曹毅 李娟 曾隕濤 陸寧 楊冬梅 商勝華

摘要：為探究分離自煙草根際的2株芽孢桿菌的種類及其抑菌促生特性，利用16S rDNA和gyrB基因序列分析法，將菌株YC2006和YC2008分別鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株對(duì)煙草赤星病病原（Alternaria alternata）、煙草黑脛病病原（Phytophthora parasitica）和煙草立枯?。≧hizoctonia solani） 病原均具有明顯的抑制作用，對(duì)煙草立枯病病原的抑制率分別達(dá)到60.35%和68.08%。菌液浸種處理可顯著提高煙草種子發(fā)芽勢(shì)，在育苗基質(zhì)中添加菌劑可顯著提高煙苗的株高、莖圍、最大葉面積、地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、總根長(zhǎng)和總根表面積。2株芽孢桿菌對(duì)煙草主要真菌病原具有拮抗活性，同時(shí)兼具促進(jìn)種子萌發(fā)和煙苗生長(zhǎng)的作用，具有良好的研究開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌;煙草;gyrB基因;抑菌活性;促生作用

中圖分類號(hào)：S182;S572.01 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）21-0241-06

收稿日期：2021-03-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31660544）;中國(guó)煙草總公司貴州省公司項(xiàng)目（編號(hào)：201603、2021XM12）。

作者簡(jiǎn)介：曹 毅（1982—），男，云南會(huì)澤人，博士，副研究員，從事微生物和植物保護(hù)研究。E-mail：yicao1001@163.com。

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國(guó)廣泛種植的重要茄科經(jīng)濟(jì)作物，煙草病害嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量，常年造成的平均產(chǎn)量損失達(dá)10%左右[1]，一直是制約煙草生產(chǎn)的主要因素之一，而隨著氣候、耕作制度和栽培方式的變化，煙草病原種類及其危害程度呈增加和上升趨勢(shì)。長(zhǎng)期以來(lái)，作物病害主要依賴化學(xué)藥劑，由此導(dǎo)致的藥害[2]、農(nóng)藥殘留、病原耐/抗藥性、生態(tài)環(huán)境影響等問(wèn)題逐年凸顯，利用微生物制劑或其他環(huán)境友好措施控制作物病害受到各方廣泛關(guān)注。在各類生防微生物資源中，芽孢桿菌由于種類多樣、遺傳穩(wěn)定、環(huán)境抗逆性強(qiáng)[3]，可通過(guò)改善植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、產(chǎn)生激素、誘導(dǎo)抗性和抑制病原生長(zhǎng)等方式直接或間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害[4]，國(guó)內(nèi)外研究者利用芽孢桿菌已開(kāi)發(fā)出多種對(duì)植物病原具有防治效果的生物菌劑[5]，并在作物病害防治中不斷發(fā)展和應(yīng)用[6]。

利用微生物防治作物病害雖已取得較大的進(jìn)展，但在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中，由于外源生防菌在目標(biāo)作物根系中定殖力低、土壤抑菌作用、施用成本等因素的影響，生防制劑往往防效低且不穩(wěn)定，篩選根際定殖能力強(qiáng)的菌株資源并研究適合作物生產(chǎn)特點(diǎn)的施用方法對(duì)提高生防菌劑施用效果具有重要意義。前人研究表明，利用有益微生物處理煙草種子，可明顯提高種子發(fā)芽勢(shì)、生長(zhǎng)勢(shì)和種子活力，促進(jìn)煙苗生長(zhǎng)，增加其抗逆和抗病性[7];微生物添加進(jìn)育苗基質(zhì)中，可改善其結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)[8]，提高養(yǎng)分供應(yīng)能力，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)[9];同時(shí)，菌劑可在植物幼苗根部?jī)?yōu)先形成“生物屏障”[10]，維持根際微生物群落平衡并抵御病原攻擊[11-12]。煙草育苗集約化程度高，在種子萌發(fā)、育苗階段使用微生物菌劑具有經(jīng)濟(jì)和高效的特點(diǎn)，規(guī)?；茝V應(yīng)用潛力大。目前，針對(duì)煙草和煙葉生產(chǎn)特點(diǎn)開(kāi)發(fā)的微生物菌劑較少，以高效土著菌株為核心的煙用菌劑及配套使用技術(shù)仍較缺乏。

本研究以前期分離獲得的2株煙草根際芽孢桿菌YC2006和YC2008為材料，采用16S rDNA和gyrB基因（DNA促旋酶B亞單位基因）序列分析法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，通過(guò)室內(nèi)和溫室試驗(yàn)評(píng)估2株芽孢桿菌的抗菌和促生能力，以期為煙草抗病促生菌劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、培養(yǎng)基和煙草品種

試驗(yàn)所用煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、煙草立枯病菌（Rhizoctonia solani）、芽孢桿菌YC2006和YC2008均由貴州省煙草科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室分離并保存，LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基分別用于芽孢桿菌的活化和病原真菌培養(yǎng)，試驗(yàn)用煙草品種為K326，對(duì)照為枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（云南星耀生物制品有限公司提供）。

1.2 主要真菌病原拮抗活性測(cè)定

用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定經(jīng)活化的YC2006和YC2008對(duì)煙草黑脛病、赤星病菌和立枯病等主要真菌病害病原菌的拮抗活性，挑取經(jīng)LB平板活化的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)（28 ℃、180 r/min）2 d得到培養(yǎng)液，吸取50 μL培養(yǎng)液緩慢滴入無(wú)菌空白濾紙片（索萊寶）中，于PDA平板中接入直徑6 mm 新鮮培養(yǎng)的病原菌菌餅，距菌餅約2.5 cm處等距放入含菌濾紙片，以未接菌的LB培養(yǎng)液為對(duì)照，3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5～7 d后，測(cè)量病原菌菌落直徑，計(jì)算抑制率：

抑制率=（1-接種處理病原菌菌落直徑/不接種處理病原菌菌落直徑）×100%。

1.3 菌株gyrB基因和16S rDNA序列分析

菌株基因組DNA采用試劑盒（DNeasy UltraClean Microbial Kit，Qiagen）并按說(shuō)明書(shū)方法提取，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）/1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），UP-1（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′）/UP-2r（5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′），分別用于菌株16S rDNA 和gyrB基因[13]的擴(kuò)增;PCR擴(kuò)增體系為50 μL（GoTaqTM Green Master Mix 25 μL、27F/UP-1 1 μL、1492R/UP-2r 1 μL、模板 5 μL、無(wú)核酸酶去離子水18 μL）。16S rDNA基因擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 4 min;94 ℃變性30 s，65 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min;gyrB擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 4 min;94 ℃ 變性 1 min，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，利用中間引物UP-1s（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′）和UP-2rs（5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′）測(cè)通gyrB基因全長(zhǎng)，測(cè)序拼接序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載同源性在99%以上的序列，利用Mega X軟件包進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用鄰接法（Neighbor-Joining，Bootstrap value=1 000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 煙草種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

取活化的菌株，接入種子培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h后，制得種子液;以5% 接種量將種子液接種到2 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃條件下發(fā)酵48 h，將菌株發(fā)酵液與適量CaCO3混合，噴霧干燥后獲得初制菌劑。利用平板稀釋法[14]測(cè)定含菌量，菌液YC2006和YC2008的濃度分別約為4.04×1010 CFU/mL和1.83×1011 CFU/mL。將菌液濃度與對(duì)照商品化菌劑濃度調(diào)至1×109 CFU/mL，備用。

選取煙草種子（K326）放于試驗(yàn)設(shè)置的菌劑溶液中浸種2 h，分別以清水和商品化枯草芽孢桿菌可濕性粉劑為對(duì)照，共11個(gè)處理（表1）;浸種后，種子置于鋪有滅菌濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，加入滅菌清水保濕，每皿放置30粒種子，每個(gè)處理重復(fù)3次。25 ℃、光照16 h/d的人工氣候室培養(yǎng)，從種子置床之日起每天定時(shí)（早：09：00，晚：18：00）開(kāi)蓋通氣2次，加入滅菌清水，保證發(fā)芽床濕潤(rùn)。萌發(fā)指標(biāo)以種子露白為準(zhǔn)。種子萌發(fā)后逐日記錄發(fā)芽數(shù)量，共記錄10 d，測(cè)定并計(jì)算種子萌發(fā)指標(biāo)。

發(fā)芽率=（萌發(fā)結(jié)束時(shí)已發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%;

發(fā)芽勢(shì)：從種子置于培養(yǎng)箱開(kāi)始至第3天，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)占供試種子總數(shù)的百分率。

1.5 煙草幼苗農(nóng)藝性狀測(cè)定

在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)5個(gè)處理組，處理A：每100 g育苗基質(zhì)中拌入0.5 g枯草芽孢桿菌YC2006;處理B：每100 g育苗基質(zhì)中拌入2 g解淀粉芽孢桿菌YC2008;處理C：每100 g常規(guī)育苗基質(zhì)中拌入1 ∶1（質(zhì)量比）的1 g芽孢桿菌YC2006、YC2008;處理D：空白對(duì)照，育苗基質(zhì)中不拌入芽孢桿菌（CK1）;處理E：每100 g育苗基質(zhì)中拌入0.5 g商品化枯草芽孢桿菌（CK2）。將種子分別播于試驗(yàn)設(shè)置的不同基質(zhì)中，放置于人工氣候室培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境設(shè)為溫度25 ℃/18 ℃（晝/夜），光照16 h/d，相對(duì)濕度75%。播種45 d后，參照標(biāo)準(zhǔn)YC/T 142—2010[15]，對(duì)煙苗株高、莖圍、地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、地下部干質(zhì)量及最大葉面積等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，根系指標(biāo)采用根系掃描儀（型號(hào)：EPSON 1680）及其配套的WinRhizo Pro 5.0根系分析軟件測(cè)定[16]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株對(duì)主要煙草病原真菌的室內(nèi)拮抗活性的影響

平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），YC2006和YC2008菌株對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)具有抑制作用，對(duì)2種病原菌的抑制率達(dá)45%以上，芽孢桿菌YC2006和YC2008對(duì)煙草立枯絲核菌的抑制率最為明顯，分別達(dá)60.35%和68.08%;其次為赤星病菌（鏈格孢菌）和黑脛病菌（煙草疫霉）（圖1）。

2.2 菌株16S rDNA和gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株YC2006和YC2008的16S rDNA基因測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列拼接后，長(zhǎng)度分別為1 420 bp和 1 410 bp，采用 NJ 法分別構(gòu)建2株菌的16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。從16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)看，菌株YC2006和YC2008與臨近的幾株芽孢桿菌親緣關(guān)系較為接近，初步將YC2006和YC2008歸為芽孢桿菌屬。

菌株YC2006的gyrB基因測(cè)序結(jié)果拼接后獲得1 160 bp長(zhǎng)度的序列，與GenBank 中已報(bào)道的多株枯草芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性較高，序列相似性均達(dá)99.5%以上，采用 NJ 法構(gòu)建基于gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），從gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，菌株YC2006與枯草芽孢桿菌G2菌株聚為一支，有較近的親緣關(guān)系，可信度97%，結(jié)合16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，將YC2006鑒定為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）;同樣的方法，菌株YC2008的gyrB基因（1 170 bp）與多株解淀粉芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性較高，序列相似性均達(dá)99%以上，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）表明菌株YC2008與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens，AB829604）聚為一簇，有較近的親緣關(guān)系，結(jié)合16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，將YC2008鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

2.3 菌株對(duì)煙草種子萌發(fā)的影響

室內(nèi)種子發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，種子經(jīng)不同濃度的芽孢桿菌液浸泡處理后，YC2006 0.5%處理發(fā)芽率顯著高于對(duì)照制劑;各處理發(fā)芽勢(shì)顯著提高，表明本試驗(yàn)菌劑處理可加快煙草種子的萌發(fā)進(jìn)程，煙草出苗快而整齊。

2.4 菌株對(duì)煙草幼苗農(nóng)藝性狀的影響

由表4可知，處理A、B、C對(duì)煙草株高有促生作用，分別比清水對(duì)照提高了188%、103%、30%;各處理間莖圍無(wú)顯著差異，最大葉面積比對(duì)照提高了101.30%、36.46%、0.84%，處理A、B地上部鮮質(zhì)量分別比對(duì)照提高了85.14%、40.09%;各處理地下部鮮質(zhì)量分別比對(duì)照提高了136.36%、203.03%、69.70%。

由表5可知，處理A的平均根系直徑、總根體積與對(duì)照相比差異顯著，總根長(zhǎng)和總根表面積均顯著高于對(duì)照，與無(wú)菌清水對(duì)照相比，分別提高了41.75%和38.95%。經(jīng)0.5% YC2006處理過(guò)的煙苗根長(zhǎng)和根系表面積均高于對(duì)照，根系更為發(fā)達(dá)。

3 結(jié)論與討論

16S rDNA基因序列因其高度的保守性而被廣泛用于細(xì)菌分子鑒定，但對(duì)近緣種常常難以區(qū)分鑒別。gyrB基因存在于所有細(xì)菌中，其分子進(jìn)化速率大于16S rDNA基因，且不同種細(xì)菌的gyrB基因存在較大差異，常作為用芽孢桿菌種水平鑒定的靶標(biāo)基因[17]，本研究同時(shí)根據(jù)16S rDNA和gyrB序列和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株YC2006和YC2008初步鑒定為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。煙草立枯病、黑脛病和赤星病是當(dāng)前煙草育苗和大田生長(zhǎng)期的主要真菌性病害，本研究對(duì)菌株抑菌活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，菌株YC2006和YC2008對(duì)供試的3種病原菌均有不同程度的抑制活性，抑制活性強(qiáng)度以立枯病病原最為明顯，煙草大田期靶斑病病原與立枯病病原屬同種不同融合群，推測(cè)本試驗(yàn)菌株也可抑制煙草靶斑病病原，菌株抑菌譜等相關(guān)試驗(yàn)有待進(jìn)一步開(kāi)展，以明確其抗病應(yīng)用范圍。室內(nèi)種子萌發(fā)試驗(yàn)和溫室幼苗盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，高濃度的菌株對(duì)煙草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有抑制現(xiàn)象，與楊曉云等發(fā)現(xiàn)高濃度解淀粉芽孢桿菌B1619發(fā)酵液對(duì)番茄種子萌發(fā)和幼苗植株生長(zhǎng)有抑制作用結(jié)果相似，表明在實(shí)際應(yīng)用中明確生防菌株濃度施用范圍十分重要，同時(shí)還需對(duì)加工工藝、劑型等下游技術(shù)開(kāi)展研究，以便更好地發(fā)揮出生防菌的生防作用[18]。

微生物促進(jìn)植物生長(zhǎng)一般可歸納為：一是通過(guò)其生長(zhǎng)繁殖及代謝活動(dòng)產(chǎn)物，促進(jìn)土壤養(yǎng)分合成、分解與轉(zhuǎn)化，供植物生長(zhǎng)利用，如芽孢桿菌代謝產(chǎn)生生長(zhǎng)激素等促進(jìn)植物吸收水分和養(yǎng)分物質(zhì)，直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)[19];二是通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)抑制有害微生物的生長(zhǎng)，維持根系微生態(tài)平衡，減少病原菌的侵染而間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)。吳亞勝等研究發(fā)現(xiàn)，在育苗基質(zhì)中添加叢枝菌根真菌，菌根侵染率明顯提高，對(duì)辣椒幼苗的生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用[20];多黏類芽孢桿菌CF05發(fā)酵液對(duì)番茄幼苗有明顯的促生效果，鮮質(zhì)量增加272.0%，干質(zhì)量增加266.7%[21]。本研究在育苗基質(zhì)中添加枯草芽孢桿菌YC2006、解淀粉芽孢桿菌YC2008表現(xiàn)出了顯著的煙苗促生活性，添加0.5% YC2006，煙苗株高、最大葉面積、地上/地下部鮮質(zhì)量、總根長(zhǎng)和總根表面積較商品化的枯草芽孢桿菌菌劑分別提高了149.44%、62.1%、60.55%、39.29%、71.60% 和 70.15%，菌株促生機(jī)理值得進(jìn)一步研究。生防菌施用后，穩(wěn)定的定殖能力是其發(fā)揮生防、促生作用的關(guān)鍵因素[22]，本試驗(yàn)菌株為煙草根際分離所得，可能更適合在根際定殖并發(fā)揮作用，菌株YC2006和YC2008可通過(guò)拌種、基質(zhì)添加等使用方式促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，同時(shí)，菌株對(duì)煙草主要真菌病原具有明顯的抑制作用，可作為優(yōu)良的菌種材料用于煙草專用微生物種衣劑、微生物菌劑和菌肥的開(kāi)發(fā)。

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