霍曉聰， 黃新翔， 朱 霞， 韋誠誠， 楊艷婷， 蒙丹麗， 黃榮軍， 林金盈

痛風(fēng)是一種由慢性高尿酸血癥和關(guān)節(jié)內(nèi)尿酸單鈉結(jié)晶(monosodium urate crystal,MSU)沉積引起的炎癥性代謝性關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)生、發(fā)展是遺傳因素和環(huán)境因素相互促進(jìn)、共同作用的結(jié)果[1]。與原發(fā)性高尿酸血癥和痛風(fēng)相關(guān)的易感基因及其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位點(diǎn)相繼被發(fā)現(xiàn)。然而，不同的基因位點(diǎn)在不同的研究中其分布頻率差異大，推測(cè)其原因可能與人種有關(guān)[2]。目前，尚無我國(guó)壯族人群痛風(fēng)易感基因的報(bào)道?？扇苄暂d體2家族成員9(the solute carrier family 2,member 9,SLC2A9)是在亞洲人群中有重要影響的基因，其多個(gè)SNPs位點(diǎn)能夠顯著影響血清尿酸水平，可能是痛風(fēng)的易感基因[2]。本研究的目的是探討我國(guó)壯族人群SLC2A9基因的SNPs位點(diǎn)與原發(fā)性痛風(fēng)的相關(guān)性，為原發(fā)性痛風(fēng)的臨床診斷及高危人群篩查提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2017年1月至2020年12月在我院門診及住院的廣西壯族原發(fā)性痛風(fēng)患者246例(痛風(fēng)組)，其中男238例，女8例；選同期廣西壯族健康對(duì)照者202名(對(duì)照組)，其中男197名，女5名。痛風(fēng)組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合1977年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology，ACR)制定的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，三代以內(nèi)均為壯族。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性痛風(fēng)、惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎疾病、骨髓增生性疾病、淋巴增生性疾病等。確認(rèn)納入對(duì)象之間無血緣關(guān)系，在對(duì)照組的直系親屬中無痛風(fēng)患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(編號(hào)：KY-SY-2016-1)。

1.2樣本采集及生化指標(biāo)檢測(cè) 采集晨起空腹靜脈血3 ml，由我院檢驗(yàn)科檢測(cè)空腹血糖、血尿酸(uric acid,UA)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、肌酐(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，采用美國(guó)Beckman公司的Coulter AU5800生化分析儀及其配套試劑檢測(cè)。采血前3 d患者和健康對(duì)照者均無進(jìn)食大量高嘌呤食品如海鮮、動(dòng)物內(nèi)臟、酒、肉湯、飲料等。采集痛風(fēng)組及對(duì)照組的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)以及痛風(fēng)患者的家族史、病程、首發(fā)年齡、累及關(guān)節(jié)數(shù)、有無痛風(fēng)石、腎結(jié)石等數(shù)據(jù)。

1.3Taqman探針法檢測(cè)位點(diǎn)的多態(tài)性 采集空腹靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝。采用Thermofisher DNA提取試劑盒提外周血DNA，采用MERINTON(型號(hào)：SMA1000)核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度，置于-20 ℃保存。采用Applied Biosystems by Life Technologies(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，ABI)公司設(shè)計(jì)并生產(chǎn)的Taqman探針對(duì)所有樣本進(jìn)行rs10489070(C/G)、rs734553(G/T)、rs3733591(T/C)、rs16890979(C/T)位點(diǎn)的檢測(cè)。PCR試劑盒購自ABI：TaqMan Universal PCR Master Mix。PCR反應(yīng)體系如下：TaqMan 4 Universal PCR Master Mix 5 μl，Taqman探針Mix 0.5 μl，ddH2O 2.5 μl，DNA 2 μl。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，94 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。儀器為Bio-Rad熒光PCR儀(型號(hào)：CFX96)。

2 結(jié)果

2.1痛風(fēng)組與對(duì)照組臨床資料及生化指標(biāo)的比較

痛風(fēng)組與對(duì)照組的年齡、性別、空腹血糖、HDL-C、BUN比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。痛風(fēng)組的BMI、TG、TC、LDC-C、Cr、UA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 痛風(fēng)組與對(duì)照組臨床資料及生化指標(biāo)的比較

2.2有痛風(fēng)石組與無痛風(fēng)石組臨床資料及生化指標(biāo)的比較 在痛風(fēng)組246例患者中，檢查發(fā)現(xiàn)有明確痛風(fēng)石的患者73例(29.7%)。根據(jù)有無痛風(fēng)石將全部痛風(fēng)患者分為兩組。與無痛風(fēng)石的患者相比，有痛風(fēng)石的患者年齡更大，病程更長(zhǎng)，累及關(guān)節(jié)數(shù)更多，腎結(jié)石發(fā)生率更高，TG、TC、LDL-C、Cr、UA水平更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 有痛風(fēng)石組與無痛風(fēng)石組臨床資料及生化指標(biāo)的比較

2.3SLC2A9基因在痛風(fēng)組與對(duì)照組基因型及等位基因分布頻率比較 SLC2A9基因的4個(gè)SNPs位點(diǎn)(rs10489070、rs734553、rs3733591、rs16890979)在人群中分布皆符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，群體具有代表性(P>0.05)。不同SNPs位點(diǎn)在痛風(fēng)組和對(duì)照組基因型及等位基因分布頻率情況見表3。rs10489070位點(diǎn)的CC、CG、GG基因型在兩組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；rs10489070等位基因C和G等位基因在兩組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，攜帶C等位基因的個(gè)體發(fā)生痛風(fēng)的OR值為1.413(95%CI：1.009～1.980)。rs3733591位點(diǎn)的CC、CT、TT基因型在兩組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rs3733591等位基因C和T等位基因在兩組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，攜帶C等位基因的個(gè)體發(fā)生痛風(fēng)的OR值為1.739(95%CI：1.331～2.271)。rs16890979和rs734553位點(diǎn)的基因型和等位基因在兩組的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 SLC2A9基因在痛風(fēng)組與對(duì)照組基因型及等位基因分布頻率比較

2.4SLC2A9基因在有痛風(fēng)石組與無痛風(fēng)石組基因型及等位基因分布頻率比較 rs10489070位點(diǎn)的CC、CG、GG基因型在兩組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rs10489070等位基因C和G等位基因在兩組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，攜帶C等位基因的個(gè)體發(fā)生痛風(fēng)的OR值為2.020(95%CI：1.110～3.675)。rs3733591位點(diǎn)的CC、CT、TT基因型在兩組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rs3733591等位基因C和T等位基因在兩組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，攜帶C等位基因的個(gè)體發(fā)生痛風(fēng)的OR值為1.622(95%CI：1.009～2.394)。rs16890979和rs734553位點(diǎn)的基因型和等位基因在兩組的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 SLC2A9基因在痛風(fēng)石組與無痛風(fēng)石組基因型及等位基因分布頻率比較

2.5影響痛風(fēng)發(fā)生的二元logistic回歸分析結(jié)果 以是否診斷痛風(fēng)作為因變量(有=2，無=1)，納入年齡、高嘌呤飲食情況、家庭史、合并慢性腎臟疾病情況、抽煙情況、BMI、空腹血糖、TG、TC、HDL-C、LDL-C以及rs734553、rs16890979、rs3733591、rs10489070作為自變量，進(jìn)行單因素分析。將單因素分析P<0.1的觀察指標(biāo)納入多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示，高嘌呤飲食、陽性家族史、慢性腎臟疾病、TC、TG、LDL-C、rs3733591(CC)、rs10489070(CC)是痛風(fēng)發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表5。

表5 影響痛風(fēng)發(fā)生的二元logistic回歸分析結(jié)果

2.6影響痛風(fēng)石發(fā)生的二元logistic回歸分析結(jié)果

以是否有痛風(fēng)石作為因變量(有=2，無=1)，納入年齡、高嘌呤飲食情況、家庭史、合并慢性腎臟疾病情況、病程、抽煙情況、BMI、空腹血糖、TG、TC、HDL-C、LDL-C以及rs734553、rs16890979、rs3733591、rs10489070作為自變量，進(jìn)行單因素分析。將單因素分析P<0.1的觀察指標(biāo)納入多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示慢性腎臟疾病、病程長(zhǎng)、rs3733591(CC)、rs10489070(CC)是痛風(fēng)石發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表6。

表6 影響痛風(fēng)石發(fā)生的二元logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

3.1本研究為首次在我國(guó)壯族原發(fā)性痛風(fēng)人群中檢測(cè)SLC2A9基因與疾病相關(guān)的SNPs位點(diǎn)，并分析這些基因多態(tài)性的分布狀況與痛風(fēng)發(fā)病、UA水平、痛風(fēng)石的形成等的關(guān)聯(lián)性。本研究結(jié)果顯示，痛風(fēng)和痛風(fēng)石患者Cr水平顯著高于對(duì)照組，二元logistic分析也提示慢性腎臟疾病是痛風(fēng)(aOR=3.181，95%CI：2.144～5.637)和痛風(fēng)石(aOR=2.458，95%CI：1.673～5.667)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與國(guó)內(nèi)外其他研究結(jié)論一致[4-6]。24%的痛風(fēng)患者同時(shí)存在慢性腎臟疾病3期及以上[4]。與無痛風(fēng)的對(duì)照者相比，痛風(fēng)患者發(fā)生慢性腎臟疾病≥3期的風(fēng)險(xiǎn)增加78%[5]。高尿酸血癥、痛風(fēng)和慢性腎臟疾病之間的關(guān)聯(lián)是雙向的，慢性腎臟疾病是痛風(fēng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而痛風(fēng)也明顯增加了慢性腎臟疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[其可能的致病因素包括高尿酸血癥、慢性炎癥和非甾體抗炎藥(nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)的藥物治療等][6]。本研究顯示，在痛風(fēng)組246例患者中，有明確痛風(fēng)石的患者73例，占29.7%。與無痛風(fēng)石的患者相比，有痛風(fēng)石患者年齡更大，病程更長(zhǎng)，累及關(guān)節(jié)數(shù)更多，腎結(jié)石發(fā)生率更高，TG、TC、LDL-C、Cr、BUN、UA水平更高。這與Lawrence Edwards等[7]的研究結(jié)果相似。本研究246例痛風(fēng)患者中，有8例女性患者，均無痛風(fēng)石出現(xiàn)，與男性患者相比，女性患者出現(xiàn)痛風(fēng)石的比例似乎更低，但是因本研究中女性患者數(shù)量少，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量確認(rèn)。關(guān)于痛風(fēng)石在患者中的性別差異，文獻(xiàn)報(bào)道不多，且在不同的研究中其結(jié)果不一致。De Souza等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，女性似乎對(duì)痛風(fēng)石的發(fā)生有保護(hù)作用(OR=0.449，95%CI：0.151～1.330)。我國(guó)青島的一項(xiàng)納入5 693例痛風(fēng)患者的研究發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)石組的男性患者更多(P=0.039)[9]?？紤]本研究中女性出現(xiàn)痛風(fēng)石比例低可能是因?yàn)?例女性患者病程相對(duì)較短(中位病程為2.69年)，而且本研究組中女性患者例數(shù)不多，是否確實(shí)因?yàn)樾詣e影響痛風(fēng)石形成，還是同時(shí)存在種族、飲食、炎癥等因素的影響，還需要進(jìn)一步的研究。

3.2單純高嘌呤飲食并不能導(dǎo)致痛風(fēng)，高尿酸血癥患者中只有不到10%的患者會(huì)發(fā)生痛風(fēng)，提示遺傳易感性在痛風(fēng)的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起關(guān)鍵作用。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體9(glucose transporter 9，GLUT9)是一種尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由位于4p15.3-p16的SLC2A9基因編碼，目前不少病例對(duì)照研究的結(jié)果不一致[10-11]。本實(shí)驗(yàn)所選擇的SNPs位點(diǎn)rs10489070位于基因間，rs734553位于第7內(nèi)含子，rs3733591、rs16890979位于第8外顯子。rs3733591變異可以使位于GLUT9保守結(jié)構(gòu)域的第265位精氨酸被組氨酸替代(Arg265His)，rs16890979變異可使位于保守結(jié)構(gòu)域的第253位的纈氨酸被異亮氨酸替代(Val253Ile)，上述改變可能導(dǎo)致其轉(zhuǎn)運(yùn)尿酸的能力下降而致高尿酸血癥。本研究的結(jié)果顯示，rs10489070和rs3733591位點(diǎn)攜帶C等位基因的個(gè)體發(fā)生痛風(fēng)的OR值分別為1.413(95%CI：1.009～1.980)和1.739(95%CI：1.331～2.271)，二元logistic分析rs3733591(CC)(aOR=2.113，95%CI：1.536～3.951)、rs10489070(CC)(aOR=1.981，95%CI：1.123～3.156)是痛風(fēng)發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。rs3733591(CC)(aOR=2.358，95%CI：1.114～3.221)、rs10489070(CC)(aOR=2.115，95%CI：1.689～4.547)是痛風(fēng)石發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。證明了上述兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與我國(guó)壯族人群痛風(fēng)相關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)rs16890979、rs734553位點(diǎn)與痛風(fēng)的相關(guān)性。本研究對(duì)象為廣西地區(qū)壯族痛風(fēng)患者人群，將本研究數(shù)據(jù)與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的漢族人群對(duì)比，rs10489070位點(diǎn)基因型及等位基因與國(guó)內(nèi)李敏等[12]的研究結(jié)果一致，但在rs3733591位點(diǎn)，本研究與李敏等[13]的研究結(jié)果有所差異。我國(guó)閩南人群的研究未發(fā)現(xiàn)rs3733591與痛風(fēng)的相關(guān)性[14]。一項(xiàng)納入13項(xiàng)研究(共4 335例患者和15 300名對(duì)照者)數(shù)據(jù)的Meta分析結(jié)果顯示，rs3733591等位基因C在所有合并人群[C vs T：OR(95%CI)=1.432(1.213～1.691)]和亞洲合并人群[C vs T：OR(95%CI)=1.583(1.365～1.835)]中均高于對(duì)照組，rs3733591可能為亞洲人的易感性SNPs[2]。本研究顯示，SLC2A9基因rs10489070位點(diǎn)和rs3733591位點(diǎn)與痛風(fēng)石的形成有關(guān)，rs16890979和rs734553位點(diǎn)與痛風(fēng)石無顯著關(guān)聯(lián)。國(guó)內(nèi)李敏等[13]的研究也沒有發(fā)現(xiàn)rs3733591在有痛風(fēng)石組與無痛風(fēng)石組基因型及等位基因的分布頻率存在顯著差異，與本研究結(jié)果一致。痛風(fēng)作為一種多基因疾病，所涉及的易感基因數(shù)量多，常由多個(gè)基因聯(lián)合起作用。陰性結(jié)果的原因一方面可能本研究選擇的SNP位點(diǎn)不是影響痛風(fēng)石形成的主效基因；另一方面也可能是痛風(fēng)石的形成還受到炎癥因子、炎癥細(xì)胞、病程等其他因素的影響。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明SLC2A9基因的rs10489070(CC)和rs3733591(CC)基因型是促進(jìn)痛風(fēng)發(fā)生和痛風(fēng)石形成的風(fēng)險(xiǎn)因素，但易感位點(diǎn)影響痛風(fēng)發(fā)病的具體機(jī)制尚不明確，仍需要進(jìn)行相關(guān)SNPs功能的研究。