吳妙鴻, 邱珊蓮*, 林寶妹, 張帥, 洪佳敏, 鄭開斌

番石榴4個品種葉和幼果的生物活性和酚類成分研究

吳妙鴻1, 邱珊蓮1*, 林寶妹1, 張帥1, 洪佳敏1, 鄭開斌2

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建 漳州 363005；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技服務(wù)處，福州 350003)

為提高番石榴()副產(chǎn)物的綜合利用率，測定了‘珍珠’、‘水蜜’、‘紅寶石’和‘西瓜’4個品種葉和幼果提取物中的酚類與黃酮含量，并分析了其與清除DPPH?、ABTS+、HO·自由基能力和-葡萄糖苷酶抑制活性的相關(guān)性，并用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)分析了提取物的酚類成分。結(jié)果表明，4個番石榴品種葉的酚類和黃酮含量、清除自由基能力、-葡萄糖苷酶抑制活性均顯著高于幼果，‘珍珠’葉的酚類含量最高，生物活性最強。酚類、黃酮含量與清除自由基能力呈極顯著正相關(guān)(<0.01)，與-葡萄糖苷酶抑制活性呈顯著正相關(guān)(<0.05)。UPLC-MS/MS鑒定結(jié)果表明，4個品種葉酚類含量較高的均為槲皮素-3--葡萄糖苷、金絲桃苷、鞣花酸和楊梅苷，除鞣花酸外大部分存在于葉的酚類成分也存在于幼果中，且含量顯著高于幼果。因此，4個品種中，‘珍珠’葉是開發(fā)天然抗氧化劑和-葡萄糖苷酶抑制劑的優(yōu)良資源。

番石榴；葉；幼果；清除自由基；-葡萄糖苷酶抑制；酚類

番石榴()，又名芭樂、拔子、喇叭果、雞屎果等，為桃金娘科(Myrtaces)番石榴屬熱帶果樹，原產(chǎn)于熱帶美洲[1]，在我國廣泛種植于海南、云南、廣西、廣東、福建、臺灣等地區(qū)。番石榴果實清甜脆爽，香氣獨特，含有較豐富的蛋白質(zhì)、維生素A、維生素C等營養(yǎng)物質(zhì)和磷、鈣、鎂等微量元素[2]，以及果膠、生物堿、類黃酮、三萜類、皂苷等生物活性物質(zhì)[3–4]。番石榴葉則含有三萜、黃酮、鞣質(zhì)、倍半萜、揮發(fā)油等多種結(jié)構(gòu)類型的化學(xué)成分[5–10]。其果、葉具有抗氧化、抗菌、抗腹瀉、保肝、降血糖、降血脂、降血壓、抗心血管疾病和抗腫瘤等功效[11–14]。

目前，對番石榴功效的研究主要集中于番石榴葉的活性成分和生物活性。Deguchi等[15]的臨床試驗表明，番石榴葉茶能顯著降低糖尿病患者餐后血糖水平、血清中膽固醇和甘油三酯的含量。Pongsak等[16]的研究表明番石榴葉提取物中的黃酮類物質(zhì), 如桑色素-3--來蘇糖苷、桑色素-3--阿拉伯糖苷、槲皮素-3--阿拉伯糖苷等，對體內(nèi)腸道細(xì)菌的抗菌效果良好。Rizzo等[17]報道，番石榴葉中雜萜類成分guajadial、psidial A、psiguadial A和psiguadial B對抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞的生長非常有效，且比臨床化療藥物對機體的毒性更低。Ojewole[18]的研究表明鹽敏感的高血壓大鼠在靜脈注射番石榴葉提取物后，其血壓和心率均顯著降低。

番石榴種植過程中因修剪、疏果等措施會產(chǎn)生葉和幼果等副產(chǎn)物，大量的葉和幼果多被種植戶丟棄。已有研究表明這2種副產(chǎn)物均具有很高的藥用價值，可作為藥材。相對于番石榴葉，對幼果的研究還較少，對不同品種及其葉和幼果的活性成分的比較研究更少。本文以4個番石榴品種葉和幼果為研究對象，測定其提取物的酚類和黃酮含量、清除自由基能力和-葡萄糖苷酶抑制活性，并對提取物的酚類成分進行分析，旨在篩選活性較強的番石榴品種及其副產(chǎn)物(葉和幼果)，為番石榴充分開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

材料 番石榴()葉和幼果于2018年10月采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所閩臺種質(zhì)資源圃。供試品種有‘珍珠’、‘水蜜’、‘紅寶石’和‘西瓜’。每個品種隨機選取9株健康植株采集健壯葉和謝花后30 d的幼果，每3株葉或幼果混合成1個樣品，即每個品種的葉與果實均設(shè)3個重復(fù)。表兒茶素、槲皮素、根皮苷、楊梅苷、咖啡酸、異阿魏酸、阿魏酸、鞣花酸、金絲桃苷、槲皮素-3--葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品購于北京索萊寶科技有限公司，純度均≥98%。

儀器 Waters Acqutiy UPLC H-Class超高效液相色譜、Xevo TQ-S三重四級桿質(zhì)譜(美國Waters公司)；CR22N高速冷凍離心機(日本HITACHI公司);UPW-20N超純水機(北京歷元電子儀器有限公司); BS110S分析天平(德國Sartorius集團)；PC650超聲波細(xì)胞破碎儀(上海皓莊儀器有限公司); RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); GZX-9246 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司); L5S紫外分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)。

1.2 方法

葉和幼果提取物的制備 將采集的葉和果實(切塊)置于60℃烘干，用粉碎機粉碎，過80目篩,將粉末與體積分?jǐn)?shù)60%乙醇按1∶20 (/v)混合, 用超聲波破碎儀超聲提取30 min，功率為200 W,連續(xù)超聲時間3 s，超聲間隔時間4 s。提取液用高速冷凍離心機5 170×離心15 min，取上清液待測。

酚類、黃酮含量測定 參照Xu等[19]的方法測定。酚類含量測定以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，建立線性回歸方程=0.0018-0.0032 (0～300g/mL,2=0.999 5),式中，為吸光值，為沒食子酸質(zhì)量濃度(g/mL)。酚類含量以1 g干葉或幼果中所含的相當(dāng)于沒食子酸的質(zhì)量表示，單位為mg/g。黃酮含量測定以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，建立線性回歸方程=0.0026–0.0047 (0～ 300g/mL,2=0.998 8), 式中,為吸光度值，為蘆丁質(zhì)量濃度(g/mL)。黃酮含量以1 g干葉或幼果中所含的相當(dāng)于蘆丁的質(zhì)量表示，單位為mg/g。

清除自由基能力測定 參照前人[19–21]的方法測定提取物對DPPH?、ABTS+、HO?的清除能力。

-葡萄糖苷酶抑制活性測定 參照邱珊蓮等[22]的方法測定。

1.3 UPLC-MS/MS分析酚類成分

色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8m)；柱溫: 40℃；流速：0.2 mL/min；進樣體積：4L；流動相A：5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫(洗脫程序：0～5 min, 90%～10% A；5～6 min, 10% A；6～8 min, 10%～50% A；8～9 min, 50%～90%；9～10 min, 90% A)。

質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子化源(ESI)正負(fù)模式；離子源溫度：120℃；掃描方式：多級反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細(xì)管電壓：3.0 kV (正模式)、1.5 kV (負(fù)模式)；脫溶劑氣溫度：500℃(正模式)、450℃(負(fù)模式)。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

對照品溶液制備和測定 精確稱取表兒茶素、槲皮素、根皮苷、楊梅苷、咖啡酸、異阿魏酸、阿魏酸、鞣花酸、金絲桃苷、槲皮素-3--葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純甲醇配制成1.0 mg/mL的對照品儲備液。精確量取對照品儲備液，用甲醇配制成系列質(zhì)量濃度梯度為0.5、1.0、2.0、5.0和10.0g/mL的混合對照品溶液。以峰面積()對其質(zhì)量濃度(,g/mL)進行線性回歸，得到回歸方程。

表1 對照品的質(zhì)譜參數(shù)和線性關(guān)系

供試樣品制備 稱取8 g葉或幼果粉末，超聲提取液在50℃下減壓旋蒸除去乙醇，將濃縮液真空冷凍干燥，稱量并記錄凍干粉質(zhì)量。準(zhǔn)確稱取50 mg凍干粉，用甲醇定容到50 mL，配制成1 mg/mL的溶液，過0.22m有機相濾膜，取濾液待測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行線性回歸分析;采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行相關(guān)性和單因素方差分析，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著；采用OriginPro 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 提取物中酚類與黃酮含量

4個番石榴品種葉的酚類、黃酮含量均高于幼果(表2)，葉的酚類含量為148.08～165.98 mg/g，幼果為15.98～34.85 mg/g；葉黃酮含量為90.33～99.30 mg/g，幼果為9.27～25.03 mg/g。葉酚類含量依次為‘珍珠’>‘紅寶石’>‘水蜜’>‘西瓜’，‘珍珠’和‘紅寶石’間無顯著差異，但顯著高于‘水蜜’和‘西瓜’；幼果酚類含量依次為‘紅寶石’>‘珍珠’>‘水蜜’>‘西瓜’，‘紅寶石’顯著高于其余3個品種。葉黃酮含量依次為‘紅寶石’>‘水蜜’> ‘珍珠’>‘西瓜’，‘紅寶石’和‘水蜜’間無顯著差異，但顯著高于‘珍珠’和‘西瓜’；幼果黃酮含量依次為‘紅寶石’>‘珍珠’>‘水蜜’>‘西瓜’，‘紅寶石’顯著高于其余3個品種?！渲椤汀t寶石’葉的酚類和黃酮含量優(yōu)勢明顯，‘紅寶石’幼果的酚類和黃酮含量優(yōu)勢明顯。

表2 番石榴葉和幼果的酚類和黃酮含量

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)。下表同。

Data followed different letters within column indicated significant difference at 0.05 level.The same is following Tables.

2.2 對DPPH?的清除能力

在0.05～0.40 mg/mL范圍內(nèi)，4個番石榴品種葉和幼果提取物對DPPH?的清除率與提取物質(zhì)量濃度成線性量效關(guān)系(表3)。葉提取物對DPPH?的清除能力均顯著高于幼果，清除能力表現(xiàn)為‘珍珠’>‘紅寶石’>‘西瓜’>‘水蜜’，‘珍珠’與‘紅寶石’間無顯著差異，‘珍珠’顯著高于‘水蜜’和‘西瓜’；幼果提取物對DPPH?的清除能力表現(xiàn)為‘紅寶石’>‘珍珠’>‘水蜜’>‘西瓜’，與幼果的酚類和黃酮含量的變化規(guī)律一致，幼果對DPPH?的清除能力在品種間均存在顯著差異，‘紅寶石’幼果有顯著優(yōu)勢?！渲椤~提取物對DPPH?的清除能力最強。

2.3 對ABTS+的清除能力

在0.10～0.50 mg/mL范圍內(nèi)，4個番石榴品種葉和幼果提取物對ABTS+的清除率與提取物質(zhì)量濃度成線性量效關(guān)系(表3)。葉提取物對ABTS+的清除能力均顯著高于幼果，清除能力表現(xiàn)為‘珍珠’>‘紅寶石’>‘西瓜’>‘水蜜’，‘珍珠’與‘紅寶石’間無顯著差異；幼果提取物對ABTS+的清除能力表現(xiàn)為‘紅寶石’>‘珍珠’>‘水蜜’>‘西瓜’，品種間均存在顯著差異?！渲椤~提取物對ABTS+的清除能力最強。

2.4 對HO?的清除能力

在0.10～0.50 mg/mL范圍內(nèi)，4個品種番石榴葉和幼果對HO?的清除率與提取物質(zhì)量濃度成線性量效關(guān)系(表3)。葉提取物對HO?的清除能力均顯著高于幼果，清除能力為‘珍珠’>‘紅寶石’>‘水蜜’> ‘西瓜’；幼果提取物對HO?的清除能力為‘紅寶石’> ‘珍珠’>‘水蜜’>‘西瓜’。8個樣品中，‘珍珠’葉提取物對HO?的清除能力最強。

2.5 對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

4個番石榴品種葉和幼果提取物質(zhì)量濃度與抑制率均呈對數(shù)函數(shù)關(guān)系，呈拋物線形曲線(表4)。根據(jù)IC50可知，4個品種葉和幼果提取物對-葡萄糖苷酶的抑制活性均高于陽性對照組阿卡波糖(IC50為3 133.47g/mL)，葉提取物顯著高于幼果，葉提取物的抑制活性表現(xiàn)為‘珍珠’>‘水蜜’>‘西瓜’>‘紅寶石’，白肉番石榴高于紅肉；幼果提取物表現(xiàn)為‘紅寶石’>‘西瓜’>‘珍珠’>‘水蜜’，紅肉番石榴顯著高于白肉?！渲椤~提取物的抑制活性最強。

表3 番石榴葉和幼果提取物的清除自由基能力

表4 番石榴葉和幼果提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

2.6 相關(guān)性分析

從表5可見，番石榴葉和幼果的酚類、黃酮含量與清除DPPH?、ABTS+、HO?能力均呈極顯著的正相關(guān)性(<0.01, 0.909 5≤≤0.920 0;<0.01, 0.9219≤≤0.931 8)，與-葡萄糖苷酶抑制活性具有顯著的正相關(guān)性(<0.05,=0.787 0;<0.05,=0.804 1)。

2.7 酚類成分分析

10種對照品的UPLC-MS/MS總離子流圖見圖1。對4個番石榴品種葉和幼果提取物的酚類成分進行測定，所含的酚類成分相似，但含量存在差異(表6)?！渲椤汀邸~中主要酚類成分含量為槲皮素- 3-O-葡萄糖苷>金絲桃苷>鞣花酸>楊梅苷; ‘紅寶石’葉為槲皮素-3-O-葡萄糖苷>楊梅苷>金絲桃苷>鞣花酸；‘西瓜’葉為槲皮素-3--葡萄糖苷>金絲桃苷>楊梅苷>鞣花酸?！渲椤坠兄饕宇惓煞趾繛闂蠲奋?根皮苷>槲皮素-3-O-葡萄糖苷>金絲桃苷；‘水蜜’幼果為根皮苷>表兒茶素>槲皮素-3-O-葡萄糖苷>金絲桃苷；‘紅寶石’幼果為根皮苷>表兒茶素>楊梅苷>金絲桃苷；‘西瓜’幼果為槲皮素-3-O-葡萄糖苷>金絲桃苷>楊梅苷>表兒茶素?？梢?，除根皮苷外，葉的各酚類成分含量均顯著高于幼果。

表5 番石榴葉和幼果中酚類、黃酮含量與生物活性的相關(guān)性

圖1 10種對照品(2 μg/mL)的UPLC-MS/MS總離子流圖

表6 番石榴葉和幼果提取物中的酚類組分含量(mg/kg)

-: 未檢出。

-: Not detected.

3 結(jié)論和討論

3.1 葉和幼果間酚類、黃酮含量差異

酚類和黃酮是抗氧化和降血糖的重要活性物質(zhì)。從廣泛性來說，黃酮類物質(zhì)屬于酚類中的一員,但其具有C6-C3-C6的特殊分子結(jié)構(gòu)[23]。已有研究表明番石榴葉和果中均含有酚類和黃酮類物質(zhì)，但不同品種及不同部位間的含量差異較大。鄭必勝等[24]報道廣東主栽的‘紅心番石榴’的酚類、黃酮含量和抗氧化活性顯著高于‘珍珠’、‘白玉珍珠’和‘胭脂紅’品種，且果皮中的含量遠(yuǎn)高于果肉。侯峰[25]報道廣州地區(qū)番石榴葉中黃酮含量為73.5～133.4 mg/g, 平均100.5 mg/g；幼果8.6～12.3 mg/g，平均9.9 mg/g，葉中黃酮含量約是幼果的10倍。本文測定了4個番石榴品種葉和幼果的酚類和黃酮含量，結(jié)果表明不同品種間、葉與幼果間的酚類和黃酮含量均具有顯著差異。UPLC-MS/MS分析結(jié)果表明4個番石榴品種的葉提取物中主要酚類成分均為槲皮素-3--葡萄糖苷、金絲桃苷、楊梅苷、鞣花酸?！渲椤ⅰ邸?、‘紅寶石’幼果提取物中主要酚類成分為根皮苷、表兒茶素、槲皮素-3--葡萄糖苷、金絲桃苷、楊梅苷，而‘西瓜’幼果提取物不含根皮苷。槲皮素- 3--葡萄糖苷、金絲桃苷、楊梅苷是葉和幼果共有的主要酚類成分，而鞣花酸則為葉片特有的酚類成分，在幼果中未檢出。根皮苷是‘珍珠’、‘水蜜’和‘紅寶石’幼果的主要酚類成分，也是10種酚類成分中唯一1種在幼果中的含量高于葉片的成分。番石榴葉中大部分酚類成分的含量均顯著高于幼果。

3.2 酚類、黃酮含量與清除自由基能力、α-葡萄糖苷酶抑制活性的關(guān)系

4個番石榴品種葉提取物的酚類和黃酮含量、清除自由基能力、-葡萄糖苷酶抑制活性均顯著高于幼果。葉提取物酚類成分均包含表兒茶素、槲皮素、根皮苷、楊梅苷、咖啡酸、異阿魏酸、阿魏酸、鞣花酸、金絲桃苷、槲皮素-3--葡萄糖苷。除鞣花酸外，大部分存在于葉中的酚類在幼果中也有檢出，葉酚類成分的含量均明顯高于幼果(根皮苷除外)。4個品種中，‘珍珠’葉酚類含量最高，提取物對DPPH·、HO·、ABTS+等3種自由基的清除能力和對-葡萄糖苷酶抑制活性最強，因此，‘珍珠’番石榴葉用于開發(fā)抗氧化劑及-葡萄糖苷酶抑制劑最具優(yōu)勢。

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Biological Activities and Phenolic Constituents in Extracts from Leaves and Young Fruits of Four Guava Cultivars

WU Miaohong1, QIU Shanlian1*, LIN Baomei1, ZHANG Shuai1, HONG Jiamin1, ZHENG Kaibin2

(1. Institute of Subtropical Agriculture, Fujian Academy of Agricultural Sciences,Zhangzhou 363005, Fujian, China; 2. Institute of Technology Services, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China)

In order to improve the comprehensive utilization rate of the by-products of guava (), the biological activities and phenolic constituents of extracts from 4 cultivars (‘Zhenzhu’, ‘Shuimi’, ‘Hongbaoshi’, ‘Xigua’) of guava were studied. The contents of total phenols and flavonoids were determined, then the correlations between the contents of phenols and flavonoids with biological activities were analyzed, including the scavenging abilities on DPPH?, ABTS+, HO? free radicals, and the-glucosidase inhibitory activity. Furthermore, thephenolic constituents of extracts were identified by ultra-high performance liquid chromatography and the triple-quadrupole tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The results showed that the contents of total phenols and flavonoids, the free radicals scavenging abilities and-glucosidase inhibitory activity in leaves of 4 cultivars were significantly higher than those in young fruits, ‘Zhenzhu’ leaf had the highest content of total phenols as well as the most potent free radicals scavenging abilities and-glucosidase inhibitory activity. Correlation analysis revealed that the contents of phenols and flavonoids were significantly positively correlated with the scavenging abilities towards DPPH?, ABTS+, HO? free radicals (<0.01), as well as the-glucosidase inhibitory activity (<0.05). UPLC-MS/MS analysis showed that the contents of quercetin-3--glucoside, hyperoside, ellagic acid and myricitrin in leaves of 4 cultivars were high, and most of the constituents found in leaves except ellagic acid also existed in the young fruits, and the contents in leaves were higher than those in young fruits. Therefore, ‘Zhenzhu’ guava leaf could be a good resource for developing natural antioxidant and-glucosidase inhibitor among 4 cultivars.

Guava; Leaf; Young fruit; Free radical scavenging ability;-Glucosidase inhibition; Phenol

10.11926/jtsb.4416

2021-03-22

2021-06-08

福建省自然科學(xué)基金項目(2020J011369)；福建省科技計劃公益類專項(2019R1030-4)資助

This work was supported by the Project for Natural Science in Fujian (Grant No. 2020J011369), and the Special Project for Public Welfare for Research Institute in Fujian (Grant No. 2019R1030-4).

吳妙鴻(1991～ )，女，研究實習(xí)員，研究方向為天然產(chǎn)物提取與利用。E-mail: miaohongwu@qq.com

通信作者 Corresponding author. E-mail: slqiu79@163.com