張丹丹 楊瑤君 江 納 付 春

（1. 樂山師范學(xué)院竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 樂山，614000；2. 樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川 樂山，614000；3. 樂山師范學(xué)院數(shù)學(xué)與信息科學(xué)學(xué)院，四川 樂山，614000）

黃藤（Daemonorops jenkinsiana）是常綠攀援棕櫚藤的代表，自然生長在海拔1 000 m以下的低地雨林，黃藤叢生生長，莖可達(dá)50 m，節(jié)間長40 cm，直徑30 mm[1]。黃藤的果實(shí)可萃取藥品“麒麟血竭”，具有止血、活血、化瘀、止痛等療效，嫩莖梢17種氨基酸的總含量高達(dá)13.14%，營養(yǎng)豐富，可供食用，具有重要的開發(fā)價(jià)值[2-3]，是熱帶森林重要的再生非木材資源，但長期的森林采伐和藥材采集，使黃藤資源量大幅下降[1]。為了緩解及保護(hù)現(xiàn)有的資源狀況，一些國家建立了藤種基因收集圃、藤種園等遷地保存基地；同時(shí)人們開始了對(duì)現(xiàn)有資源的研究利用，特別是在棕櫚藤的良種選育方面[4]，目前國內(nèi)外對(duì)黃藤育種的系統(tǒng)研究還比較少。

Dof（DNA binding with one finger）蛋白是一類植物特異性轉(zhuǎn)錄因子。Dof基因家族屬于單鋅指蛋白超家族，一般由200～400個(gè)氨基酸構(gòu)成[5]。Dof蛋白具有明顯的結(jié)構(gòu)特征，由N?末端高度保守的Dof結(jié)合結(jié)構(gòu)域、寡聚化位點(diǎn)、引導(dǎo)Dof蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的核定位區(qū)段以及負(fù)責(zé)C?末端轉(zhuǎn)錄調(diào)控的激活結(jié)構(gòu)域4個(gè)部分組成[6]。其中，Dof結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由52個(gè)保守的氨基酸殘基構(gòu)成的C2?C2型單鋅指結(jié)構(gòu)域，在該結(jié)構(gòu)域中有4個(gè)絕對(duì)保守的Cys殘基[7]。Dof蛋白由于其C?末端轉(zhuǎn)錄調(diào)控域的氨基酸序列較為多變，不具有保守性，因此在植物中的功能具有多樣性[8]。目前對(duì)玉米（Zea mays）[9]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）[10-11]、水稻（Oryza sativa）[12]、桃（Amygdalus persica）[13]、草莓（Fragaria ananassa）[14]、香蕉（Musa nana）[15]、毛竹（Phyllostachys heterocycla）[16]、大豆（Glycine max）[17]、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）[18]、小麥（Triticum aestivum）[19]的Dof基因家族成員研究表明，Dof基因家族成員參與到植物體的多種生命活動(dòng)中，對(duì)植物生長發(fā)育、光調(diào)控、防御機(jī)制以及激素調(diào)控等過程中的相關(guān)基因有重要的調(diào)控作用[2]，值得注意的是，關(guān)于Dof蛋白的克隆和功能研究主要集中在擬南芥、番茄、水稻等模式植物中，在棕櫚藤物種中尤其在黃藤中鮮有報(bào)道。

目前，有關(guān)黃藤的研究還比較缺乏，僅在黃藤栽培、人工林培育與經(jīng)營和種子分子標(biāo)記等方面有過報(bào)道[20-22]，但關(guān)于黃藤Dof基因家族的理化性質(zhì)、氨基酸組成、親疏水性、亞細(xì)胞定位、二三級(jí)結(jié)構(gòu)等方面幾乎沒有報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)黃藤全基因組中的Dof基因家族成員進(jìn)行鑒定和分析，同時(shí)與擬南芥等其他9種物種基因組中的Dof家族成員進(jìn)行同源比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，擬探討藤本植物（黃藤）基因組中Dof基因家族與其他物種的進(jìn)化起源關(guān)系，為今后進(jìn)一步研究黃藤Dof基因家族的功能和黃藤育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

黃藤（Daemonorops jenkinsiana）全長基因組序列和其蛋白序列來自于國際竹藤中心公布的2種藤本植物基因組數(shù)據(jù)于GIGADB（http://gigadb.org/dataset/101053）[23]，采用擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR（https://www.arabidopsis.org/）下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）Dof基因家族序列和蛋白序列，在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫 PlantTFDB（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）下載毛竹（Phyllostachys heterocycla）、水稻（Oryza sativa）、二穗短柄草（Brachypodium distachyum）、小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、煙草（Nicotiana tabacum）、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）和可可（Theobroma cacao）的Dof基因家族序列和蛋白序列。

1.2 黃藤Dof基因家族的鑒定

先檢索下載pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）中Dof基因家族的pfam模型號(hào)（PF02701），利用hmmsearch運(yùn)行命令（hmmsearch --domtblout DjDof.txt --cut_tc zf-Dof.hmm（PF02701）Daemonorops jenkinsiana_protein.fasta）對(duì)黃藤蛋白質(zhì)序列中的Dof基因家族進(jìn)行預(yù)測分析，所得序列為黃藤Dof基因家族的候選蛋白質(zhì)序列；再利用BlastP比對(duì)工具（參數(shù)：e值小于10?5）將黃藤中Dof基因家族的候選蛋白質(zhì)序列與擬南芥36個(gè)Dof蛋白的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，剔除不相關(guān)的蛋白質(zhì)序列后即為黃藤基因組中的Dof基因家族的蛋白質(zhì)序列，共鑒定出25個(gè)黃藤Dof蛋白家族成員。

1.3 分析方法

1）黃藤Dof基因家族的理化特性分析。ExPASy-ProtParamtool（https://web.expasy.org/protparam/）[24]程序分析預(yù)測黃藤Dof基因家族編碼所有蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、親疏水性、氨基酸組成等理化特性。

2）氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。利用TMHMMSeverv.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線程序?qū)S藤Dof蛋白成員進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析[25]。

3）亞細(xì)胞定位分析。利用在線軟件CELLOv2.5[26]（http://cello.life.nctu.edu.tw/）對(duì)25條黃藤Dof蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

4）蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。利用SOPMA[27]網(wǎng)站對(duì)黃藤基因組中的Dof基因家族編碼的所有蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。利用 SWISS?MOOEL[28]在線網(wǎng)站對(duì)其蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。

5）蛋白質(zhì)的保守基序分析。利用 MEME 7.0.26[29]（http://meme-suite.org/tools/meme）在 線工具對(duì)黃藤基因組中的Dof基因家族編碼的氨基酸序列的保守基序進(jìn)行預(yù)測分析。參數(shù)設(shè)置：保守基序個(gè)數(shù)設(shè)置為10，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。

6）基因結(jié)構(gòu)分析與染色體定位分析。利用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)GSDS（Gene Structure Display Server）（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）[6]進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)黃藤Dof基因在染色體上的具體位置，使用MapChart軟件繪制黃藤基因組中Dof基因家族成員的染色體物理圖譜。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用 MEGA7.0.26[30]軟件對(duì)黃藤Dof基因家族編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建分析，構(gòu)建黃藤與擬南芥基因組中的Dof基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹以及構(gòu)建黃藤Dof基因家族與擬南芥等其他9個(gè)物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹。構(gòu)建方法采用鄰接法，校驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為 Bootstrap 重復(fù)1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃藤全基因組Dof基因家族的鑒定及其基本信息分析

黃藤Dof蛋白家族的理化特性分析結(jié)果表明，黃藤Dof蛋白質(zhì)成員中氨基酸數(shù)目最多的是Dj-Dof20蛋白，有586個(gè)氨基酸，最少的為DjDof22蛋白，有184個(gè)氨基酸；脂肪族氨基酸指數(shù)在49.47～74.51之間；10個(gè)成員帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)多于帶正電荷的殘基總數(shù)，有2個(gè)成員正負(fù)殘基總數(shù)相等（DjDof24，DjDof22），13個(gè)成員正電荷殘基總數(shù)多于負(fù)電荷總數(shù)（表1）。

蛋白質(zhì)的分子量在20.12～62.42 kDa之間，既含有酸性蛋白又含有堿性蛋白，且堿性蛋白比酸性蛋白多，有11個(gè)成員的等電點(diǎn)大于8.0，最大等電點(diǎn)為9.57（DjDof17），最小等電點(diǎn)為4.71（DjDof18）；不穩(wěn)定系數(shù)顯示，所有的蛋白均為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)<40時(shí)穩(wěn)定）；黃藤Dof蛋白均為親水性蛋白；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示所有黃藤Dof基因家族成員都定位在細(xì)胞核上，（表1）；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示黃藤Dof蛋白都不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，即都是非跨膜蛋白。

表1 黃藤Dof蛋白基本信息Table 1 Basic information of the Dof protein in D. jenkinsiana

2.2 編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是指蛋白質(zhì)的多肽鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，從黃藤Dof基因家族成員的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析可以看出，其基因家族的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β轉(zhuǎn)角、α螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈組成，4種蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)通常被主要研究[6]。通過預(yù)測和分析將有助于認(rèn)識(shí)蛋白的空間結(jié)構(gòu)，其中無規(guī)則卷曲主要起連接其他二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。

同時(shí)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示：多數(shù)成員以α?螺旋和無規(guī)則卷曲為主要二級(jí)結(jié)構(gòu)方式，多數(shù)成員二級(jí)結(jié)構(gòu)的占比高低為 α?螺旋>無規(guī)則卷曲>延伸鏈>β?轉(zhuǎn)角，α?螺旋在成員中占比范圍為6.67%（DjDof7）～48.28% （DjDof18）；無規(guī)則卷曲占比為39.36%（DjDof18）～83.33% （Dj-Dof7）；延伸鏈占比為6.05%（DjDof21）～17.74%（DjDof4）；β?轉(zhuǎn)角占比為1.8%（DjDof25）～7.51%（DjDof24）（圖1），綜上所述，β?轉(zhuǎn)角占比幾乎是最少的，延伸鏈其次，說明β?轉(zhuǎn)角和延伸鏈分散在整個(gè)氨基酸中。

圖1 黃藤Dof蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分布Fig. 1 The secondary structure distribution of the Dof protein in D. jenkinsiana

2.2.2 編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用 SWISS?MOOEL 在線網(wǎng)站分析了黃藤Dof蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，再根據(jù)其構(gòu)象進(jìn)行分組。黃藤Dof蛋白可以分為11個(gè)組，以A?K表示組別，A組（DjDof7、DjDof8、DjDof12、DjDof13、DjDof17、DjDof22）成員最多有6個(gè)；其次為B組（DjDof15、DjDof16、DjDof18、DjDof19），有4個(gè)；C組（DjDof1、DjDof4、DjDof10）和D組（DjDof2、DjDof9、DjDof25）有3個(gè)；E組（DjDof5、DjDof6）和F組（DjDof3、DjDof23）有2個(gè)；其余G（DjDof14）、H（DjDof20）、I（DjDof11）、J（DjDof21）、K（DjDof24）組都有1個(gè)，其中組C、組D、組E和組F主要以α?螺旋、β?轉(zhuǎn)角和β?折疊為主，組B、組G和組I主要以α?螺旋為主，組A主要以α?螺旋和β?折疊為主，組H主要以α?螺旋和β?轉(zhuǎn)角為主，組J主要以β?轉(zhuǎn)角為主（圖2），該結(jié)果說明黃藤Dof蛋白存在保守性和差異性。

圖2 黃藤Dof 蛋白3級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 2 Tertiary structure of the Dof protein in D. jenkinsiana

2.3 氨基酸序列的保守基序分析

通過MEME對(duì)黃藤Dof蛋白保守基序進(jìn)行了詳細(xì)的 分析。結(jié)果表明，10個(gè)獨(dú)立的保守基序被鑒定，命名為motif1～10，其中motif1為C2?C2單鋅指結(jié)構(gòu)，存在于所有的黃藤Dof蛋白中（圖3）。該結(jié)果表明，在相同組中含有相同保守基序的Dof蛋白也許具有相似的功能。

圖3 黃藤Dof 蛋白保守基序分析Fig. 3 The conservative motif analysis of the Dof protein in D. jenkinsiana

2.4 黃藤Dof蛋白家族的進(jìn)化關(guān)系分析

通過MEGA軟件運(yùn)用鄰接法對(duì)來自黃藤的25個(gè)Dof蛋白家族進(jìn)行進(jìn)化樹分析。根據(jù)樹的分支可將其分為4組（ClassⅠ?ClassⅣ），分別是ClassⅠ?ClassⅣ，Ⅰ組內(nèi)有5個(gè)成員，成員DjDof25和DjDof11進(jìn)化速率最快，成員DjDof13的進(jìn)化速率最慢；Ⅱ組內(nèi)有8個(gè)成員，成員DjDof10和DjDof9的進(jìn)化速率最快，其次是DjDof19，成員DjDof12和DjDof24的進(jìn)化速率最慢；Ⅲ組內(nèi)有5個(gè)成員，成員DjDof5和DjDof6的進(jìn)化速率最快，其次是DjDof1，成員DjDof15的進(jìn)化速率最慢；Ⅳ組內(nèi)有7個(gè)成員，其中成員DjDof2和Dj-Dof21的進(jìn)化速率最快，其次是DjDof20，成員DjDof22的進(jìn)化速率最慢，其中ClassⅡ成員分化速度是最快的，與原始祖先的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。從組別上來看，ClassⅡ成員分化速度是最快的，因而親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。從組中來看，ClassⅡ中成員DjDof9和DjDof10分化最快，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，DjDof12和DjDof24分化較慢；ClassⅢ中成員DjDof5和DjDof6分化最快，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，DjDof15分化較慢（圖4）。此外，通過MEME軟件中的ClustalW功能進(jìn)行蛋白保守序列比對(duì)（圖5），結(jié)果表明，黃藤Dof蛋白的結(jié)構(gòu)域是高度保守的，且所有Dof蛋白的結(jié)構(gòu)域均含有motif1，進(jìn)而構(gòu)成C2?C2單鋅指結(jié)構(gòu)，該結(jié)果進(jìn)一步證明了所鑒定的蛋白為Dof家族的成員。

圖4 黃藤Dof基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 The phylogenetic trees of the Dof gene family in D. jenkinsiana

圖5 氨基酸序列比對(duì)Fig. 5 Amino acid sequence alignment

通過MEGA軟件運(yùn)用鄰接法對(duì)來自黃藤的25個(gè)Dof和擬南芥的47個(gè)Dof進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建并分析。擬南芥ATDof2.3是復(fù)制特異性轉(zhuǎn)錄因子，縮短了細(xì)胞周期；過表達(dá)ATDof5.4通過促進(jìn)內(nèi)循環(huán)的早期發(fā)生，抑制細(xì)胞的擴(kuò)增；ATDof2.4和ATDof5.8在擬南芥不同生長發(fā)育過程中發(fā)揮不同作用；ATDof6對(duì)種子萌發(fā)起負(fù)調(diào)控的作用。該結(jié)果表明，黃藤和擬南芥Dof基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹分為5組，分別是ClassⅠ?ClassⅣ，Ⅰ組內(nèi)包括黃藤Dof成員8個(gè)，擬南芥Dof成員13個(gè)；Ⅱ組內(nèi)只有6個(gè)擬南芥Dof成員，不含有黃藤Dof成員，這表明黃藤Dof家族基因的形成遲于擬南芥的分化；Ⅲ組內(nèi)包括黃藤Dof成員7個(gè)，擬南芥Dof成員11個(gè)；Ⅳ組內(nèi)包括黃藤Dof成員和擬南芥Dof成員各4個(gè)（圖6）。其中DjDof15在2個(gè)進(jìn)化樹中分布在2個(gè)不同的組中可能是因?yàn)樵谶M(jìn)化過程中發(fā)生了蛋白序列的改變。

圖6 黃藤和擬南芥Dof基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 The phylogenetic trees of the Dof gene family in D. jenkinsiana and A. thaliana

黃藤Dof基因家族成員與來自雙子葉植物綱，單子葉植物綱和不同科的代表性植物擬南芥等多個(gè)物種的Dof成員分子進(jìn)化關(guān)系分析表明，黃藤和其他9種植物Dof基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹分為5組，分別是ClassⅠ?ClassⅤ，黃藤Dof蛋白成員主要分布在ClassⅤ，其次是ClassⅢ，ClassⅠ和ClassⅡ中不含有黃藤Dof蛋白成員，可能是黃藤在這2組中的同源基因在進(jìn)化過程中丟失。親緣關(guān)系越近，說明植物間的共同特征越多；親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，說明植物間的共同特征越少。其中，黃藤的Dof蛋白成員DjDof4和甘藍(lán)型油菜的Dof蛋白成員BRNA2T00148796001、DjDof11和GSBRNA2T00127875001、DjDof12和GSBRNA2 T00141516001、DjDof19和GSBRNA2T00027470-001的親緣關(guān)系最近，與可可的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。從科分類的角度來分析，黃藤與十字花科的甘藍(lán)型油菜的親緣關(guān)系最近，與可可的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；從雙子葉植物與單子葉植物分類分析，黃藤與小麥的親緣關(guān)系最近，亦是與可可的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，可能與他們分別屬于單雙子葉植物有關(guān)（圖7）。

圖7 黃藤和其他物種Dof基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 7 The phylogenetic trees of the Dof gene family between D. jenkinsiana and other species

2.5 黃藤Dof基因家族的結(jié)構(gòu)及染色體定位分析

2.5.1 黃藤Dof基因家族的結(jié)構(gòu)分析

通過在線網(wǎng)站GSDS2.0（gene strucyure display server）對(duì)黃藤Dof轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示黃藤Dof家族成員基因結(jié)構(gòu)簡單且相似性較高，均含有1～2個(gè)內(nèi)含子，其中有20個(gè)DjDof基因只含有1個(gè)內(nèi)含子，占總數(shù)的80%；其余的5條序列（DjDof4、DjDof10、Dj-Dof14、DjDof18、DjDof20）都含有2個(gè)內(nèi)含子，占總數(shù)的20%。進(jìn)1步分析發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)進(jìn)化樹屬于同一分支的Dof基因，其基因結(jié)構(gòu)也有明顯差異，如圖8 ClassⅣ中DjDof2、DjDof8、DjDof21、DjDof22只含有1個(gè)內(nèi)含子，其余成員則包括2個(gè)內(nèi)含子。可能是黃藤Dof基因家族在進(jìn)化過程中相對(duì)保守。且各基因長度不等，相差較大。

圖8 黃藤Dof家族基因結(jié)構(gòu)Fig. 8 Gene structure of Dof family in D. jenkinsiana

2.5.2 黃藤Dof基因家族染色體定位分析

通過染色體定位分析發(fā)現(xiàn)25個(gè)DjDofs基因不均勻分布于黃藤24條染色體中，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)基因，只有第5條染色體上有2個(gè)DjDof基因的分布，其余的染色體都只有1個(gè)DjDof基因的分布?？赡苁屈S藤的Dof基因在基因重組的過程中位置沒有發(fā)生太大的變化（圖9）。黃藤Dof基因家族中存在1對(duì)重復(fù)基因，DjDof5和DjDof6為1對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因。

圖9 黃藤Dof基因在染色體上的定位Fig. 9 The chromosome localization of Dof gene in D. jenkinsiana

3 結(jié)論與討論

Dof家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育調(diào)控和逆境脅迫響應(yīng)中扮演著重要角色[16]，本研究中利用黃藤全基因組測序數(shù)據(jù)信息對(duì)Dof家族進(jìn)行了全面分析，共鑒定出25個(gè)Dj-Dof家族成員，其數(shù)量與水稻（30個(gè)）、番茄（34個(gè)）、黃瓜（Cucumis sativus）（36個(gè)）以及擬南芥（36個(gè)）相近，通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)Dof家族成員數(shù)量與基因組大小并不呈正比例關(guān)系。黃藤Dof家族成員內(nèi)含子數(shù)在1～2之間，基因結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單，表明Dof家族的基因結(jié)構(gòu)具有保守性?；驈?fù)制事件是植物在進(jìn)化過程中形成結(jié)構(gòu)相似、功能相仿基因的基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)白菜Dof家族基因發(fā)生了10次染色體片段重復(fù)事件，無串聯(lián)重復(fù)事件發(fā)生[16]。發(fā)現(xiàn)黃瓜Dof家族基因發(fā)生了6次染色體片段重復(fù)事件和2次串聯(lián)重復(fù)事件。此外，在大豆、蒺藜（Tribulus terrestris）苜蓿（Modicago sativa）和番茄Dof家族基因中染色體片段重復(fù)事件分別發(fā)生37、10和8次；串聯(lián)重復(fù)事件分別發(fā)生1、1和3次[31-33]。本研究中鑒定到的25個(gè)DjDof基因共發(fā)生1次串聯(lián)重復(fù)事件，無染色體片段重復(fù)事件發(fā)生，這表明基因串聯(lián)重復(fù)在黃藤Dof家族擴(kuò)增和進(jìn)化中起著重要作用。

本研究結(jié)果表明，黃藤Dof家族成員在進(jìn)化中存在著一定的保守性，主要表現(xiàn)為：1）黃藤Dof蛋白性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定：鑒定得到的25個(gè)蛋白不僅在氨基酸數(shù)目上較為接近，在分子量上也均為30 kDa左右。既含有酸性蛋白又含有堿性蛋白，正電荷殘基數(shù)多于負(fù)電荷殘基數(shù)，并均為不穩(wěn)定蛋白和親水性蛋白。此外，在二級(jí)結(jié)構(gòu)組成比例上，α?螺旋和無規(guī)則卷曲為主導(dǎo)。2）基因結(jié)構(gòu)的保守：盡管序列長度上差異較大，但黃藤Dof家族基因在結(jié)構(gòu)上較為相似，均含有1～2個(gè)內(nèi)含子。本研究結(jié)果也表明，亞細(xì)胞定位顯示所有的Dof蛋白都定位在細(xì)胞核上，說明Dof蛋白在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用。

根據(jù)進(jìn)化關(guān)系將擬南芥Dof基因家族劃分為9個(gè)進(jìn)化亞群[34]，本研究中黃藤Dof基因家族成員同樣歸為9個(gè)進(jìn)化亞群（ClassⅠ.1，ClassⅠ.2，ClassⅡ.1，ClassⅡ.2，ClassⅡ.3，ClassⅢ.1，ClassⅢ.2，ClassⅣ.1，ClassⅣ.2）。結(jié)合黃藤Dof基因家族蛋白的保守基序發(fā)現(xiàn)，同一亞群中的Dof蛋白所包含的保守基序類型、數(shù)量、排列順序較為類似；正如已經(jīng)報(bào)道的擬南芥、水稻、胡椒和菊花相同組的Dof蛋白的保守基序一樣[35-37]，黃藤同一組的Dof蛋白保守基序的氨基酸序列也是高度保守的（圖3），該結(jié)果進(jìn)一步支持了系統(tǒng)發(fā)育樹中黃藤Dof蛋白的分組。本研究還發(fā)現(xiàn)motif1存在于25個(gè)黃藤Dof蛋白中，這與擬南芥、黃瓜和番茄的研究結(jié)果[38-39]相吻合。親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近用于判斷2種植物在結(jié)構(gòu)、功能上的異同點(diǎn)，黃藤與擬南芥的進(jìn)化關(guān)系表明兩者親緣關(guān)系不是很近。此外，還構(gòu)建了黃藤與擬南芥等10種植物的Dof基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，黃藤與甘藍(lán)型油菜和小麥有較近的親緣關(guān)系，序列同源性也較高，與可可親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

本研究利用生物信息手段對(duì)黃藤Dof基因家族編碼蛋白的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白二三級(jí)結(jié)構(gòu)建模、分子進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位等進(jìn)行了詳細(xì)的分析，為了解其調(diào)控機(jī)制以及通過基因和蛋白來育種，增加其經(jīng)濟(jì)價(jià)值打下了一定的基礎(chǔ)，同時(shí)也填補(bǔ)了關(guān)于黃藤Dof基因家族生物信息學(xué)方面的空白，對(duì)深入研究其生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制具有很重要的意義。