王 靜， 劉曉靜， 郝 鳳， 汪 雪

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室， 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

氮效率指的是植物對(duì)氮素的固定、吸收和轉(zhuǎn)化能力的綜合體現(xiàn)[1]。同種作物的不同品種對(duì)氮素的吸收和利用不同，從而導(dǎo)致品種間存在氮效率差異[2]。因此，充分挖掘作物自身的氮高效潛力是協(xié)調(diào)作物增產(chǎn)和環(huán)保的有效途徑[3]。目前，已有大量關(guān)于作物氮效率差異的研究報(bào)道。王建強(qiáng)等[4]的研究表明，氮高效型油菜(Brassicacampestris)比氮低效型對(duì)低氮脅迫的耐受力更強(qiáng)，對(duì)養(yǎng)分的吸收累積能力也相對(duì)較強(qiáng)。王春曉等[5]在花生(Arachishypogaea)對(duì)氮素吸收利用的研究中發(fā)現(xiàn)，氮高效品種的氮肥利用率和氮肥偏生產(chǎn)力分別比氮低效品種高5.4%和11.6%。前人通過大量研究證實(shí)氮效率差異主要表現(xiàn)在作物的物質(zhì)生產(chǎn)與積累特性[6]、根系特性[7-8]以及氮代謝酶活性[9-10]等方面，而且氮高效型作物種質(zhì)會(huì)表現(xiàn)出較好的農(nóng)藝性狀和氮代謝特征，可見，較強(qiáng)的氮素吸收能力和較好的植株生長(zhǎng)特性是作物在低氮脅迫環(huán)境下獲得氮高效的生物學(xué)基礎(chǔ)。不同品種間氮效率差異是普遍存在的現(xiàn)象，但作物生育期某一階段的氮素利用特征只能說明其具有氮高效潛力。為了明確作物在不同生育期的氮素利用特征，研究者們也對(duì)作物不同生長(zhǎng)階段的氮效率進(jìn)行了研究，不同基因型作物在各生育期也存在明顯的氮效率差異[11-13]。關(guān)于作物不同生育期氮效率差異的研究主要集中在禾本科作物上，對(duì)豆科作物此方面的研究較少，因此，開展這方面的研究非常有必要。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培面積最大的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，是畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的優(yōu)質(zhì)植物性蛋白飼料。與禾本科相比，豆科紫花苜蓿的氮效率規(guī)律更具復(fù)雜性，其對(duì)氮素的吸收利用更為復(fù)雜，除能從土壤中獲取外源氮外，其根系也可被根瘤菌侵染形成根瘤，進(jìn)而轉(zhuǎn)化空氣中游離的氮供自身生長(zhǎng)發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，不同紫花苜蓿品種的氮素吸收利用能力存在差異，因而其對(duì)氮素的響應(yīng)不同，氮肥報(bào)酬率在品種間差異極顯著[14]，從而導(dǎo)致干物質(zhì)與氮積累存在差異[15]。目前，針對(duì)紫花苜蓿氮效率差異已開展研究，且已明確不同氮效率紫花苜蓿的氮素吸收特性、氮素固定特性及氮素轉(zhuǎn)化能力存在明顯的差異，但該研究只集中在紫花苜蓿生育期的某一階段，尚未涉及到紫花苜蓿氮效率差異在不同生長(zhǎng)階段的特征規(guī)律。

本研究以不同氮效率類型的紫花苜蓿為對(duì)象，對(duì)不同生育期紫花苜蓿的氮效率差異展開研究，以期探明不同氮效率類型紫花苜蓿在不同生育期的氮營(yíng)養(yǎng)特征，為進(jìn)一步研究紫花苜蓿氮高效機(jī)理和實(shí)現(xiàn)紫花苜蓿生產(chǎn)中的氮養(yǎng)分高效管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

依據(jù)本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)紫花苜蓿氮效率的研究成果，選取4個(gè)不同氮效率紫花苜蓿品種，“LW6010”(氮高效型)，“甘農(nóng)3號(hào)”(氮常效型)，“甘農(nóng)7號(hào)”(氮反效型)和“隴東苜?！?氮低效型)；紫花苜蓿品種均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

供試菌株為中華根瘤菌(12531)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1試驗(yàn)地概況 試驗(yàn)地位于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，地理位置為北緯36°03′，東經(jīng)103°40′，海拔1 525 m，屬中溫帶大陸性氣候，日照多，氣候干燥，晝夜溫差大，年均溫10.3℃，土壤含水量為13.88%，年均蒸發(fā)量1 410 mm，年日照數(shù)平均2 600 h，無霜期180 d以上。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1取樣時(shí)期 苗期(5月25日)：有80%的植株開始分枝時(shí)；

現(xiàn)蕾期(6月15日)：有15%以上的植株在葉腋間已形成花蕾；

盛花期(7月1日)：有75%左右的分枝開始開花；

結(jié)莢期(7月12日)：有10%以上的分枝花序已結(jié)莢；

成熟期(7月25日)：有80%以上的果實(shí)成熟。

1.3.2指標(biāo)測(cè)定 株高：各處理隨機(jī)選取10株，用直尺測(cè)量植株絕對(duì)高度，每個(gè)處理重復(fù)3次;

生物量：將植株沖洗干凈后，用濾紙吸去多余水分，每個(gè)處理隨機(jī)選取10株將地上部分和地下部分分離進(jìn)行生物量稱重，每個(gè)處理重復(fù)3次。之后將鮮樣進(jìn)行105℃殺青15 min，在75℃烘干稱其干重;

根系總長(zhǎng)度、根體積和根表面積指標(biāo)通過EPSON Experssion掃描儀和WinRHIZO根系分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行測(cè)定;

根瘤數(shù)：將植株沖洗干凈后，每個(gè)處理隨機(jī)選取5株統(tǒng)計(jì)所有根瘤數(shù)量，計(jì)算單株根瘤總數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3次;

根瘤重：將植株沖洗干凈后，每個(gè)處理隨機(jī)選取5株統(tǒng)計(jì)所有根瘤數(shù)量后用分析天平進(jìn)行稱重，計(jì)算單株根瘤總鮮重，每個(gè)處理重復(fù)3次;

固氮酶活性：采用乙炔還原法用氣象色譜進(jìn)行測(cè)定[16-17];

硝酸還原酶(Nitrate reductase，NR)、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)：參考鄒琦的方法進(jìn)行測(cè)定[18];

氮素利用效率：采用凱氏定氮法測(cè)定含氮量[19]。按以下公式進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)計(jì)算：

地上氮積累量=地上含氮量×地上干重；地下氮積累量=地下含氮量×地下干重

氮素利用效率=植株干重/整株氮積累量[20]

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制，SPSS25.0進(jìn)行顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿各生育期株高和生物量

4種不同氮效率紫花苜蓿的株高和地上生物量隨生育期的推進(jìn)呈上升趨勢(shì)，在成熟期達(dá)到最大。高氮處理下，“LW6010”和“甘農(nóng)3號(hào)”的株高和地上生物量在各生育期均顯著高于“甘農(nóng)7號(hào)”和“隴東苜?！?，其地下生物量在結(jié)莢期和成熟期顯著高于“甘農(nóng)7號(hào)”和“隴東苜蓿”(P<0.05)；低氮處理下，“LW6010”和“甘農(nóng)7號(hào)”的株高在各生育期顯著高于“甘農(nóng)3號(hào)”和“隴東苜?！保渖锪吭诮Y(jié)莢期和成熟期顯著高于“甘農(nóng)3號(hào)”和“隴東苜?！?P<0.05)。隨著施氮量的增加，4種不同氮效率紫花苜蓿品種各生育期的株高和生物量顯著增加(P<0.05) (圖1,表1)。

圖1 不同氮效率紫花苜蓿的株高Fig.1 Effects of nitrogen levels on plant height in different nitrogen efficiency varieties注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分別代表苗期、現(xiàn)蕾期、盛花期、結(jié)莢期、成熟期；圖中不同小寫字母表示同生育期同一處理下不同品種間差異顯著，不同大寫字母表示同生育期同一品種不同氮處理下差異顯著(P<0.05)。下同Note:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ means of the seeding stage,the budding stage,the flowering stage,the seed podding stage and the maturing stage. Different lowercase letters indicate significant differences between different varieties under the same growth period and the same treatment,and different capital letters indicate significant differences under the same growth period and the same variety under different treatments(P<0.05).The same as below

表1 不同氮效率紫花苜蓿的地上生物量Table 1 Effects of nitrogen levels on above-ground biomass in different nitrogen efficiency varieties 單位：g

2.2 紫花苜蓿各生育期總根長(zhǎng)、根表面積和根體積

如表2所示，4種不同氮效率紫花苜蓿的總根長(zhǎng)、根表面積和根體積均隨生育期的推進(jìn)逐漸增加，均在成熟期達(dá)到峰值。在高氮和低氮處理下，4種紫花苜蓿的根系特性均表現(xiàn)為：“LW6010”的總根長(zhǎng)和根體積顯著高于“隴東苜蓿”(P<0.05)，而“甘農(nóng)3號(hào)”和“甘農(nóng)7號(hào)”介于二者之間，且在不同氮水平下表現(xiàn)相反。4種紫花苜蓿品種的根系特性在不同氮水平下表現(xiàn)為：苗期至現(xiàn)蕾期總根長(zhǎng)和根體積在低氮處理時(shí)顯著高于高氮處理，盛花期至成熟期根體積在高氮處理時(shí)顯著高于低氮處理(P<0.05)。

表2 不同氮效率紫花苜蓿的總根長(zhǎng)、根表面積和根體積Table 2 Effects of nitrogen levels on total root length,root dry weight,root surface area and root volume in different nitrogen efficiency varieties

續(xù)表2

2.3 紫花苜蓿各生育期根瘤數(shù)、根瘤重和固氮酶活性

4種不同氮效率紫花苜蓿的根瘤數(shù)和根瘤重隨生育期的推進(jìn)呈先上升后下降的趨勢(shì)，在結(jié)莢期達(dá)到最大。高氮處理下，“LW6010”的根瘤數(shù)在現(xiàn)蕾期顯著高于“甘農(nóng)7號(hào)”和“隴東苜?！保涓鲋卦诿缙?、現(xiàn)蕾期和盛花期顯著高于“甘農(nóng)7號(hào)”和“隴東苜?！?P<0.05)；低氮處理下，根瘤數(shù)表現(xiàn)為“LW6010”和“甘農(nóng)7號(hào)”在現(xiàn)蕾期和結(jié)莢期顯著高于“隴東苜蓿”，其根瘤重則在盛花期和結(jié)莢期顯著高于“隴東苜蓿”(P<0.05)?！案兽r(nóng)3號(hào)”的根瘤數(shù)和根瘤重在高氮處理時(shí)顯著高于低氮處理(P<0.05)。(圖2，圖3)

圖2 不同氮效率紫花苜蓿的根瘤數(shù)Fig.2 Effects of nitrogen levels on number of nodules in different nitrogen efficiency varieties

圖3 不同氮效率紫花苜蓿的根瘤重Fig.3 Effects of nitrogen levels on nodule weight in different nitrogen efficiency varieties

固氮酶活性在不同生育期的變化同根瘤數(shù)和根瘤重一致。高氮處理下，“LW6010”和“甘農(nóng)3號(hào)”的固氮酶活性在成熟期顯著高于“隴東苜?！?P<0.05)；低氮處理下，“LW6010”和“甘農(nóng)7號(hào)”的固氮酶活性在盛花期和成熟期顯著高于“隴東苜?！?P<0.05)。從盛花期至成熟期，“甘農(nóng)7號(hào)”的固氮酶活性在不同氮水平下表現(xiàn)為低氮處理顯著高于高氮處理(P<0.05) (表3)。

表3 不同氮效率紫花苜蓿的固氮酶活性Table 3 Effects of nitrogen levels on nitrogenase activity in different nitrogen efficiency varieties 單位：μmol·g-1

2.4 紫花苜蓿各生育期氮代謝關(guān)鍵酶活性

如表4所示，4種不同氮效率紫花苜蓿的GS和NR活性隨生育期的推進(jìn)呈先上升后下降的趨勢(shì)，在盛花期達(dá)到最大。高氮處理下，“LW6010”和“甘農(nóng)3號(hào)”的NR活性在各生育期均顯著高于“甘農(nóng)7號(hào)”和“隴東苜蓿”，其GS活性在苗期和現(xiàn)蕾期顯著高于“甘農(nóng)7號(hào)”和“隴東苜?！?P<0.05)；低氮處理下，“LW6010”和“甘農(nóng)7號(hào)”的NR活性除盛花期外均顯著高于“甘農(nóng)3號(hào)”和“隴東苜?！保珿S活性在苗期、盛花期和成熟期顯著高于“甘農(nóng)3號(hào)”和“隴東苜蓿”(P<0.05)。隨著氮水平的提升，4種不同氮效率紫花苜蓿品種各生育期的GS和NR活性均有所提高，且“甘農(nóng)3號(hào)”的NR、GS活性在高氮處理顯著高于低氮處理(P<0.05)。

表4 不同氮效率紫花苜蓿的氮代謝酶活性Table 4 Effects of nitrogen levels on nitrogen metabolizing enzyme activity in different nitrogen efficiency varieties 單位：μmol·g-1·h-1

2.5 紫花苜蓿各生育期地上、地下氮積累量和氮素利用效率

4種不同氮效率紫花苜蓿的氮積累量隨生育期的推進(jìn)逐漸增加；高氮水平下氮素利用率均隨生育期的推進(jìn)逐漸增加，在成熟期達(dá)到最大，而低氮水平下氮素利用率整體表現(xiàn)為隨生育期推進(jìn)呈先減小后增加的趨勢(shì)，在苗期最大、現(xiàn)蕾期最小。高氮處理下，“LW6010”和“甘農(nóng)3號(hào)”的地上氮積累量除現(xiàn)蕾期外均顯著高于“隴東苜?！?，其氮素利用率除成熟期外均顯著高于“隴東苜?！?P<0.05)；低氮處理下，“LW6010”和“甘農(nóng)7號(hào)”的地上、地下氮積累量在結(jié)莢期和成熟期顯著高于“隴東苜?！?，其氮素利用率在苗期和成熟期顯著高于“隴東苜?！?P<0.05)。全生育期內(nèi)，4種紫花苜蓿的地上氮積累量在高氮水平下顯著高于低氮水平，而氮素利用率除成熟期外在低氮處理顯著高于高氮處理(P<0.05) (表5)。

表5 不同氮效率紫花苜蓿的地上、地下氮積累量和氮素利用率Table 5 Effects of nitrogen levels on aboveground and underground nitrogen accumulation and nitrogen utilization in different nitrogen efficiency varieties

2.6 氮效率影響因子的逐步回歸分析

物質(zhì)積累量與氮素含量之間存在線性關(guān)系，可以通過施氮促進(jìn)植株生長(zhǎng)，反之，也可以通過其生物量來判斷不同品種的氮效率[21]。紫花苜蓿是以收獲營(yíng)養(yǎng)體為目標(biāo)，因此用地上生物量作為因變量，地下生物量、總根長(zhǎng)、根體積、根表面積、根瘤數(shù)、根瘤重、固氮酶活性、NR及GS為自變量進(jìn)行逐步回歸分析，結(jié)果顯示地下生物量、NR、固氮酶活性、根瘤重及總根長(zhǎng)進(jìn)入回歸方程，回歸方程為：地上生物量=0.038+1.531×地下生物量+0.005×NR-0.003×固氮酶活性+38.564×根瘤重-0.001×總根長(zhǎng)，地下生物量、總根長(zhǎng)、根體積、根表面積、根瘤數(shù)、根瘤重、固氮酶活性、NR及GS解釋了98.2%的氮效率差異(表6)。

表6 氮效率影響因子的逐步回歸Table 6 Stepwise regression of factors affecting nitrogen efficiency

3 討論

不同氮水平下紫花苜蓿結(jié)瘤固氮能力隨生育期的推進(jìn)均呈先上升后下降的趨勢(shì)，苗期是根瘤初步形成階段，其數(shù)量較少且固氮酶活性也較低，當(dāng)植株生長(zhǎng)進(jìn)入旺盛的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段后，根瘤迅速發(fā)育，直至結(jié)莢期根瘤數(shù)、根瘤重和固氮酶活性均呈直線上升，到結(jié)莢期達(dá)到最大值，表明紫花苜蓿的結(jié)瘤固氮能力在結(jié)莢期最強(qiáng)，這與索炎炎[22]等和吳正鋒[23]等的研究結(jié)果一致。植株根系總根長(zhǎng)、根表面積、根體積等是反映根系構(gòu)型形態(tài)的主要參數(shù)，本研究表明2個(gè)氮水平下紫花苜蓿根系特性變化在全生育期呈單峰上升趨勢(shì)，成熟期達(dá)到最大，在苗期至結(jié)莢期根系快速生長(zhǎng)，結(jié)莢期至成熟期增長(zhǎng)緩慢，這是因?yàn)槊缙谥两Y(jié)莢期紫花苜蓿主要是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，而發(fā)達(dá)的根系是其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的重要基礎(chǔ)，此時(shí)光合作用所產(chǎn)生的大部分碳水化合物用于其進(jìn)行以根系和葉片為中心的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而結(jié)莢期之后紫花苜蓿主要進(jìn)行生殖生長(zhǎng)，生長(zhǎng)中心轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)實(shí)器官，營(yíng)養(yǎng)元素主要向籽粒中轉(zhuǎn)移[24]。在植物的整個(gè)氮代謝過程中離不開氮代謝酶的參與，尤其是NR和GS對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起至關(guān)重要的作用，隨著生育期的推進(jìn)，各氮水平下氮代謝酶活性均隨著生育期的推進(jìn)呈先上升后下降的趨勢(shì)，在盛花期達(dá)到峰值，說明紫花苜蓿在生育前期氮代謝酶活性高，對(duì)氨的同化能力也較強(qiáng)，盛花期之后NR、GS活性逐漸降低，可能是由于隨著生育期的推進(jìn)紫花苜蓿各器官慢慢衰老，導(dǎo)致氮代謝酶活性下降。張智猛等[25]對(duì)花生的研究也有類似發(fā)現(xiàn)。

4 結(jié)論

4個(gè)紫花苜蓿品種對(duì)氮素的固定、吸收及轉(zhuǎn)化隨著生育期的推進(jìn)表現(xiàn)不同，結(jié)瘤特性在結(jié)莢期最突出，根系在成熟期發(fā)育最好，氮代謝相關(guān)酶活性在盛花期最高，成熟期氮素積累最多、利用率最高。不同氮效率類型的紫花苜蓿確存在品種間差異，氮高效型紫花苜蓿“LW6010”在各生育期的結(jié)瘤特性、根系特性、生長(zhǎng)特性、氮代謝酶活性及氮積累高于“隴東苜蓿”，即氮高效紫花苜蓿品種“LW6010”對(duì)氮素的固定、吸收及轉(zhuǎn)化能力優(yōu)于氮低效型品種“隴東苜?！?，而氮常效型品種“甘農(nóng)3號(hào)”和氮反效型品種“甘農(nóng)7號(hào)”則介于前二者之間。