談亞麗，李 嘯,，張小龍，杜維力，熊 蓉

（1.湖北省酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗室 湖北安琪生物集團(tuán)有限公司，湖北宜昌 443003； 2.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 中國輕工業(yè)酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北宜昌 443003）

馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）因具有食品安全屬性，被原國家衛(wèi)生和計劃生育委員會于2013年批準(zhǔn)為新食品原料[1-2]。該菌種耐高溫、培養(yǎng)底物譜廣，可利用菊粉、乳清、木質(zhì)纖維素等廉價原料；另外，自身酶系合成能力強(qiáng)，可產(chǎn)β-半乳糖苷酶、羰基還原酶等，因而被廣泛應(yīng)用到工業(yè)生物技術(shù)、食品發(fā)酵等領(lǐng)域。

近年來，將具有產(chǎn)業(yè)化價值潛力的菌株投放到工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，結(jié)合生產(chǎn)效率及成本因素，還必須實(shí)現(xiàn)菌體的高密度培養(yǎng)。高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（High Cell Density Culture，HCDC）是指通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方及發(fā)酵調(diào)控策略、改進(jìn)反應(yīng)器性能來提高菌體發(fā)酵密度，使菌體密度較傳統(tǒng)培養(yǎng)方式提高10倍以上，從而提高時空產(chǎn)率，減少設(shè)備投資，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品市場競爭力。其中反應(yīng)器的流場特性決定了細(xì)胞所處的外部環(huán)境，從物料和能量的供給上直接影響菌體的生長特性，因而對發(fā)酵效率的提升及優(yōu)化具有重要影響。

計算流體力學(xué)（Computational Fluid Dynamics，CFD）是將流體動力學(xué)和數(shù)值計算方法緊密結(jié)合對流體的流動、傳熱和傳質(zhì)過程進(jìn)行分析的一門交叉學(xué)科。倪偉佳[3]等研究了不同攪拌槳葉組合下的流場情況，通過CFD數(shù)值模擬分析，優(yōu)化了攪拌槳組合結(jié)構(gòu)，提高了頭孢菌素C的發(fā)酵效率。侯洪國等[4]采用CFD研究了大型側(cè)攪拌發(fā)酵罐內(nèi)流場情況，對比仿真分析結(jié)果，可以很好地描述攪拌槳對罐內(nèi)流體的攪拌效果。由于通過CFD模擬計算可獲取反應(yīng)器中整體和局部的氣含率、流體速度、湍動能等流體力學(xué)參數(shù)，從而較為直觀地反映出反應(yīng)器內(nèi)的流場特性，所以已逐漸成為生物反應(yīng)器性能優(yōu)化和設(shè)計的一個重要工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）NAQU Plateau KM-Ⅵ：由湖北安琪生物集團(tuán)有限公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 種子培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextrosemedium， YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨1%。 108 ℃滅菌20 min。

1.1.3 分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基

30%葡萄糖，10%磷酸二氫銨，15%氨水，0.5%酵母浸粉，0.3%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂。pH=5.2，115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

FUS-50 L型發(fā)酵罐（A、B、C 3個）：帶溶解氧傳感器（瑞士Hamilton 238633-1343），pH傳感器（梅特勒-托力多InPro3100/120 Pt1000），上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司；PAS7000型生物尾氣分析儀：重慶哈特曼科技有限公司；ZHWY-211D腳踏開門型大容量全溫度恒溫?fù)u床：上海智城生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及種子液制備

將保藏于甘油管的馬克斯克魯維酵母菌株接入裝液量為20 mL/250 mL的YEPD培養(yǎng)基中進(jìn)行初次復(fù)壯，30 ℃、180 r/min條件下，培養(yǎng)18 h。再將初次復(fù)壯后的菌液接入 2 L種子發(fā)酵培養(yǎng)基作為種子液，接種量10%，30 ℃、 180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。再通過逐級擴(kuò)培，轉(zhuǎn)至5 L三角瓶，接種量10%，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)8 h，作為分批補(bǔ)料發(fā)酵種子液。

1.3.2 馬克斯克魯維酵母的補(bǔ)料分批培養(yǎng)

按照1.1.3培養(yǎng)基配方，除了葡萄糖及氨水，磷酸二氫銨外，其他一次投入作為發(fā)酵底料，進(jìn)行121℃滅菌 20 min。用磷酸調(diào)至pH=4.0后，按照15%接種量接入1.3.1擴(kuò)培后的種子液。采用合適的補(bǔ)料策略，過程中流加葡萄糖（30%）、氨水（15%）和磷酸二氫銨（10%）。培養(yǎng)溫度30 ℃，初始攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，空氣流量恒定為50 L/min，罐壓恒定為0.045 MPa，10 h結(jié)束發(fā)酵。對發(fā)酵液進(jìn)行分離，對收集的菌體進(jìn)行兩次洗滌，測定菌體細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核糖核酸（Ribonucleicacid，RNA）、海藻糖等關(guān)鍵組分含量。

1.3.3 分析檢測

細(xì)胞干質(zhì)量測定采用質(zhì)量法[5]。酒精含量的測定采用馬丁儀滴定法[6]。CER、OUR在線生理學(xué)參數(shù)由發(fā)酵之星Biostar 1.5在線數(shù)據(jù)采集及分析軟件計算得出。相關(guān)生物量指標(biāo)測定委托安琪酵母檢測中心進(jìn)行檢測。

1.3.4 基于CFD模擬計算分析50 L反應(yīng)器發(fā)酵液流場特性方法

采用軟件Gambit 2.4.6對原有的單管空氣分布器和提出的2種優(yōu)化后的空氣分布器，分別在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行網(wǎng)格劃分及建立計算模型。通過ANSYS Workbench 18.2軟件完成三維模型的網(wǎng)格劃分[7]，網(wǎng)格類型選用非結(jié)構(gòu)化四面體網(wǎng)格，且網(wǎng)格數(shù)目達(dá)到非依賴性狀態(tài)。

采用軟件Fluent模擬計算，選用Eulerian-ulerian模型進(jìn)行氣液雙相流模擬，MRF方法模擬葉輪旋轉(zhuǎn)；湍流模型為標(biāo)準(zhǔn)κ-ε模型；氣體進(jìn)口的邊界條件設(shè)定為速度進(jìn)口，氣體出口的邊界條件設(shè)定為壓力出口，罐壁和擋板設(shè)定為無滑移壁面邊界；模擬類型選取瞬態(tài)模擬，最終采用SIMPLE算法進(jìn)行求解，得出3種空氣分布器對應(yīng)的流場特性。

2 結(jié)果與分析

反應(yīng)器為菌體的高密度培養(yǎng)提供了一種無菌環(huán)境以及適合細(xì)胞生長的流體動力學(xué)環(huán)境[6]，主要包括攪拌、通氣和湍流。針對好氧型微生物培養(yǎng)，空氣分布器為反應(yīng)器內(nèi)的流場提供傳質(zhì)動能，使整個反應(yīng)器內(nèi)獲得持續(xù)穩(wěn)定的流場及能量、動量和物質(zhì)傳遞，為菌株的生理代謝提供穩(wěn)定合適的環(huán)境。基于CFD技術(shù)對配置不同空氣分布器的反應(yīng)器進(jìn)行流場特性的模擬計算分析，得出優(yōu)化后的空氣分區(qū)器在應(yīng)用到50 L馬克斯克魯維酵母發(fā)酵過程中，由于改善了發(fā)酵流場特性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了馬克斯克魯維酵母的高密度培養(yǎng)。

2.1 原有空氣分布器及2種優(yōu)化后的空氣分布器結(jié)構(gòu)

圖1中原有空氣分布器為單管式，基于多年發(fā)酵調(diào)控經(jīng)驗及原始創(chuàng)新，提出兩種優(yōu)化方案：opt1為單層環(huán)形分布器，環(huán)管上布有小孔，空氣出口方向向上；opt2所對應(yīng)的氣體分布器為雙層環(huán)形管，環(huán)管上布有小孔，空氣出口方向向上。

圖1 空氣分布器的設(shè)計優(yōu)化

2.2 發(fā)酵液氣含率云圖

氣含率是發(fā)酵液中氣相所占?xì)庖夯旌衔锏捏w積分?jǐn)?shù)，由氣含率云圖可知，空氣通過空氣分布器從發(fā)酵罐底部進(jìn)入，并隨著整個攪拌流場的流動，最終從頂部逃逸出發(fā)酵液液面。 從圖2可看出裝配3種不同空氣分布器對反應(yīng)器內(nèi)整體和局部空氣分布的影響情況。原有氣體分布器流場的氣含率在發(fā)酵液中上層的大部分區(qū)域幾乎為0，而優(yōu)化后氣體分布器流場的整體氣含率都顯著提高，尤其是opt2設(shè)計中發(fā)酵液中上層的大部分區(qū)域氣含率可提到0.03～0.08，明顯高于對照組。

圖2 發(fā)酵液氣含率云圖

氣含率參數(shù)可直觀反應(yīng)氧氣在發(fā)酵液中的氣液混合傳質(zhì)效果，進(jìn)而直接影響好氧型微生物在培養(yǎng)過程中的攝氧能力，通常也是影響菌體生物合成快慢的關(guān)鍵限速因子。

2.3 發(fā)酵液流體速度場分布

通過CFD-post處理仿真數(shù)據(jù)得到反應(yīng)器內(nèi)速度場分布圖，如圖3為速度矢量圖，圖4為速度云圖。

圖3 速度矢量圖

圖4 速度云圖

通過速度矢量圖可直觀的表征反應(yīng)器內(nèi)的流場特性，如圖3所示，3種方案中的流體都經(jīng)攪拌槳甩向發(fā)酵罐內(nèi)壁，然后沿著罐壁軸向流動，在每層攪拌槳周圍都形成一個明顯的軸向循環(huán)。而原始空氣分布器的發(fā)酵罐底部，可看出液體的徑向循環(huán)十分微弱。在opt1中，采用單層環(huán)形向上的氣體分布器，其發(fā)酵罐底部的徑向流動作用明顯加強(qiáng)，湍動劇烈，但和原有的氣體分布器一樣，在發(fā)酵罐上部都存在流動作用比較弱的現(xiàn)象。在opt2中，采用雙層環(huán)形向上氣體分布器，加強(qiáng)了發(fā)酵罐底部的湍動作用，在增加的上層氣體分布器的進(jìn)氣作用下，對發(fā)酵罐上部液體的徑向循環(huán)作用有明顯增強(qiáng)。從而提高發(fā)酵罐中的混合傳質(zhì)效率，對發(fā)酵體系中菌體的有氧代謝十分有利。

流體速度分布云圖是表征反應(yīng)器內(nèi)各個層面流體的流動速度大小，從而反映出空氣（氧氣）在發(fā)酵液中動態(tài)混合分布的效果。通過CFD模擬計算，如圖4所示，配置原有氣體分布器的反應(yīng)器內(nèi)中上層混合流場流動比較單一，整體混合效果較差，而配置優(yōu)化的opt1和opt2空氣分布器的發(fā)酵罐內(nèi)，尤其是opt2空氣分布器組，其流場的整體混合流動層次呈現(xiàn)多樣性且更分散，發(fā)酵液中上層的流動混合效果明顯增強(qiáng)。

綜合圖3、圖4可直觀看出不同的氣體分布器可直接影響反應(yīng)器中溶解氧的分布及氣液流體的混合效果。配置原始空氣分布器的發(fā)酵罐底部及中上層發(fā)酵液的氣液混合流動和溶解氧分布非常不均勻，發(fā)酵液中整體氣含率低，甚至存在發(fā)酵真空“死區(qū)”。而經(jīng)過優(yōu)化后的兩種空氣分布器均能增強(qiáng)整個發(fā)酵液的氣液流動混合效率，使發(fā)酵液中溶氧分布更為均勻。

2.4 不同空氣分布器對NAQU Plateau KM-Ⅵ高密度培養(yǎng)過程溶氧（DO）的影響

對在分別配置3種不同空氣分布器的3組平行發(fā)酵罐中進(jìn)行的馬克斯克魯維酵母NAQU Plateau KM-Ⅵ培養(yǎng)過程進(jìn)行溶氧DO的動態(tài)監(jiān)測，當(dāng)培養(yǎng)進(jìn)入中后期，隨著菌體量的積累，反應(yīng)器內(nèi)溶氧水平顯著降低。從圖5看出，對照組反應(yīng)器內(nèi)溶氧DO值在4 h時就降至20%以下，5 h以后幾乎為0，可見對菌體的供氧明顯不足，此時酵母細(xì)胞的呼吸速率和生長速率均會受限，因此細(xì)胞比生長速率逐漸下降。而opt2組在6 h后，DO依然能維持在20%左右的水平來滿足NAQU Plateau KM-Ⅵ在對數(shù)生長末期對氧氣的需求，可見opt2的雙層環(huán)形空氣分布器對發(fā)酵液的供氧效果明顯由于對照組及opt1組。

圖5 3種不同分布器對KM-Ⅵ發(fā)酵過程DO曲線

2.5 不同空氣分布器對NAQU Plateau KM-Ⅵ高密度培養(yǎng)過程呼吸強(qiáng)度的影響

當(dāng)OUR值近似等于CER值時，說明馬克斯克魯維酵母此時的好氧速率與二氧化碳釋放速率相近，表明此時酵母的呼吸代謝狀態(tài)90%以上為有氧呼吸，幾乎無酒精積累，即是菌體大量合成的階段，即圖6中反映出的OUR與CER曲線近似重合時段。

圖6 在線生理學(xué)參數(shù)CER、OUR曲線

在酵母高密度培養(yǎng)過程中，限制因素主要來自兩個方面：①供氧不足導(dǎo)致酵母發(fā)生無氧（厭氧）代謝，降低對糖的代謝速率，TCA好氧代謝途徑通量減慢，而EMP途徑通量增加進(jìn)而代謝生成乙醇；②當(dāng)培養(yǎng)基中的糖濃度較高時產(chǎn)生Crabtree效應(yīng)也會產(chǎn)生乙醇。故溶氧的供給直接影響酵母對糖的代謝速率，從而影響菌體比生長速率。

采用發(fā)酵之星Biostar軟件在線監(jiān)測50 L規(guī)模反應(yīng)器中培養(yǎng)馬克斯克魯維酵母過程的耗氧速率OUR（Oxygen Update Rate）、二氧化碳釋放速率CER（Carbon Dioxide Release Rate）來表征不同氣體分布器對菌體呼吸強(qiáng)度的影響。如圖6所示，opt1和opt2組的OUR，CER峰值均高于對照組，同時由圖7的殘?zhí)羌熬凭e累曲線可見，尤其是在對數(shù)后期8 h后，對照組及opt1組的發(fā)酵液殘?zhí)?、酒精積累含量均高于opt2組，經(jīng)分析推測，opt2組發(fā)酵過程是在雙層環(huán)形分布器供氧條件下進(jìn)行，再結(jié)合圖4發(fā)酵液中opt2的溶氧情況，均高于對照及opt1組，可見采用優(yōu)化后的空氣分布器改善了發(fā)酵液流場的氧氣傳質(zhì)效率，從而使菌體的有氧呼吸強(qiáng)度大大提升，顯著有利于菌體生長對數(shù)期的菌體量積累。

圖7 發(fā)酵液殘?zhí)羌熬凭e累曲線

2.6 不同空氣分布器對NAQU Plateau KM-Ⅵ高密度培養(yǎng)過程生長特性的影響

圖8 菌體干重及比生長速率曲線

3 結(jié)論

在酵母的高密度培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液中溶氧濃度的高低可直接影響菌體的呼吸強(qiáng)弱，進(jìn)而影響菌體得率和積累速率。隨著菌體濃度的增加，為維持細(xì)胞群體呼吸強(qiáng)度，對反應(yīng)器的供氧需求就會進(jìn)一步增加，當(dāng)通風(fēng)量達(dá)到上限的情況下，此時發(fā)酵罐內(nèi)溶氧水平進(jìn)一步下降，當(dāng)?shù)陀谂R界氧濃度，就會限制菌體的進(jìn)一步生長。

針對馬克斯克魯維酵母這類典型的好氧微生物發(fā)酵，只有在發(fā)酵后期提供充足的供氧及良好的氣液傳質(zhì)效率，盡可能長時間維持菌體的高比生長速率，才能實(shí)現(xiàn)菌體的高密度放大生產(chǎn)。本文通過CFD技術(shù)模擬計算，對50 L通氣攪拌反應(yīng)器的空氣分布器進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得出2種優(yōu)化的空氣分布器，相對于原有的單層管式空氣分布器，對發(fā)酵液流場特性的影響差異顯著。采用以上3組不同空氣分布器（1組對照，2組優(yōu)化），進(jìn)行50 L規(guī)模平行培養(yǎng)馬克斯克魯維酵母NAQU Plateau KM-Ⅵ，通過發(fā)酵液中溶氧的在線動態(tài)變化、菌體呼吸強(qiáng)度及殘?zhí)?、酒精、生物量等指?biāo)多維度對比分析，論證了原有的單層管式空氣分布器無法滿足NAQU Plateau KM-Ⅵ對數(shù)生長期后期的氧耗水平，而優(yōu)化后的雙層圓環(huán)式空氣分布器，明顯改善了氧氣在發(fā)酵液各層面的傳質(zhì)混合效果，從而能夠使發(fā)酵后期的溶氧水平維持在20%以上，延長了NAQU Plateau KM-Ⅵ對數(shù)生長期時間，實(shí)現(xiàn)了菌體量的快速積累。另外也間接說明溶解氧（DO）也是限制馬克斯克魯維酵母NAQU Plateau KM-Ⅵ實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一。本文的研究結(jié)果為實(shí)現(xiàn)馬克斯克魯維酵母的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)及高密度培養(yǎng)提供了可靠的理論基礎(chǔ)及借鑒思路。