譚悠久，龍文君， 朱冰舟， 董建飛， 唐 瑤，李春如，江 可，孫長勝

(1.浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司，浙江 平湖 314200；2.浙江泛亞生命科學研究院，浙江 平湖 314200)

【研究意義】蟬花，民間又稱蟲花、蟬菌、土蟲草、螺花、蟬蛻花、蟬蛹草、蟬茸、知了花、嗓啞花[1]。蟬花是一種傳統(tǒng)中藥材，最早記載于1600多年的《雷公炮炙論》。隋唐的《藥性論》記載：“蟬花味甘寒，無毒。主小兒天吊，驚癇瘈，夜啼心悸”。《本草綱目》記載：“蟬花可治療驚癇，夜啼心悸”。蟬花有較高的藥用價值[2-3]，具有改善腎功能[4-5]、抗腫瘤[6]、免疫調(diào)節(jié)[7-8]、調(diào)節(jié)脂類代謝[9]、降血糖[10]、抗氧化[11]、抗衰老[12]、抗疲勞[13]、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛[14]、改善機體營養(yǎng)狀況[15]等功效。其主要化學成分包括：氨基酸、多糖、生物堿、麥角甾醇、腺苷、蟲草酸等[16-17]。蟬花由于具有很高的食用安全性而引起研究人員的注意，有望開發(fā)成為新資源食品和新的飼料添加劑[18-19]?！厩叭搜芯窟M展】陳祝安對蟬花的人工培養(yǎng)做了大量研究工作，分離的蟬花菌株在一些自然基物或組合培養(yǎng)基上發(fā)酵可長出子實體，從而開創(chuàng)了蟬花人工培養(yǎng)途徑[20]。在蟲草類真菌人工馴化栽培過程中，菌種的退化現(xiàn)象比較嚴重，退化菌株在DNA水平上已經(jīng)產(chǎn)生明顯的遺傳變異[21]。蟬花人工培養(yǎng)過程中，也遇到菌種退化問題，彭凡通過活體柞蠶蛹和大蠟螟昆蟲侵染繁育的方式來恢復(fù)蟬花菌種生產(chǎn)性狀，但是蠶蛹和大蠟螟非天然寄主，復(fù)壯效果并不理想[22]。菌種復(fù)壯的活體昆蟲往往需要天然寄主才更為有效，蟬花的天然寄主包括竹蟬、蟪蛄、小鳴蟬和山蟬，這些寄主均不能人工養(yǎng)殖。因此，蟬花的繁育復(fù)壯需要經(jīng)野外投放來實現(xiàn)。【本研究切入點】野外繁育的蟬花，除了生產(chǎn)性狀的評價，還需要分子方法來進行鑒別?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過在毛竹林進行野外繁育復(fù)壯獲得蟬花菌株，進行子實體培養(yǎng)評價、SCAR和ISSR分子標記分析。本研究結(jié)果旨在獲得適合工廠化培養(yǎng)的高產(chǎn)、穩(wěn)定蟬花菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株

繁育出發(fā)蟬花菌株A17-7-1，由浙江泛亞生命科學研究院提供；蟬花繁育獲得菌株由A17-7-1培養(yǎng)物2014年4月投放于浙江安吉的野外繁育毛竹林，2014年7月從野外繁育基地采集分離獲得，共獲得7個菌株，菌株編號分別為14AJ10、14AJ11、14AJ12、14AJ13、14AJ14、14AJ15、14AJ16。

1.2 菌株子實體培養(yǎng)篩選

按照每個罐頭瓶裝40 g小麥，水70 mL，用透氣膜封口，121 ℃滅菌40 min，自然冷卻后接種5 mL蟬花菌株搖瓶種子液,每組重復(fù)5瓶，置22～23 ℃培養(yǎng)室光照培養(yǎng)25 d后采收子實體，于60 ℃烘干后稱重統(tǒng)計。

1.3 SCAR分子標記

將獲得子實體產(chǎn)量明顯高于A17-7-1的菌株提取基因組DNA進行ISSR分子標記分析。

SCAR分子標記引物：S11-2-F3 GTAGACCCGTGTTGTATGACAAACT；S11-2-R3 GTAGACCCGTAAGGAGACGGAGGAT，為菌株A17-7-1特異性DNA片段引物，由上海生工生物工程公司合成。其擴增體系見表1。

PCR擴增程序：先95 ℃ 5 min；然后依次95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2分30 s，共循環(huán)35次；然后72 ℃ 10 min，最后降溫至4 ℃保存。凝膠電泳：PCR產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，時間40 min。拍照記錄。

表1 擴增體系

1.4 ISSR分子標記

將繁育出發(fā)菌株及獲得的繁育子實體產(chǎn)量增加明顯菌株菌絲，加液氮研磨，以CTAB+酚氯仿法提取菌株的總DNA；對待檢菌株DNA分別采用下列引物進行PCR擴增，引物由上海生工生物工程公司合成。

所采用的PCR擴增反應(yīng)體系如下：以P5、P12、P13、M8、M10、M11為引物的反應(yīng)擴增體系總體積為15 μL。DNA樣本：20～50 ng，dNTP：3 nmol，引物：3 pmol，Taq酶：1 U，酶反應(yīng)緩沖液：1.5 μL，加雙蒸水至15 μL。以P18、P19為引物的反應(yīng)擴增體系總體積為20 μL。DNA樣本：20～50 ng，dNTP：4 nmol，引物：4 pmol，Taq酶：1 U，酶反應(yīng)緩沖液：2 μL，加雙蒸水至20 μL(表2)。

以P5、P19和M11為引物的PCR擴增反應(yīng)條件如下：先94 ℃ 5 min；而后依次94 ℃ 20秒，48 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共循環(huán)35次；然后72 ℃延伸5 min，最后降溫至4 ℃；以P12和M8為引物的PCR擴增反應(yīng)條件如下：先94 ℃ 5 min；而后依次94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共循環(huán)35次；然后72 ℃延伸5 min，最后降溫至4 ℃；以P13和M10為引物的PCR擴增反應(yīng)條件如下：先94 ℃ 5 min；而后依次94 ℃ 20 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共循環(huán)35次；以P18為引物的PCR擴增反應(yīng)條件如下：先94 ℃ 5 min；而后依次94 ℃ 20 s，53.5 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共循環(huán)35次。

表2 ISSR擴增引物

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬花子實體培養(yǎng)篩選

將獲得的7個蟬花菌株及A17-7-1菌株進行子實體培養(yǎng)篩選，結(jié)果顯示菌株之間子實體產(chǎn)量差異明顯，其中菌株14AJ10和14AJ13實體長、密生、粗壯，產(chǎn)量分別為每瓶6.65和6.37 g。14AJ10菌株子實體產(chǎn)量高于繁育出發(fā)菌株17-7-1 5.75 g每瓶的產(chǎn)量，差異顯著；14AJ13菌株子實體產(chǎn)量略高于繁育出發(fā)菌株17-7-1，但差異不顯著；14AJ11、14AJ15菌株子實體短、密生、細小；14AJ12子實體短、密生、較粗；14AJ14、14AJ16菌株子實體短、稀疏、細小。14AJ11、14AJ12、14AJ14、14AJ15、14AJ16等5個菌株子實體產(chǎn)量顯著遠低于A17-7-1菌株。結(jié)果見表3和圖1。

表3 繁育蟬花菌株的篩選

2.2 SCAR分子標記

由圖2顯示，通過對繁育獲得7個菌株SCAR 標記分析，14AJ10和14AJ13菌株擴增出A17-7-1具有特異條帶，分子量約2200 bp，表明14AJ10和14AJ13菌株是由A17-7-1繁育獲得。14AJ11、14AJ12、14AJ14、14AJ15、14AJ16等5個菌株未能擴增出條帶，表明這5個菌株不含特異性片段，為竹林中本來就存在的菌株。

2.3 ISSR分子標記

依據(jù)子實體篩選培養(yǎng)結(jié)果和SCAR分析結(jié)果，選擇子實體產(chǎn)量提高的菌株14AJ0和14AJ13與A17-7-1菌株進行ISSR分析。利用6個ISSR引物對A17-7-1蟬花菌株基因組DNA進行擴增，共計擴增出31個條帶，擴增出的條帶大小在100～2000 bp之間。P18引物擴增出8個條帶，M10引物擴增出7個條帶，P13擴增出2個條帶，M11擴增出5條條帶，P19擴增出5個條帶，P5 擴增出4個條帶。6個引物對14AJ10菌株DNA進行擴增，結(jié)果擴增出的所有條帶均與A17-7-1菌株的條帶完全一致，表明菌株14AJ10較好的保持了A17-7-1的遺傳特性。6個引物對14AJ13菌株DNA進行擴增，M10引物擴增條帶相比于A17-7-1，在1500、1200 bp處各有一個條帶缺失，其余引物擴增的條帶與A17-7-1菌株一致，表明14AJ13菌株部分遺傳特性發(fā)生了改變(圖3)。

3 討 論

A17-7-1菌株是經(jīng)過多年選育獲得可用于生產(chǎn)的蟬花菌株，但由于傳代較多，子實體生產(chǎn)生產(chǎn)性能有一定的下降。通過野外繁育復(fù)壯，獲得7個菌株。7個菌株經(jīng)子實體培養(yǎng)比較，有的菌株子實體產(chǎn)量較高，也有的菌株子實體產(chǎn)量非常低。其中14AJ10和13AJ13菌株子實體產(chǎn)量高于A17-7-1菌株，很可能是經(jīng)野外繁育而來。但由于獲得的7個菌株是從野外采集分離純化而得，很有可能部分菌株是本來就分布于竹林的菌株，需要進行分子鑒別。SCAR 分子標記是重復(fù)性好、可靠性高的分子標記技術(shù)，不同菌株的 DNA 差異可通過單一條帶的出現(xiàn)與否加以判斷，是一種非常方便、快捷，可用于快速檢測大量個體的方法[23]。因此將7個菌株與A17-7-1進行SCAR 標記分析，可快速有效的判定是否來源于A17-7-1的野外繁育復(fù)壯。經(jīng)SCAR標記分析，14AJ10和14AJ13菌株擴增出A17-7-1特有的條帶，表明14AJ10和14AJ13菌株是經(jīng)野外繁育而來，占獲得菌株的28.57%。盡管繁育獲得的菌株不多，但菌株經(jīng)過侵染蟲體，子實體生產(chǎn)性能有了一定的恢復(fù)，證明了野外繁育蟬花具有有一定的效果。其余菌株未能擴增出A17-7-1特有的條帶，應(yīng)該是竹林原先就存在的菌株蟬花。

ISSR是一種操作簡單、高效的檢測手段，常用于真菌遺傳多態(tài)性分析和種內(nèi)菌株親緣關(guān)系的區(qū)分[24]。將子實體生產(chǎn)能力提高，且經(jīng)SCAR標記確認的14AJ10、14AJ13菌株與菌株A17-7-1進行ISSR分析，發(fā)現(xiàn)14AJ10菌株擴增出的條帶與A17-7-1產(chǎn)生的條帶完全一致，表明14AJ10菌株不僅子實體產(chǎn)量上升，且遺傳性狀相對穩(wěn)定。14AJ13菌株子實體產(chǎn)量增加不明顯，但經(jīng)ISSR分析發(fā)現(xiàn)，與A17-7-1相比較，14AJ13菌株的M10引物擴增條帶有部分缺失，表明14AJ13菌株遺傳性狀有了明顯的變化。通過蟬花野外繁育菌株的篩選和分子鑒別，初步建立了蟬花野外繁育復(fù)壯菌株的子實體培養(yǎng)篩選、菌株分子鑒別體系，也獲得子實體產(chǎn)量提高的菌株，繁育復(fù)壯獲得的菌株有望應(yīng)用于生產(chǎn)中。