曲自成，唐鑫華，孫 宇，任智新，彭 露，石 瑛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

【研究意義】馬鈴薯是全球四大主糧作物之一，塊莖可作為主糧及飼料，又有一定藥用價值，具有健胃，解毒，消腫的功效[1]。世界上大約有2/3 的人口以馬鈴薯作為主糧，馬鈴薯的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)對于保障世界糧食安全有重要作用[2]。鐵元素為植物生長發(fā)育所必需，是合成葉綠素的必要組分、參與植物光合作用、呼吸作用以及胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)、電子傳遞[9]。雖然在土壤中鐵元素含量較高，但在中性和堿性土壤中多以不溶的Fe3+的形式存在，無法被植物吸收利用，使得植物可能無法獲得足夠的鐵元素以維持生命活動[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球鹽堿地面積為 9.54 ×108hm2，并且以每年 1.0×106hm2的速度在增長，其中中國鹽堿地面積為9.913×107hm2，涉及19個省份，其中包括馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)松嫩平原[4]?，F(xiàn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展因鹽堿地區(qū)鐵元素失調(diào)嚴(yán)重受限，相關(guān)研究需要進(jìn)一步完善，因此，培育和篩選高效吸收、利用鐵元素的馬鈴薯品種，對于提高馬鈴薯產(chǎn)量起著重要作用。其中，深入研究作物響應(yīng)鐵鹽脅迫的機(jī)理及篩選響應(yīng)鐵鹽脅迫的相關(guān)基因是解決因作物鐵素失調(diào)導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)的有效途徑之一。本試驗(yàn)以馬鈴薯作物為試驗(yàn)材料，篩選得到高效響應(yīng)鐵鹽脅迫的馬鈴薯NAC轉(zhuǎn)錄因子，并分析其時空表達(dá)特性，可為馬鈴薯耐鐵鹽脅迫相關(guān)分子育種及NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的深入研究提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】NAC (NAM， ATAF和CUC)是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子大家族，調(diào)控著植物生長、發(fā)育、衰老相關(guān)的多個過程[5]，小麥中TaNAC67轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控穗長和每穗小穗數(shù)[6]。NAC轉(zhuǎn)錄因子與植物應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，一些NAC基因?yàn)樯?、非生物脅迫所誘導(dǎo)[7]，如VND7基因在擬南芥中有調(diào)節(jié)干旱脅迫的作用[8]，鹽芥中TsNAC1基因調(diào)控鹽脅迫響應(yīng)[9]。Huang[10]等在番茄中發(fā)現(xiàn)了對番茄黃葉卷曲病毒感染有反應(yīng)的6種NAC轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子還與蛋白磷酸酶和絲裂原活化蛋白激酶以及轉(zhuǎn)錄因子有相互作用。NAC轉(zhuǎn)錄因子具有顯著的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即蛋白的N端都有一個高度保守的約150個氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域，含有 A、B、C、D、E 5個亞結(jié)構(gòu)域，其中亞域 C 可能與結(jié)合 DNA 有關(guān)，亞域 E 可能參與發(fā)育時期調(diào)控和(或)組織特異性，并協(xié)同亞域D 與 DNA 發(fā)生相互作用[11]。轉(zhuǎn)錄因子不僅僅可以通過轉(zhuǎn)錄激活功能調(diào)控基因的表達(dá)，直接調(diào)節(jié)植物對脅迫環(huán)境的耐受能力，還可以通過在各種生化代謝途徑中發(fā)揮調(diào)節(jié)因子的作用從而調(diào)控植物的脅迫耐受力。如何健美[12]等對水稻中OsNAC2基因的研究表明，OsNAC2可能同時參與 IAA與GA的代謝途徑，調(diào)節(jié)根的生長發(fā)育，從而影響植物的抗旱性。楊麗麗以馬鈴薯品種大西洋無菌試管苗為試驗(yàn)材料研究發(fā)現(xiàn)缺Fe2+脅迫會導(dǎo)致馬鈴薯葉片葉綠素含量顯著降低，結(jié)合差異蛋白質(zhì)組分析馬鈴薯在缺Fe2+脅迫下的葉片差異蛋白，共發(fā)現(xiàn)146個差異蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)功能涉及光合作用、代謝、細(xì)胞防御、氧化還原、骨架蛋白、轉(zhuǎn)錄翻譯、生長素響應(yīng)等多種功能范疇[13]。王玉萍以馬鈴薯品種大西洋無菌試管苗為試驗(yàn)材料研究發(fā)現(xiàn)缺Fe2+影響碳水化合物代謝和根系建成,造成馬鈴薯總根長度減少但平均直徑增加[14]。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在植物響應(yīng)逆境脅迫時起重要作用，但有關(guān)馬鈴薯響應(yīng)鐵鹽脅迫的研究及報(bào)道較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序并結(jié)合qRT-PCR技術(shù)、生物信息學(xué)分析，對馬鈴薯NAC轉(zhuǎn)錄因子在鐵鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平及時空差異進(jìn)行分析，明確其在鐵鹽脅迫下的表達(dá)特性。本研究將明確馬鈴薯NAC轉(zhuǎn)錄因子參與響應(yīng)鐵鹽(Fe2+)脅迫的表達(dá)模式及特性?！緮M解決的問題】研究結(jié)果為馬鈴薯耐鐵鹽脅迫相關(guān)分子育種及NAC轉(zhuǎn)錄因子家族深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯組培苗培育條件及處理方法

試驗(yàn)使用繼代后生長20 d的馬鈴薯品種東農(nóng)312組培苗，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度23 ℃，16 h光照，8 h黑暗。分別用Fe2+為 1 μmol/L(缺鐵處理)、100 μmol/L(對照)和500 μmol/L(過量鐵處理)的MS培養(yǎng)液處理組培苗0、48、96 h，處理后培養(yǎng)條件與上述一致。以100 μmol/L Fe2+處理組為對照，在處理0、48、96 h時取葉、莖、根鮮樣，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2 總RNA的提取及cDNA鏈的合成

RNA提取方法參照Tang[15]，使用康為公司(HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA。

1.3 實(shí)時定量PCR引物的設(shè)計(jì)

基于前期馬鈴薯品種東農(nóng)312轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，共獲得7個差異表達(dá)的NAC轉(zhuǎn)錄因子，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時定量PCR引物(表1)。

1.4 實(shí)時定量PCR檢測

實(shí)時定量PCR試驗(yàn)以ef1α(內(nèi)參基因)表達(dá)量作為對照。根據(jù)(ULtraSYBR Mixture)試劑盒(康為公司，北京)說明書配置反應(yīng)體系，反應(yīng)體系含cDNA 2 μL，正、反引物各0.5 μL，2 × UltraSYBR Mixture 10 μL，ddH2O 7 μL，總體積20 μL。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃10 min，95 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，共40個循環(huán)。在(型號Line Gene 9620)實(shí)時定量PCR儀上檢測內(nèi)參及目的基因表達(dá)量。采用2-△△Ct算法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，△△Ct=[(CT處理-CT內(nèi)參) - (CT對照-CT內(nèi)參)]。每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

表1 實(shí)時定量PCR引物的設(shè)計(jì)

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 23.0對實(shí)時定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Graphpad 7軟件繪圖。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用Expasy提供的在線工具 Protparam(https://web.expasy.org/protparam/ )對NAC1-7基因編碼蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分子量、理論等電點(diǎn)、等理化性質(zhì)的分析。利用SMART在線工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺鐵鹽處理下7個基因相對表達(dá)量分析

在根部，除NAC6、NAC2以外，其它NAC基因在缺鐵處理48 h時表達(dá)量顯著下調(diào)。NAC2、NAC5、NAC6、NAC7在缺鐵處理96 h時表達(dá)量顯著上調(diào)，分別為CK組的27.3、7.3、8.9、4.53倍，NAC2、NAC5、NAC7在這兩個時間節(jié)點(diǎn)的表達(dá)量隨著脅迫時間的增加呈先下調(diào)后上調(diào)的趨勢。NAC1、NAC3、NAC4在缺鐵處理48、96 h時表達(dá)量均顯著低于CK組。受缺鐵誘導(dǎo)表達(dá)量變化最顯著的是NAC2，在缺鐵處理48、96 h的表達(dá)量分別為CK組的0.7、27.3倍(圖1)。在莖中，除NAC2外，其它NAC基因在缺鐵處理48 h時的表達(dá)量均顯著上調(diào)，為CK組的2.4～11.2倍。NAC3、NAC5、NAC6、NAC7在缺鐵處理96 h的表達(dá)量均顯著低于CK。NAC1、NAC4在兩個時間節(jié)點(diǎn)的表達(dá)量較CK組均顯著上調(diào)(圖2)。在葉中，所有NAC基因在缺鐵處理48、96 h時的表達(dá)量均低于CK組(圖3)。

2.2 過量鐵鹽處理下7個基因相對表達(dá)量分析

在根部，NAC2、NAC5在處理48 h的表達(dá)量較CK組顯著上調(diào)，NAC1、NAC4的表達(dá)量較CK組顯著下調(diào)。NAC1、NAC2、NAC6、NAC7在處理96 h時的表達(dá)量顯著上調(diào)，為CK組的5.2～24.9倍。NAC2在處理48、96 h時的表達(dá)量均顯著高于CK組，分別為CK組的4.1、24.9倍(圖4)。在莖中，除NAC2、NAC5、NAC7外，其它NAC基因在處理48 h的表達(dá)量較CK組均顯著上調(diào)且為最高值。處理至96 h時，NAC3、NAC6的表達(dá)量較CK組顯著下調(diào)，在兩個時間節(jié)點(diǎn)呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢。NAC1、NAC4在兩個時間節(jié)點(diǎn)表達(dá)量較CK組均顯著上調(diào)。NAC7在兩個時間節(jié)點(diǎn)表達(dá)量較CK組均顯著下調(diào)，在處理48 h的表達(dá)量僅為CK組的8%。NAC5在兩個處理時間點(diǎn)的表達(dá)量較CK組均無顯著變化(<對照組兩倍，圖5)。在葉中，除NAC7在處理96 h時表達(dá)量與CK組無顯著差異外，所有NAC基因在兩個時間節(jié)點(diǎn)表達(dá)量均顯著低于CK組(圖6)。

2.3 NAC1～NAC7 編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

NAC1～NAC7的ORF編碼蛋白含有192～413個氨基酸，預(yù)測分子量為22.81～46.98 kDa，PI值為4.65～9.23(表2)。NAC1～NAC7的ORF所編碼蛋白均含有NAM結(jié)構(gòu)域。

3 討 論

馬鈴薯組培所用的標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基Fe2+濃度為100 μmol/L[16]，因此本試驗(yàn)選用Fe2+濃度為100 μmol/L的MS作為對照，并以該Fe2+濃度做為參考設(shè)置兩個處理(缺鐵1 μmol/L和過量鐵500 μmol/L)。在缺鐵處理下，NAC1～NAC7的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的時空特異性，在莖、根中均有顯著表達(dá)，在葉中的表達(dá)量顯著低于根、莖部，所述表達(dá)差異可能是由基因表達(dá)的組織特異性導(dǎo)致，如擬南芥中響應(yīng)低鐵鹽脅迫的8個基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性，AtFRO2和AtFRO3在根中，AtFRO5和AtFRO6主要在芽和花，而AtFRO7在葉片的表皮毛和子葉中，AtFRO8在葉脈中表達(dá)[17]。NAC3、NAC4在莖中表達(dá)量顯著上調(diào)，但在根、葉中的表達(dá)量均顯著低于對照組，推斷得出它們在莖中特異表達(dá)，響應(yīng)缺鐵脅迫。

表2 7個NAC蛋白的特征

表3 7個NAC蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

植物根部負(fù)責(zé)有機(jī)營養(yǎng)和礦質(zhì)元素的吸收的吸收，在鐵鹽脅迫下，根系會做出一系列反應(yīng)進(jìn)行應(yīng)對。如紫花苜蓿在缺鐵條件下，根系會顯著增長，須根也會顯著增多以增加鐵元素的吸收[18]。云香水仙NtNAC1基因在NaCl脅迫下，同一處理時間點(diǎn)在根中的表達(dá)量上調(diào)大于葉。本試驗(yàn)中NAC2在缺鐵、過量鐵脅迫下，在根中表達(dá)量上調(diào)最為顯著，與云香水仙NtNAC1基因響應(yīng)非生物逆境脅迫表達(dá)模式一致[19]。馬鈴薯屬雙子葉草本植物，通過機(jī)理I吸收鐵元素。該機(jī)理包括3個過程①H+-ATPase泵系統(tǒng)， 分泌H+降低土壤pH值， 增加根際土壤顆粒中鐵的可溶性；②Fe3+還原系統(tǒng)， 包括將Fe3+還原成Fe2+的還原酶和與之耦聯(lián)的NADPH脫氫酶；③Fe2+的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，包括一系列的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將還原的亞鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)， 再由其它轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輸送到各個細(xì)胞器和器官中供利用[20]。NAC2在缺鐵、過量鐵脅迫下的馬鈴薯植株的莖、根部位均強(qiáng)烈表達(dá)，隨缺鐵和過量鐵處理時間的增加其在根部的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著增加趨勢，且表達(dá)量變化最為顯著，與鐵毒耐受性水稻珍汕97 B中OSIR1基因主要表達(dá)部位及趨勢一致[21]，同時也有研究指出OSIR1基因也受缺鐵脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[22]。推測NAC2表達(dá)模式與OSIR1類似，在響應(yīng)缺鐵和過量鐵脅迫中起重要作用。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)馬鈴薯NAC轉(zhuǎn)錄因子參與響應(yīng)鐵鹽脅迫；在缺鐵和過量鐵脅迫下，NAC1～NAC7存在組織特異性表達(dá)，且表達(dá)量隨處理時間的增加變化顯著，在根和莖中均呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)，在葉中無顯著上調(diào)表達(dá)；生物信息學(xué)分析表明NAC1～NAC7編碼蛋白含有192～413個氨基酸，預(yù)測分子量為22.81～46.98 kDa，PI值為4.65～9.23，均含有NAM結(jié)構(gòu)域。