陳雪陽(yáng) 高蓉蓉 王勤美 黃錦海

作者單位：溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 325027

角膜膠原交聯(lián)術(shù)（Corneal collagen cross-linking，CXL）是一種增加角膜硬度并維持角膜生物力學(xué)穩(wěn)定性的光化學(xué)方法。20世紀(jì)90年代，美國(guó)理工大學(xué)的研究人員首次提出將核黃素-紫外光誘導(dǎo)的角膜膠原交聯(lián)術(shù)（Collagen crosslinking by riboflavin-ultraviolet-A，UVX）作為治療進(jìn)展性圓錐角膜的方法[1]。經(jīng)過(guò)多年的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)探索和臨床研究，該技術(shù)的適應(yīng)癥范圍不斷擴(kuò)大，目前可用于多種角膜疾病的治療，包括LASIK術(shù)后導(dǎo)致的角膜擴(kuò)張性疾病、感染性角膜炎、角膜移植術(shù)后復(fù)發(fā)的圓錐角膜等，均取得較好效果。傳統(tǒng)UVX的局限性和不良反應(yīng)不容忽視，包括要求治療的角膜厚度最少達(dá)400 μm、治療過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)以及對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞有潛在毒性作用等[2]。玫瑰紅-綠光角膜膠原交聯(lián)術(shù)（Collagen cross-linking by rose bengal-green light，RGX）是Cherfan等[2]在2013年提出的一種新型CXL技術(shù)，很好地解決了UVX的不足。本文將對(duì)RGX的原理和過(guò)程、安全性與有效性、與UVX的比較及其在眼部的應(yīng)用等進(jìn)行綜述。

1 RGX的原理和過(guò)程

孟加拉玫瑰紅（Rose bengal，RB）是一種鹵化的黃嘌呤染料，常用作生物和非生物系統(tǒng)中氧化的光敏劑，是食品藥品監(jiān)督管理局（Food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的角膜表面損傷診斷劑[3]，其分子式為C20H2CL4I4Na2O5，分子量為1 017.64，具有親水性（見(jiàn)圖1）。RGX的原理是RB強(qiáng)烈吸收532 nm處的綠光，被激活后通過(guò)電子轉(zhuǎn)移機(jī)制和單線態(tài)氧（1O2*）機(jī)制使角膜中蛋白質(zhì)分子之間形成共價(jià)鍵發(fā)生光化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)[4]，從而有效增強(qiáng)角膜硬度和抗形變能力[2]。角膜中的RB分子吸收綠光后被激發(fā)為單重態(tài)（1RB*），然后激發(fā)為三重態(tài)（3RB*）。后續(xù)的反應(yīng)包括2種機(jī)制（見(jiàn)圖2）：I型機(jī)制，能量轉(zhuǎn)移途徑：當(dāng)缺乏O2時(shí)，3RB*通過(guò)從供體分子（如胺）接收電子，形成RB的陰離子自由基（RB·-）和供體分子的陽(yáng)離子自由基（Donor·+），Donor·+去質(zhì)子化和重排產(chǎn)生的自由基中間體以及RB·-質(zhì)子化形成的額外自由基都可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)共價(jià)交聯(lián)；II型機(jī)制，能量轉(zhuǎn)移途徑：當(dāng)存在足夠的O2時(shí)，3RB*將能量轉(zhuǎn)移到O2生成與某些氨基酸（主要是組氨酸）發(fā)生反應(yīng)，在蛋白質(zhì)分子之間產(chǎn)生共價(jià)鍵[3-4]。Wertheimer等[4]研究表明當(dāng)缺乏O2時(shí)，加入的生物分子（精氨酸）將電子轉(zhuǎn)移到3RB*上產(chǎn)生引發(fā)交聯(lián)的反應(yīng)性中間體，通過(guò)電子轉(zhuǎn)移途徑來(lái)增強(qiáng)交聯(lián)效果；當(dāng)存在O2時(shí)，加入疊氮化鈉（1O2*淬滅劑）和重水（延長(zhǎng)1O2*的存在時(shí)間），分別通過(guò)抑制和增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移途徑明顯抑制和增強(qiáng)交聯(lián)效果。本研究證實(shí)2種途徑均能有效地增強(qiáng)角膜硬度，但以II型機(jī)制為主。

RGX的過(guò)程與傳統(tǒng)的UVX過(guò)程類似，術(shù)中先去除角膜中央上皮，用0.1%RB（溶于PBS中）浸潤(rùn)角膜一定時(shí)間后，再用532 nm的綠光照射角膜。目前對(duì)于RGX的實(shí)施參數(shù)并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用的RGX方案（包括RB浸潤(rùn)時(shí)間、綠光的輻照度以及照射時(shí)間）有所差異：Bekesi等[5]和Gallego等[6]采用浸潤(rùn)2 min——照射200 s——浸潤(rùn)30 s——照射200 s（輻照度0.25 W/cm2，總能量100 J/cm2）；Cherfan等[2]和Zhu等[7]采用浸潤(rùn)2 min——照射10 min，在3.3min和6.7 min時(shí)額外滴加RB浸潤(rùn)30 s（輻照度0.25 W/cm2，總能量150 J/cm2）；Wang等[8]采用浸潤(rùn)20 min（5 min/次×4次）——黑暗中靜置10 min——照射120 s——浸潤(rùn)30 s——照射130 s（輻照度0.4 W/cm2，總能量100 J/cm2）。

圖1.Rose bengal的分子式Figure 1.The formula of Rose bengal.

圖2.RGX的光化學(xué)途徑I型機(jī)制是三重態(tài)的RB（3RB*）從供體分子（Donor）接收電子，形成RB陰離子自由基（RB·-）；II型機(jī)制是3RB*將能量轉(zhuǎn)移到O2產(chǎn)生單線態(tài)氧（1O2*）。在進(jìn)一步的反應(yīng)之后，這2 種途徑都可以使蛋白質(zhì)分子進(jìn)行交聯(lián)Figure 2.Photochemical Pathway of RGX.The mechanism of type I is that the triplet RB (3RB*) receives electrons from donor molecules (Donor) to form the anion free radical RB (RB·-),and Type II is that the 3RB* transfers energy to O2 to produce singlet oxygen(1O2*).After further reactions,both pathways allow the protein molecules to be cross-linked.

2 RGX的有效性與安全性

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)RGX的有效性?；谕煤拓i的角膜條帶拉伸實(shí)驗(yàn)證實(shí)RGX術(shù)后角膜的機(jī)械硬度大約增加2～4倍[2，7-9]。與未處理組相比，離體豬角膜的硬度在RGX（100 J/cm2）術(shù)后即刻增加了約2倍[9]。兔的角膜硬度在RGX（100 J/cm2）術(shù)后4周增加了2.5倍[8]，在RGX（150 J/cm2）術(shù)后第1天與第28天分別增加了1.9倍和2.8倍[7]，表明術(shù)后時(shí)間越長(zhǎng)，交聯(lián)效果越顯著。研究發(fā)現(xiàn)僅用RB浸潤(rùn)角膜而不進(jìn)行光照也有一定的交聯(lián)效果，與未處理的對(duì)照組相比，RB浸潤(rùn)后兔眼角膜硬度增高1.9倍[2]，原因可能是RB與膠原的結(jié)合在膠原分子或微纖維之間架起橋梁，改變周圍的離子環(huán)境和基質(zhì)的分子組織以增加角膜硬度[10]；在RB浸潤(rùn)后，照射能量越高交聯(lián)效果越好，100 J/cm2和150 J/cm2的RGX方案讓角膜平均硬度分別增加了2.3倍和3.8倍[2]。膠原酶和蛋白水解酶活性的增加會(huì)破壞角膜基質(zhì)中一些膠原的交聯(lián)，最終導(dǎo)致生物力學(xué)的薄弱和不穩(wěn)定，RGX可增強(qiáng)角膜的抗膠原酶溶解能力。離體角膜溶解實(shí)驗(yàn)表明，RGX（100 J/cm2）術(shù)后的兔角膜[8，10]和豬角膜[9]的膠原酶溶解時(shí)間較未處理組分別長(zhǎng)約5 d[8，10]和9 d[9]。Bekesi等[5，11]將可視化角膜生物力學(xué)分析儀（Corneal visualization biomechanical analyzer，Corvis ST）用于在體評(píng)估兔眼角膜的力學(xué)特性，根據(jù)測(cè)量參數(shù)結(jié)合逆向建模技術(shù)得到了角膜材料的超彈性，表明RGX（100 J/cm2）術(shù)后的角膜彈性下降了11倍。上述研究所用的實(shí)驗(yàn)方法、照射能量和評(píng)估方式不同導(dǎo)致結(jié)果不完全相同，但均驗(yàn)證了RGX的有效性。

3 RGX與傳統(tǒng)交聯(lián)術(shù)的比較

傳統(tǒng)的UVX過(guò)程即“Dresden”去上皮方案[1]：去除角膜中央直徑6～9 mm的上皮，然后使用0.1%的核黃素（溶于20%的右旋糖酐中）溶液逐步滴加到角膜上，每3～5 min滴1 次，共浸潤(rùn)30 min，再使用波長(zhǎng)370 nm的紫外線A（Ultraviolet A，UVA）照射，輻照度為3 mW/cm2（總能量為5.4 J/cm2）。雖然該方案已在臨床運(yùn)用十多年，但有以下局限性：①不適用于角膜中央厚度在400 μm以下的患者；②長(zhǎng)時(shí)間的UVA照射會(huì)引起患者不適；③核黃素可通過(guò)基質(zhì)自由擴(kuò)散，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)吸收UVA，產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)[7]。與UVX相比，RGX具有諸多優(yōu)勢(shì)：RB較淺的穿透力使其適用于薄角膜，整個(gè)過(guò)程不超過(guò)15 min，RB抑制微生物生長(zhǎng)的作用可能使術(shù)后患者角膜感染發(fā)生率降低[15]。Bekesi等[5，11]用Corvis ST結(jié)合逆向建模技術(shù)測(cè)量RGX與UVX術(shù)后的兔角膜生物力學(xué)特性，結(jié)果顯示RGX組和UVX組術(shù)后即刻的角膜彈性分別比未處理組下降11倍和6.25倍，術(shù)后1個(gè)月、術(shù)后2個(gè)月RGX組和UVX組的等效楊氏模量分別比未處理組增加3.4倍和1.7倍、10.7倍和7.3倍。Fadlallah等[10]研究表明RGX組的角膜溶解時(shí)間與UVX組相同，表明二者的交聯(lián)效果相當(dāng)。Lorenzo等[14]發(fā)現(xiàn)UVX組術(shù)后的兔眼角膜Haze比RGX組更嚴(yán)重，造成的基質(zhì)細(xì)胞損傷更深、更持久。

4 RGX在眼部的應(yīng)用研究

4.1 圓錐角膜

圓錐角膜以角膜表面因角膜基質(zhì)變薄或變?nèi)醵怀鰹樘卣鳎悄ぴ谝曒S處或周圍逐漸呈錐形，導(dǎo)致視力變差和嚴(yán)重的散光，其治療以視覺(jué)康復(fù)和減緩疾病進(jìn)展為主。CXL讓膠原纖維中膠原分子間形成共價(jià)交聯(lián)，使角膜更能抵抗眼內(nèi)壓的作用力[16-17]。UVX延緩圓錐角膜進(jìn)展的作用已見(jiàn)大量臨床報(bào)道[18-19]，而RGX的有效性目前停留于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)上述第2部分），尚未見(jiàn)臨床報(bào)道。

4.2 促進(jìn)角膜傷口愈合

對(duì)于角膜傷口的閉合方法，傳統(tǒng)的縫線縫合法可能會(huì)導(dǎo)致一些潛在的并發(fā)癥，例如暴露的縫線引起刺激和炎癥，可能導(dǎo)致細(xì)菌、病毒和真菌的感染，且縫線過(guò)早松動(dòng)可能導(dǎo)致傷口滲漏；若縫線太松或太緊則會(huì)導(dǎo)致散光，從而影響視力。因此，有學(xué)者提出通過(guò)在組織之間產(chǎn)生共價(jià)鍵交聯(lián)的方法使角膜傷口閉合。Proa?o等[20]將1.5 mM RB溶液注射到兔角膜切口后，用514 nm的綠光（0.64 W/cm2）照射180 s、240 s和300 s，隨著照射時(shí)間延長(zhǎng)，角膜的密封性逐漸增加，可承受的眼內(nèi)壓也逐漸增高，分別是230 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）、370 mmHg和500 mmHg。Wang等[21]用類似的RGX方案閉合豬角膜穿透性切口，得到了類似的效果。在用羊膜封閉較大的傷口方面，Verter等[22]用0.1%RB浸潤(rùn)羊膜表面5 min后置于兔角膜傷口，用532 nm的綠光（0.25 W/cm2）照射3.3 min、6.7 min、10 min，發(fā)現(xiàn)RGX可促進(jìn)羊膜與傷口表面的粘合。Soeken等[23]將RGX（0.27 mW/cm2，68 J/cm2）用于復(fù)雜的兔眼角鞏膜裂傷，可使羊膜粘合到傷口上促進(jìn)傷口愈合，且炎癥和繼發(fā)性影響很小。Seiler等[24]用飛秒激光制作兔眼角膜瓣后用RGX（參數(shù)設(shè)置：0.1%RB浸潤(rùn)角膜2 min，532 nm的綠光照射14 min，輻照度0.18 mW/cm2，總能量150 J/cm2）閉合創(chuàng)口，RGX組的剪切力比未處理的對(duì)照組增加2.1倍，表明RGX可增加角膜瓣與基質(zhì)床之間的粘連，但還需要進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)評(píng)估遠(yuǎn)期效果。以上動(dòng)物研究均證實(shí)RGX在促進(jìn)角膜傷口愈合方面有廣闊的應(yīng)用前景。

4.3 感染性角膜炎

感染性角膜炎是由多種致病因素導(dǎo)致角膜感染的潛在的致盲性疾病，常見(jiàn)病原體包括細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)等。目前藥物治療作為其主要治療方式，存在耐藥菌增多、抗菌藥的成本增加、角膜融解和角膜瘢痕形成風(fēng)險(xiǎn)升高等諸多問(wèn)題。光動(dòng)力療法（Photodynamic therapy，PDT）是治療感染性角膜炎的新方法，通過(guò)從紫外光到近紅外波長(zhǎng)范圍的光將光敏劑激活到激發(fā)態(tài)，與周圍環(huán)境的O2發(fā)生反應(yīng)生成ROS，ROS與細(xì)胞內(nèi)成分發(fā)生反應(yīng)，使細(xì)胞失活和死亡[25]。已有體外研究發(fā)現(xiàn)孟加拉玫瑰紅介導(dǎo)的光動(dòng)力療法（Rose bengal-photodynamic therapy，RB-PDT）對(duì)角膜炎患者角膜中分離得到的銅綠假單胞菌菌株（照射15 min，總能量5.4 J/cm2）[26]、3株真菌菌體（鐮刀菌、煙曲霉和白色念珠菌，照射34 min，總能量5.4 J/cm2）[27]以及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）（照射34 min，總能量5.4 J/cm2）[15]均有抑制作用，且可完全抑制2株多重耐藥的MRSA菌株的生長(zhǎng)[15]。Halili等[15]研究還發(fā)現(xiàn)僅用0.1%濃度RB的無(wú)光照組也可以完全抑制MRSA菌株的生長(zhǎng)，但該組有可能暴露在可能的光激活下，并非RB本身有毒性。RB-PDT（照射10 min，總能量5.4 J/cm2）可殺死63%的棘阿米巴細(xì)胞[28]，但需要進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。Andrea等[29]從細(xì)胞和分子角度評(píng)估RB-PDT（照射15 min，總能量5.4 J/cm2）對(duì)兔眼的安全性，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞凋亡僅限于角膜表面和治療區(qū)附近，高倍鏡下觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)形態(tài)改變和凋亡。在臨床方面，僅Amescua等[30]報(bào)道了用RB-PDT成功治療了一例多重耐藥的鐮刀菌性角膜炎患者，術(shù)中清除潰瘍區(qū)角膜上皮，滴入0.1%RB浸潤(rùn)30 min，518 nm的綠光進(jìn)行照射，總能量0.9 J/cm2，間隔12 d后再以1.8 J/cm2的總能量進(jìn)行二次手術(shù)，二次術(shù)后6個(gè)月的隨訪中，沒(méi)有感染復(fù)發(fā)和不良反應(yīng)。由此可見(jiàn)，對(duì)于感染性角膜疾病，尤其是難治性角膜炎，RB-PDT具有治療的潛在價(jià)值，但其有效性和安全性仍需大量的臨床研究來(lái)證實(shí)。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，RB作為光敏劑，其毒性小、組織相容性好，RGX作為一種新型交聯(lián)技術(shù)，在治療圓錐角膜和感染性角膜炎以及促進(jìn)角膜傷口愈合方面應(yīng)用前景廣闊。目前對(duì)于RGX局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外研究，RB的浸潤(rùn)時(shí)間、綠光照射時(shí)間和能量尚缺乏規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)，今后研究可關(guān)注RGX實(shí)施具體參數(shù)的探索，并且需要更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究來(lái)評(píng)估其遠(yuǎn)期效果，為圓錐角膜和其他相關(guān)角膜疾病提供安全有效的治療方案。

利益沖突申明本研究無(wú)任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明陳雪陽(yáng)：收集文獻(xiàn)資料，歸納分析并撰寫(xiě)論文，根據(jù)編輯部的修改意見(jiàn)對(duì)文章進(jìn)行修改。高蓉蓉：參與選題設(shè)計(jì)，指導(dǎo)資料的分析和解釋，參與論文的修改。王勤美、黃錦海：參與選題設(shè)計(jì)，對(duì)論文的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱