cè)定。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從取樣到進(jìn)樣全自動(dòng)化的操作，方法簡(jiǎn)單，操作快捷。固相微萃取方法檢測(cè)范圍廣、污染小、檢測(cè)快速方便、檢出限高。但也有一定的缺陷，如試驗(yàn)中容易存在萃取不完全、解吸不完全、目標(biāo)物殘留等問(wèn)題，易造成檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性差。同時(shí)，固相微萃取過(guò)程中，纖維萃取頭的選取至關(guān)重要，而纖維萃取頭的價(jià)格昂貴，使用次數(shù)有限。因此，目前該方法不適用于高通量檢測(cè)[24-26]。

2.4 超聲波提取法

超聲波傳播時(shí)形成的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，能迫使樣品基質(zhì)空間距離拉大，實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)與提取溶劑之間更完全的接觸，從而加快了待測(cè)物質(zhì)從目標(biāo)基質(zhì)進(jìn)入萃取溶劑中的速度[27-28]。肉制品基質(zhì)復(fù)雜，采用超聲波提取時(shí)，會(huì)有大量干擾物質(zhì)一并提取出來(lái)，多半結(jié)合固相萃取進(jìn)行純化，才能得到理想的萃取效果。超聲波萃取為常壓萃取，安全性高，操作簡(jiǎn)單易行，設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)方便。目前該項(xiàng)技術(shù)在中藥制劑提取方面應(yīng)用較廣泛。

2.5 液液萃取法

液液萃取是指通過(guò)目標(biāo)物在兩種液相中溶解度差異將目標(biāo)物從一種液相轉(zhuǎn)移到另一種液相中的過(guò)程。N-亞硝胺類(lèi)化合物在堿性或中性溶液中溶解度一般較小，而在二氯甲烷、乙腈、醇類(lèi)等有機(jī)溶劑中溶解度相對(duì)較大，故而可利用有機(jī)溶劑來(lái)萃取N-亞硝胺類(lèi)化合物。該方法成本低，操作快捷、但是操作過(guò)程中待測(cè)物質(zhì)損耗量大。

2.6 QuEChERS法

QuEChERS法，即快速基質(zhì)分散凈化法，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速樣品前處理方法。該方法主要側(cè)重于樣品的除雜及凈化，利用的是吸附劑對(duì)樣品基質(zhì)中物質(zhì)的吸附過(guò)程。QuEChERS法前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，溶劑消耗量少，成本低，適用于高通量檢測(cè)，是目前發(fā)展速度較快的前處理方法。

3 常用的N-亞硝胺檢測(cè)方法

目前，魚(yú)肉中用于N-亞硝胺的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-氮磷檢測(cè)法、氣相色譜-熱能分析儀法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。

3.1 氣相色譜-質(zhì)譜法

氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）是結(jié)合氣相色譜的分離能力和質(zhì)譜確定分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)的能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)多組分復(fù)雜混合物未知組分的定性和定量分析，可同時(shí)完成目標(biāo)物的分離和鑒定。該方法多用于復(fù)雜基質(zhì)中易揮發(fā)且熱穩(wěn)定強(qiáng)的目標(biāo)物的分析[29]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的靈敏度高，定性準(zhǔn)確，但對(duì)于不易氣化、熱穩(wěn)定性差的N-亞硝胺類(lèi)化合物較難檢測(cè)[30]。

3.2 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

采用質(zhì)譜分析時(shí)，普遍存在基質(zhì)效應(yīng)的問(wèn)題，基質(zhì)效應(yīng)可減弱或增強(qiáng)目標(biāo)物的信號(hào)，從而影響檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS），抗干擾能力較單質(zhì)譜強(qiáng)，對(duì)于低分子質(zhì)量的化合物靈敏度相對(duì)較高，選擇性相對(duì)較強(qiáng)，更適合復(fù)雜食品基質(zhì)中N-亞硝胺類(lèi)化合物的分析檢測(cè)[3]。翟孟婷等[31]通過(guò)氫氧化鋇堿溶液對(duì)樣品進(jìn)行皂化除雜，上清液經(jīng)二氯甲烷萃取，提取液濃縮經(jīng)GC-MS/MS分析檢測(cè)。試驗(yàn)選取極性的DBWAXUI為色譜柱，確定目標(biāo)物保留時(shí)間、母離子及兩個(gè)二級(jí)離子響應(yīng)比值，采用內(nèi)標(biāo)物制作校正曲線(xiàn)，用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，得出的方法定量限為0.25～0.76μg/kg，加標(biāo)回收率為71.6%～133.8%。該方法能夠滿(mǎn)足水產(chǎn)品和加工肉制品中N-亞硝胺的檢測(cè)需求。

3.3 氣相色譜-氮磷檢測(cè)法

氮磷檢測(cè)器（NPD）是一種適用于含磷、氮物質(zhì)檢測(cè)的專(zhuān)屬性電離型檢測(cè)器，對(duì)含有磷、氮元素物質(zhì)的檢測(cè)具有相對(duì)較高的靈敏度[32]。N-亞硝胺類(lèi)化合物中均含有氮元素，氮磷檢測(cè)器對(duì)其有特異的響應(yīng)值，因而適用于揮發(fā)性N-亞硝胺的痕量分析[30]，但氮磷檢測(cè)器價(jià)格昂貴且專(zhuān)用性強(qiáng)，一般實(shí)驗(yàn)室很難配備。

3.4 氣相色譜-熱能分析儀法

熱能分析儀（TEA）是一款專(zhuān)門(mén)用于檢測(cè)N-亞硝基化合物的檢測(cè)器，其工作過(guò)程為T(mén)EA裂解室利用高溫將經(jīng)過(guò)色譜分離后進(jìn)入裂解室的目標(biāo)物中的N-NO鍵斷裂，斷裂后的亞硝基被臭氧氧化，形成能夠衰變并發(fā)出特征光波的電子激發(fā)態(tài)二氧化氮，繼而可根據(jù)輻射強(qiáng)度判斷N-亞硝胺含量[33]。馬興等[8]改進(jìn)了國(guó)標(biāo)方法，通過(guò)快速水蒸氣蒸餾，采用N-亞硝基二異丙胺作為內(nèi)標(biāo)，結(jié)合氣相色譜熱能分析儀，熱能分析儀接口溫度250℃，熱解室溫度500℃，所得方法檢出限能滿(mǎn)足肉制品和水產(chǎn)品的國(guó)家限量要求。相比于應(yīng)用更為廣泛的GC-MS，GC-TEA的靈敏度更高，尤其是在針對(duì)存在相似物質(zhì)干擾時(shí)，GC-TEA的穩(wěn)定性和重復(fù)性更好，但TEA只針對(duì)亞硝基化合物的檢測(cè)，且其價(jià)格較為昂貴，應(yīng)用面窄，一般實(shí)驗(yàn)室很難配備。

3.5 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS），將樣品溶液注入HPLC色譜柱中，待測(cè)物質(zhì)在流動(dòng)相的作用下，利用待測(cè)物質(zhì)與固定相不同的相互作用來(lái)分離待測(cè)物質(zhì)，然后再將洗脫后的待測(cè)組分引入質(zhì)譜儀中進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)。該方法檢測(cè)范圍較廣，不僅適用于小分子質(zhì)量、揮發(fā)性N-亞硝胺的檢測(cè)，對(duì)于非揮發(fā)性或熱不穩(wěn)定的N-亞硝胺類(lèi)化合物也具有較高的分析能力。

3.6 其他方法

N-亞硝胺的檢測(cè)方法還有氣相色譜-氫火焰檢測(cè)器法、膠束電動(dòng)色譜法、電化學(xué)法、紫外-可見(jiàn)分光光度法等。由于這些方法均存在一定局限性，靈敏度低、缺乏特異性、準(zhǔn)確度較低、重復(fù)性差，已經(jīng)逐漸被其他檢測(cè)儀器所取代。

4 討論與展望

N-亞硝胺類(lèi)化合物廣泛存在于各類(lèi)食品及環(huán)境中，且對(duì)生物具有較強(qiáng)的毒性及致癌性，近年來(lái)對(duì)N-亞硝胺類(lèi)化合物的研究已經(jīng)成為食品安全領(lǐng)域中的一個(gè)重要研究課題。N-亞硝胺主要由亞硝酰離子與胺類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生，但是環(huán)境中的N-亞硝胺含量很低，人體內(nèi)的N-亞硝胺主要來(lái)源于加工食品中存在的N-亞硝胺及日常攝入體內(nèi)的亞硝酸鹽在人體內(nèi)的合成[34-35]。亞硝酸鹽是最常見(jiàn)的亞硝化劑，廣泛應(yīng)用于肉制品的生產(chǎn)加工中，它能有效抑制肉制品中肉毒桿菌的生長(zhǎng)，并且具有改善肉制品風(fēng)味和色澤、保水等方面的性能。

食品，尤其是魚(yú)肉制品基質(zhì)較為復(fù)雜，前處理難度較大，雖然已經(jīng)有QuEChERS法、分散液液微萃取法、固相微萃取法等改進(jìn)的快速前處理方法，但其前處理時(shí)間、凈化效果等仍然存在很大的優(yōu)化空間。目前，對(duì)N-亞硝胺的檢測(cè)多依賴(lài)于大型儀器，而對(duì)N-亞硝胺快速檢測(cè)研究卻較少。研究食品中N-亞硝胺的抑制、消除及快速檢測(cè)將是未來(lái)N-亞硝胺研究的一個(gè)重要方向。