嚴 潔，肖云華

(1.重慶市紅十字會醫(yī)院/江北區(qū)人民醫(yī)院放射科；重慶 400020;2.重慶市大足區(qū)婦幼保健院放射科，重慶 402360；3.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，重慶 400038)

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)發(fā)布2020年全球最新癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，中國的癌癥發(fā)病率和死亡率均為全球第一，約有50%的胃癌、肝癌和食道癌病例來自中國，雖然肝癌在中國的總體發(fā)病率排名第五位，但大約55%的肝癌患者在確診時已處于Ⅲ期或Ⅳ期，使得肝癌死亡率排名第二位[1]。美國的統(tǒng)計數(shù)據(jù)也顯示，在肺癌等癌癥發(fā)病率逐年下降的趨勢下，肝癌發(fā)病率仍然持續(xù)上升[2]。這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)都充分顯示肝癌防治任務重要而緊迫。

放療(RT)已廣泛用于全身各種實體腫瘤治療，但傳統(tǒng)體外RT對正常肝組織損傷較大，限制了RT在肝癌治療中的應用[3-4]。近年來，以125I放射性粒子植入為代表的近距離輻射治療因為腫瘤內(nèi)累積輻射劑量高、對周圍正常組織損傷小而逐漸在臨床推廣應用[5]。雖然放射性粒子植入治療肝癌取得了較好的臨床治療效果，但仍然需要進一步提高RT敏感度，減少輻射劑量及患者醫(yī)療費用負擔。研究表明，長鏈非編碼RNA(lncRNA)具有廣泛的生物學功能，涉及染色體劑量補償效應、基因組印跡、染色體沉默、染色質(zhì)修飾與重塑、細胞分化、基因轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控、細胞結(jié)構(gòu)完整性的維持、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運、干細胞重新編程和熱休克反應等重要生命活動過程,并且能夠調(diào)控肝癌的RT敏感度[6-8]。125I放射性粒子是否引起肝癌細胞lncRNA表達變化，以及l(fā)ncRNA在近距離輻射誘導肝癌細胞死亡過程中的作用，尚鮮有文獻報道，本研究對此進行探索并報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞株及主要試劑 人肝癌Hep3B細胞株來源于陸軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院生化教研室。DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清、PBS均購自 Hycolone公司。125I粒子活度29.6 MBq(0.8 mCi)為寧波君安藥業(yè)科技有限公司產(chǎn)品(批號：JA-210219)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人肝癌Hep3B細胞株接種于10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，細胞長滿時用 0.25% 胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行輻射。

1.2.2細胞輻射方式 將人肝癌Hep3B細胞分為實驗組(125I組)和對照組(NC組)。125I 放射性粒子輻照模式參照參考文獻[9]，采用9顆初始活度為29.6 MBq(0.8 mCi)、初始劑量率為5.32 cGy/h的粒子，其中 1 顆粒子位于圓形環(huán)中央，8顆粒子以35 mm直徑等距環(huán)形排布。125I組對數(shù)生長期細胞置于 35 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)粒子輻射裝置上方 5 mm處，給予6 Gy 劑量輻射，所有輻射過程均在細胞培養(yǎng)箱中進行。NC組細胞放于同一細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)(輻照模型設置了鉛防護，不會對NC組細胞造成輻射)。

1.2.3LncRNA提取及測序 按照上述方法對人肝癌Hep3B細胞株進行輻照處理作為125I組樣本。通過經(jīng)典的TRIzol法提取125I組及NC組的總RNA，將總RNA溶于無RNase的水中，保障樣本濃度大于100 ng/μL，體積大于35 μL。lncRNA測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司(中國北京)進行，采用去除核糖體RNA的方法構(gòu)建鏈特異性文庫[10]。首先，從總RNA中去除核糖體RNA，隨后將RNA打斷成250～300 bp的短片段，以片段化的RNA為模板，隨機寡核苷酸為引物合成cDNA第一條鏈，隨后用RNase H降解RNA鏈，并在DNA polymerase I體系下，以dNTPs(dUTP、dATP、dGTP和dCTP)為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復、加A尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選350～400 bp的cDNA。使用USER酶降解含U的cDNA第二鏈，最后進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增并獲得文庫。對文庫進行Qubit初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL，再用Agilent 2100 bioanalyzer檢測對文庫的插入片段長度進行檢測，分布在250～300 bp為符合預期。庫檢合格后，根據(jù)文庫的有效濃度及數(shù)據(jù)產(chǎn)出需求進行Illumina PE150測序。

1.2.4LncRNA生物信息分析 LncRNA測序獲得原始數(shù)據(jù)后進入信息分析流程，流程分為2個階段：測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估及l(fā)ncRNA信息挖掘。原始數(shù)據(jù)質(zhì)控合格后進行后續(xù)信息挖掘，包含lncRNA表達量分析、差異lncRNA分析、GO功能富集等分析。

1.2.5實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR) 驗證輻射應答性lncRNA125I組及NC組樣本分別提取總RNA并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進行RT-PCR，引物由Genecopoeia 公司設計合成，測定差異lncRNA的表達水平。qRT-PCR實驗使用標準實驗步驟(Tm=60 ℃)進行，50次循環(huán)，以管家基因GAPDH作為實驗內(nèi)參。結(jié)果用2-ΔΔCt相對定量法計算各組、各基因的相對表達量。然后用GraphPad Prism 8對125I組和NC組作圖，并用其自帶統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。

采用Hisat2將clean reads比對到參考基因組上[11]，使用Stringtie軟件在基于比對到基因組上的結(jié)果，將reads拼接成轉(zhuǎn)錄本[12]。 使用Cuffmerge軟件對各樣本拼接得到的轉(zhuǎn)錄本進行合并，去掉其中鏈方向不確定和轉(zhuǎn)錄本長度不超過200 nt的轉(zhuǎn)錄本，接下來利用Cuffcompare軟件跟已知數(shù)據(jù)庫進行比較，得到已知的lncRNA和Novel_lncRNA，并使用StringTie對lncRNA進行定量分析[13]。

2 結(jié) 果

2.1125I放射性粒子近距離輻射影響肝癌細胞lncRNA表達譜變化 測序結(jié)果顯示，125I組lncRNA原始數(shù)據(jù)為13.78 G，NC組lncRNA原始數(shù)據(jù)為12.97 G，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估見表1，合格判斷標準為Q20≥90%、Q30≥85%。

表1 lncRNA測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

差異lncRNA篩選標準為|log2FoldChange|>4且padj<0.01，本次實驗中得到9 206個差異lncRNAs轉(zhuǎn)錄本，其中上調(diào)4 556個，下調(diào)4 650個，差異lncRNAs轉(zhuǎn)錄本情況如圖1所示。

2.2LncRNA的qRT-PCR驗證 為了進一步驗證lncRNA測序的準確性，從9 206個差異lncRNAs轉(zhuǎn)錄本中挑出顯著差異的6個lncRNAs轉(zhuǎn)錄本進行qRT-PCR驗證。分組設置分別為125I放射性粒子輻射照射實驗組、非輻射照射對照組，通過qRT-PCR得到6種lncRNAs轉(zhuǎn)錄本在不同處理細胞中的表達水平，實驗發(fā)現(xiàn)這5種lncRNAs轉(zhuǎn)錄本的表達量變化趨勢和測序結(jié)果一致(圖2)，其中XLOC_002662、CBSL的表達水平顯著降低，XLOC_076363、TMEM189-UBE2V1、AC025165.3的表達水平顯著升高，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);AP002990.1基因表達趨勢雖然與預測結(jié)果一致，但兩組表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3LncRNA的功能預測 LncRNA生物學功能豐富，廣泛參與生物體各類重要生理過程，可在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上對靶基因的表達進行調(diào)控，并找出不同處理產(chǎn)生的差異功能通路。通過lncRNA與蛋白編碼基因的位置關(guān)系(co-location)預測lncRNA的靶基因，然后對差異lncRNA的靶基因進行功能富集分析，以此來預測lncRNA的主要功能。

對本次檢測出的9 206個差異lncRNAs轉(zhuǎn)錄本進行靶基因GO功能富集分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)差異lncRNAs轉(zhuǎn)錄本的靶基因主要功能集中在自噬體形成、DNA損傷等方面，即相關(guān)差異lncRNAs在受到輻射影響后參與細胞增殖的調(diào)控。

A.樣本火山圖；B.差異lncRNAs轉(zhuǎn)錄本熱圖。

與NC組比較，a P<0.05,b P>0.05。

圖3 6 Gy125I放射性粒子輻照與未經(jīng)輻照的Hep3B細胞差異lncRNAs GO功能富集圖

3 討 論

近年來，以125I放射性粒子植入為代表的近距離輻射治療因腫瘤內(nèi)累積輻射劑量高、對周圍正常組織損傷小而逐漸在臨床推廣應用[14-15]，取得了較好的臨床治療效果。然而研究者對125I放射性粒子誘導肝癌細胞死亡、RT抵抗、增強RT敏感性的分子機制報道較少，特別是關(guān)于125I輻射導致的肝癌細胞lncRNA表達譜變化目前不十分清楚。為了探索相關(guān)問題，作者通過設置6 Gy125I放射性粒子輻照125I組與未經(jīng)輻照的NC組進行l(wèi)ncRNA測序分析，研究其表達譜的變化情況，以期待探索新的機制、生物標志物和干預靶點，提高125I放射性粒子在肝癌RT中的臨床應用價值。

通過本次lncRNA測序分析發(fā)現(xiàn)，9 206個差異表達lncRNAs，其中上調(diào)4 556個，下調(diào)4 650個；對差異lncRNA轉(zhuǎn)錄本進行靶基因GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)其主要功能集中在自噬體形成、DNA損傷等方面，即相關(guān)差異lncRNA在受到輻射影響后參與細胞增殖的調(diào)控，這與已報道的電離輻射損傷染色體、影響細胞有絲分裂研究結(jié)果相吻合[16]。從目前檢索的文獻情況來看，這是首次報道肝癌細胞經(jīng)過125I放射性粒子照射后lncRNA表達譜的變化，本次研究為近距離輻射誘導肝癌細胞死亡分子機制、尋找新的RT標志物及干預靶點提供了新的研究思路。本研究選取表達差異較大的6個基因(|log2FoldChange|>8且padj<0.01)進行了qRT-PCR驗證，6個lncRNAs分別分布于chr12、chr5、chr20、chr1、chr11、chr21，分子長度在275～1 225 nt，平均長度632 nt。qRT-PCR驗證結(jié)果顯示其表達趨勢與lncRNA測序結(jié)果相吻合。查閱NCBI基因數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)：XLOC_002662表達與細胞死亡抑制調(diào)節(jié)功能相關(guān)；CBSL與水解酶催化轉(zhuǎn)硫途徑的第一步有關(guān)，還參與硫化氫的產(chǎn)生，而硫化氫是一種對細胞具有保護作用的氣體傳遞物質(zhì)；TMEM189-UBE2V1是相鄰TMEM189和UBE2V1基因的一種罕見但自然發(fā)生的通讀轉(zhuǎn)錄物，其通過mRNA讀取的意義及其蛋白產(chǎn)物的功能尚未確定；AC025165.3參與蛋白編碼調(diào)節(jié)；XLOC_076363在該數(shù)據(jù)庫中還沒有功能注解。這些功能注解提示lncRNA廣泛參與125I放射性粒子誘導細胞死亡的過程，其詳細機制紛繁復雜，需要在今后的研究實踐中進一步探索。

本次實驗驗證的基因數(shù)目較少，并且沒有繼續(xù)對這些基因進行更加深入的功能和機制研究，是本實驗的局限性。此外，選擇實驗的細胞株單一也是本次實驗的局限性之一。在后續(xù)實驗中，作者將進一步探討lncRNA在125I放射性粒子誘導肝癌細胞死亡過程中的分子機制。

總之，通過對125I放射性粒子輻照后的肝癌Hep3B細胞進行l(wèi)ncRNA測序，發(fā)現(xiàn)大量lncRNA參與了染色體損傷、細胞分裂增殖過程，這為進一步探索電離輻射誘導腫瘤細胞死亡分子機制、尋找RT生物標志物和干預靶點提供了新思路。