辛靈恩 李龍

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種不可逆的持續(xù)進(jìn)行性和破壞性的間質(zhì)性肺疾病，病因復(fù)雜且至今不明，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其特征是肺泡上皮細(xì)胞損傷、成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化、膠原沉積和上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終將導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的漸進(jìn)性呼吸功能不全[1，2]。目前認(rèn)為IPF是最常見和最嚴(yán)重的肺纖維化形式，纖維化特征是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過度沉積在受損上皮細(xì)胞的基底膜和肺間質(zhì)組織及肺泡腔內(nèi)[3，4]。IPF在世界范圍均可見發(fā)病，男性發(fā)病較女性更為常見，吸煙是IPF明確的危險因素，高齡是IPF發(fā)病最重要的危險因素之一，其發(fā)病率和患病率隨著年齡的增長而顯著增加，2/3的IPF患者發(fā)病時年齡>60歲，確診時的平均年齡為66歲，在>65歲的人群中，估計患病率可能高達(dá)每10萬人中400例[1-4]。目前仍缺乏徹底治愈此病的治療措施，治療上以控制病情進(jìn)展、改善患者生活質(zhì)量為主要目標(biāo)。雖然迄今為止人們對IPF發(fā)病機(jī)制的尚未完全了解，但越來越多的觀點(diǎn)認(rèn)為包括細(xì)胞衰老在內(nèi)的衰老加速機(jī)制在IPF的發(fā)病中起重要作用。本文主要綜述近年來與細(xì)胞衰老相關(guān)的研究進(jìn)展在IPF發(fā)病中的作用，以期在細(xì)胞分子層面為IPF今后的治療提供新的線索。

1 細(xì)胞衰老

細(xì)胞衰老通常被定義為不可逆的細(xì)胞周期停滯，是由促衰老應(yīng)激源誘導(dǎo)的穩(wěn)定復(fù)制停滯的進(jìn)化保守狀態(tài)，損傷蓄積刺激細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑p16 Ink4a和或p53-p21Cip1/Waf1的活性，從而拮抗細(xì)胞周期依賴性激酶，激活進(jìn)入衰老狀態(tài)的兩條途徑，即p16Ink4a/pRb和p53/p21途徑以阻斷細(xì)胞周期進(jìn)展[5]。迄今為止描述的3個原發(fā)性細(xì)胞衰老程序：復(fù)制衰老、應(yīng)激誘發(fā)過早衰老、發(fā)育程序性衰老[5-7]。50多年前，Hayflick首先描述了細(xì)胞衰老，通過試驗他觀察到人類胎兒成纖維細(xì)胞最終會停止分裂，但仍然具有活力和代謝活性，這種現(xiàn)象被稱為“復(fù)制衰老”或Hayflick極限，即端?？s短所觸發(fā)的細(xì)胞衰老，這發(fā)生在長時間的細(xì)胞分裂之后，最終將導(dǎo)致細(xì)胞增殖停滯不前[5，6]?！皯?yīng)激誘發(fā)過早衰老”發(fā)生在“復(fù)制衰老”之前，由大量的應(yīng)激源誘導(dǎo)，越來越多的衰老誘導(dǎo)劑不斷被發(fā)現(xiàn)，包括癌基因、活性氧物種和細(xì)胞毒性化合物等[6]。發(fā)育程序性衰老是在胚胎發(fā)育早期檢測到的一種最新衰老途徑，研究發(fā)現(xiàn)，該衰老途徑依賴于p21CIP1的表達(dá)，這與致癌基因誘導(dǎo)衰老具有相同的特征[7]。衰老細(xì)胞的特征包括不可逆性生長停滯、形態(tài)增大、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)、衰老相關(guān)異染色質(zhì)灶形成和衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)的高表達(dá)[8]。

越來越多的證據(jù)支持細(xì)胞衰老與IPF的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[5-10]。有研究通過早期干預(yù)自殺基因去除衰老細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可消除IPF動物模型的纖維化發(fā)展，在一定程度上恢復(fù)衰老小鼠的肺順應(yīng)性、結(jié)構(gòu)和彈性，這表明衰老細(xì)胞可能導(dǎo)致纖維化肺疾病[5]。有研究提出，隨著年齡的增長衰老細(xì)胞不斷積累，持續(xù)存在的衰老細(xì)胞是包括IPF在內(nèi)的慢性年齡相關(guān)疾病發(fā)展的主要驅(qū)動因素[6，7]。在IPF肺的肺上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和祖細(xì)胞中與衰老相關(guān)的多條通路被激活[9，10]，通過促進(jìn)肺上皮細(xì)胞的異常分泌模式，增強(qiáng)肌成纖維細(xì)胞對凋亡的抵抗力，從而加重IPF的發(fā)病。

2 細(xì)胞衰老在IPF中的作用

2.1 衰老相關(guān)的SASP上調(diào)與IPF的關(guān)系 衰老細(xì)胞在代謝上是活躍的，其重要特征是分泌多種被稱為衰老相關(guān)分泌表型的促炎介質(zhì)，包括促炎細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等[11]。SASP表型是DNA損傷、端粒功能障礙、表觀基因組或有絲分裂信號、氧化應(yīng)激和其他一些衰老誘導(dǎo)刺激的結(jié)果，其刺激因素呈現(xiàn)多樣性[12]。SASP以旁分泌和自分泌的方式進(jìn)行釋放，作用于鄰近的細(xì)胞和周圍組織加速其衰老進(jìn)程，同時反作用于產(chǎn)生它的細(xì)胞并產(chǎn)生強(qiáng)大影響，導(dǎo)致與衰老相關(guān)的細(xì)胞功能障礙、修復(fù)失敗、免疫功能受損和慢性低度肺部炎癥[13，14]。

與衰老相關(guān)的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVS)是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，包括外泌體、微泡和凋亡小體[15]。有研究通過研究發(fā)現(xiàn)正常人成纖維細(xì)胞在細(xì)胞衰老過程中EVS的分泌顯著增加，EVS可能作為一種新型的SASP在細(xì)胞衰老過程中發(fā)揮作用[16]。但筆者發(fā)現(xiàn)目前關(guān)于EVS的報道并不多見。在IPF中，衰老的肺上皮細(xì)胞可分泌大量的白細(xì)胞介素(interleukin，IL)包括IL-1β、IL-6和IL-8，誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，從而加重IPF的發(fā)病[17]。纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor 1， PAI-1)是另一種特征性SASP蛋白，在部分IPF患者的痰、痰巨噬細(xì)胞和肺泡中均可見升高[18]。PAI-1長期以來一直被用作細(xì)胞衰老的標(biāo)志物。有證據(jù)表明，PAI-1不僅是細(xì)胞衰老的標(biāo)志物，也是誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的介質(zhì)，PAI-1在IPF和博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells type 2，AEC2)中表達(dá)增加，敲除PAI-1基因的小鼠幾乎完全消除了博萊霉素誘導(dǎo)的AEC2衰老和肺纖維化，這提示PAI-1的增加可能是AEC2細(xì)胞衰老的基礎(chǔ)并在肺纖維化形成中起重要作用[6，18]。已知轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)是一種強(qiáng)烈的促纖維化細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)AEC2衰老，衰老的AEC2分泌一系列促纖維化和促炎介質(zhì)，激活肺泡巨噬細(xì)胞從而促進(jìn)肺纖維化，而最新研究發(fā)現(xiàn)這一過程也受到PAI-1的調(diào)節(jié)[19]。SASP在IPF發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，它不僅是細(xì)胞衰老的重要特征，也可作為分子介質(zhì)間接誘發(fā)細(xì)胞衰老的級聯(lián)反應(yīng)，提高細(xì)胞衰老的分子生物學(xué)標(biāo)志的檢測水平有助于評估病情進(jìn)展，為IPF的預(yù)防和治療提供新的契機(jī)。

2.2 肺上皮細(xì)胞衰老 近年來，越來越多的觀點(diǎn)支持IFP是一種上皮驅(qū)動性疾病，IPF肺組織中尤其是肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells，AEC)的衰老相關(guān)標(biāo)記物，包括p16、p21和p53蛋白表達(dá)明顯增加，AEC的衰老可視為IPF中促纖維化的始動因素[20-23]，但AEC在IPF中衰老的機(jī)制并不十分明確。最近發(fā)現(xiàn)，IPF的活動性纖維化損傷病灶中也存在上皮細(xì)胞加速衰老的現(xiàn)象，衰老的上皮細(xì)胞可能通過分泌大量的SASP使異常的上皮-間充質(zhì)相互轉(zhuǎn)化作用持續(xù)存在，這在IPF的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[21，22]。最新研究表明，肺上皮細(xì)胞暴露于純碳納米顆粒會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞衰老，碳納米顆粒作為空氣污染的主要成分，可在肺上皮細(xì)胞中通過接觸直接觸發(fā)這種效應(yīng)[22]。IPF中衰老的AEC通過增加SASP的表達(dá)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移、增殖和活化，靜息的成纖維細(xì)胞活化后獲得肌成纖維細(xì)胞表型，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的大量釋放和沉積，過量的ECM最終將導(dǎo)致肺組織重構(gòu)[1，10]，但迄今為止AEC的衰老與成纖維細(xì)胞活化之間的內(nèi)在機(jī)制尚不完全清楚。此外，有實驗證實衰老的人支氣管上皮細(xì)胞分泌的IL-1足以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞，這可能在IPF纖維化發(fā)展中起一定作用[23]。

也就是說，肺上皮細(xì)胞衰老在IPF的纖維化調(diào)節(jié)中是一個關(guān)鍵的觸發(fā)點(diǎn)，衰老的AEC并不直接參與纖維化的形成，而是通過活化成纖維細(xì)胞間接發(fā)揮作用，因而深入研究AEC衰老的機(jī)制對延緩纖維化控制病情進(jìn)展顯得十分重要。

2.3 肺成纖維細(xì)胞衰老 有報道稱成纖維細(xì)胞的衰老可能介導(dǎo)了IPF的發(fā)生，然而影響成纖維細(xì)胞異?；罨乃ダ蠙C(jī)制尚不完全清楚[24-27]。有關(guān)實驗指出，衰老的肺成纖維細(xì)胞是IPF纖維化過程中促纖維化白三烯分泌的關(guān)鍵來源，早期衰老的成纖維細(xì)胞合成白三烯通過旁分泌機(jī)制刺激膠原合成和纖維化[24]。IL-18是最近發(fā)現(xiàn)的一種促炎細(xì)胞因子，在結(jié)構(gòu)和功能上與IL-1家族相關(guān)，可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞衰老，Zhang等[25]首次報道了IL-18結(jié)合蛋白中和IL-18可能通過抑制細(xì)胞衰老而起到抗纖維化作用。已知衰老細(xì)胞能夠產(chǎn)生較高水平的活性氧，研究發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶4(NADPH oxidase4 ，NOX4)是一種產(chǎn)生活性氧的酶且與細(xì)胞衰老緊密相關(guān)，IPF患者肺成纖維細(xì)胞中NOX4的表達(dá)呈結(jié)構(gòu)性上調(diào)，過度表達(dá)NOX4可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞衰老從而導(dǎo)致肺纖維化[26]。有研究發(fā)現(xiàn)IPF患者肺成纖維細(xì)胞p21、p16、p53及與衰老相關(guān)分泌表型細(xì)胞因子表達(dá)增加，這表明IPF肺成纖維細(xì)胞具有衰老表型，線粒體功能障礙可能是成纖維細(xì)胞衰老的原因[27]。SASP在IPF纖維化發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用，除了衰老的肺上皮以外，已證實衰老的肺成纖維細(xì)胞亦可分泌大量的SASP，促進(jìn)向肌成纖維細(xì)胞表型分化參與纖維化形成，與此同時肌成纖維細(xì)胞衰老伴隨氧化還原失衡，這將導(dǎo)致衰老相關(guān)的持續(xù)性纖維化[25，27,28]。成纖維細(xì)胞作為修復(fù)損傷的細(xì)胞類型之一，在完成了對IPF肺上皮的損傷修復(fù)后迅速被免疫清除，如果清除失敗，持續(xù)存在的衰老成纖維細(xì)胞可通過改變分泌型來驅(qū)動疾病發(fā)展過程[27，29]。成纖維細(xì)胞衰老與IPF發(fā)病機(jī)制的關(guān)系較為復(fù)雜，有效抑制IPF中衰老肺成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化有望改善IPF患者肺重構(gòu)和肺功能，這仍需進(jìn)一步探索研究。

2.4 線粒體異常 線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的能量供應(yīng)來源，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)除了為細(xì)胞供能以外，線粒體還參與了調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過程，線粒體的穩(wěn)態(tài)和正常功能對于不同組織器官的正常生理狀態(tài)至關(guān)重要。新的證據(jù)表明，線粒體功能障礙在包括慢性肺部疾病在內(nèi)的許多人類疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[30]。

線粒體功能障礙是公認(rèn)的衰老標(biāo)志，其特征是活性氧的產(chǎn)生增加和生物能量學(xué)的改變，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙可能與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，IPF中低氧或高碳酸血癥導(dǎo)致的線粒體功能障礙，通過介導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和肌成纖維細(xì)胞的激活造成肺上皮細(xì)胞持續(xù)損傷[31]。在IPF肺肌成纖維細(xì)胞中，PARK2基因的表達(dá)水平降低，PARK2基因缺乏引起的絲裂原吞噬不足誘導(dǎo)線粒體活性氧的產(chǎn)生增加，這也提示IPF中存在線粒體功能障礙[32]。IPF患者肺內(nèi)的AEC2有明顯的畸形和功能障礙的線粒體積聚，線粒體穩(wěn)態(tài)失調(diào)與PTEN誘導(dǎo)的蛋白激酶1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1)低表達(dá)、自噬不足、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物上調(diào)有關(guān)[32，33]。IPF肺泡上皮細(xì)胞中可以檢測到受損線粒體的形態(tài)變化及線粒體活性氧增加，而線粒體活性氧可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化損傷加速細(xì)胞衰老[33]。線粒體DNA本身對氧化損傷高度敏感，其損傷和隨后的突變可導(dǎo)致線粒體功能障礙，形成惡性循環(huán)，伴隨著線粒體功能障礙的衰老所誘導(dǎo)的生長停滯被稱為“線粒體功能障礙相關(guān)性衰老”[34]。線粒體不僅通過能量生成調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，還通過衰老相關(guān)的細(xì)胞表型調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。有研究表明，線粒體功能障礙引起衰老的機(jī)制包括活性氧水平升高、NAD/NADH比值改變等，促進(jìn)細(xì)胞衰老的其他線粒體改變是線粒體動力學(xué)異常、氧化磷酸化缺陷和鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)[9]。眾所周知，端粒隨著年齡的增長而縮短，端粒的縮短會增加IPF的風(fēng)險，而線粒體功能障礙也會導(dǎo)致端粒磨損，有報道稱，端粒磨損導(dǎo)致染色體縮短最終會減少線粒體的生物合成，二者互為因果，最終將增加活性氧的產(chǎn)生并激活細(xì)胞的衰老途徑[35]。

線粒體穩(wěn)態(tài)的維持受多種因素的調(diào)節(jié)，而線粒體異常造成的細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加對衰老機(jī)制的形成起著至關(guān)重要的作用，因此針對細(xì)胞內(nèi)線粒體的抗氧化劑可能在與IPF相關(guān)的細(xì)胞衰老過程中起到一定拮抗作用。

2.5 PTEN表達(dá)缺失 PTEN是一種抑癌基因，也是一種重要的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，現(xiàn)已證實PTEN可通過負(fù)性調(diào)控參與特發(fā)性肺纖維化衰老相關(guān)的分子機(jī)制[20]。目前已在IPF患者的肺泡上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中檢測到PTEN表達(dá)降低和蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)高激活狀態(tài)，雖然IPF中PTEN表達(dá)缺失的機(jī)制尚未完全明確，但已有研究表明PTEN的缺失可能與Caveolin-1蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)[4，36]。Qiu等[20]在早期的研究中利用敲除PTEN基因的小鼠建立博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，證實PTEN的缺失可通過激活A(yù)kt通路加速AEC衰老，但目前為止PTEN/Akt通路在AEC衰老中的確切作用仍不清楚。近兩年來，Tian等[37]通過免疫組化和免疫熒光檢測到IPF肺泡上皮細(xì)胞中PTEN呈低水平表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PTEN的缺失可介導(dǎo)一條新的通路，即激活NF-κB(nuclear factor κB)，通過PTEN/NF-κB通路的負(fù)性調(diào)控也能促進(jìn)IPF中AEC的衰老和SASP的分泌，隨即觸發(fā)成纖維細(xì)胞膠原沉積導(dǎo)致肺纖維化。PTEN表達(dá)缺失與衰老相關(guān)的IPF發(fā)病機(jī)制中有密切聯(lián)系，通過PTEN介導(dǎo)的多種信號通路共同促進(jìn)AEC衰老進(jìn)而參與IPF中細(xì)胞外基質(zhì)的形成與累積，因此針對切斷信號通路的治療可能為IPF提供新的治療方案。

2.6 自噬不足 自噬是一種幫助維持細(xì)胞器和蛋白質(zhì)合成、降解和循環(huán)之間的動態(tài)平衡以滿足代謝需求的過程，是一種依賴溶酶體的以降解受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)為主的細(xì)胞途徑，隨著年齡的增長而減弱[38]。已證明自噬不足會導(dǎo)致細(xì)胞衰老，并且在各種衰老狀態(tài)的組織中已觀察到自噬減少的現(xiàn)象，自噬功能缺陷造成細(xì)胞內(nèi)有害成分大量積累進(jìn)而參與細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)過程[16]。最近的研究證實，IPF患者暴露于香煙煙霧環(huán)境中可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞自噬不足，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞衰老和SASP的分泌增加[8]?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為p62和泛素化蛋白的表達(dá)是自噬不足的特征，Araya等[21]利用免疫組織化學(xué)檢測顯示體外模型中的IPF上皮細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞衰老標(biāo)志p21增加，纖維母細(xì)胞灶覆蓋的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均表達(dá)較高水平的p62和泛素化蛋白，由此可見自噬不足與IPF中細(xì)胞衰老存在密切關(guān)聯(lián)。另外自噬功能缺陷可通過促進(jìn)氧化應(yīng)激、功能障礙的線粒體和脂褐素沉積等進(jìn)一步加重肺損傷[39]。有研究提出IPF中自噬不足是肺泡上皮細(xì)胞加速衰老和肌成纖維細(xì)胞分化的潛在機(jī)制，IPF中自噬減少聯(lián)合TGF-β可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞程序性衰老，而成纖維細(xì)胞則通過衰老上皮細(xì)胞分泌的SASP誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化[40]。另有研究發(fā)現(xiàn)，自噬減少與衰老過程中肺纖維化的易感性有關(guān)，TGF-β1很可能是自噬減少的原因，由TGF-β1觸發(fā)的自噬亦可誘導(dǎo)上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，但TGF-β1與自噬不足的內(nèi)在聯(lián)系尚未研究透徹[39，41]。有學(xué)者提出，自噬激活不足可能是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑-1調(diào)節(jié)IPF患者氣道上皮細(xì)胞衰老的基礎(chǔ)[42]。

由此可見，細(xì)胞衰老的自噬調(diào)節(jié)主要針對IPF中肺泡上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞主要受到自噬不足的促纖維化調(diào)節(jié)，自噬失調(diào)可以視為IPF中聯(lián)系肺泡上皮細(xì)胞衰老與肌成纖維細(xì)胞分化的橋梁。無論是作為發(fā)病機(jī)制的調(diào)節(jié)因子還是作為潛在的治療靶點(diǎn)，自噬在人類肺部疾病中尤其是IPF中的作用日益增加。

細(xì)胞衰老與IPF密切相關(guān)，隨著對細(xì)胞衰老在IPF發(fā)病中作用的深入了解，以參與細(xì)胞衰老過程的分子生物學(xué)水平作為研究切入點(diǎn)可能為包括IPF在內(nèi)的年齡相關(guān)的慢性肺部疾病提供新的治療方案，也為今后的治愈提供可能，反映衰老生物標(biāo)志物的檢測有望在IPF患者疾病進(jìn)展過程中準(zhǔn)確地評估衰細(xì)胞老狀態(tài)協(xié)助進(jìn)行早期臨床干預(yù)，延緩患者疾病進(jìn)展改善預(yù)后。