洪麗萍 趙強(qiáng) 張婧

摘要：目的：利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析G蛋白偶聯(lián)受體蛋白GPR84基因表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤的分級(jí)、預(yù)后等關(guān)系。方法：通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分別篩選LGG與GBM信息，通過生物信息學(xué)分析將GPR84基因mRNA水平表達(dá)在腦膠質(zhì)不同瘤病理分級(jí)中的表達(dá)情況，以及GPR84的表達(dá)與患者臨床信息、預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：（1）GPR84在GBM中的表達(dá)顯著高于LGG（p<0.001）;（2）GPR84的高表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤高年齡組相關(guān)（p<0.001），在LGG、GBM中均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LGG中 p<0.001，GBM 中p<0.05）;（3）GPR84高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤患者總生存期更低（p<0.001）。GPR84高表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤總生存期較低的關(guān)系獨(dú)立于其與腦膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)的相關(guān)性，LGG與GBM中均存在GPR84高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)（LGG中 p<0.001，GBM 中p<0.05）。結(jié)論：GPR84基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與病理分級(jí)相關(guān)，且GPR84在腦膠質(zhì)瘤中的高表達(dá)提示預(yù)后不良。

關(guān)鍵詞：GPR84，腦膠質(zhì)瘤，低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)

Abstract：Objective： To analyze GPR84 mRNA level changes in patients with gliomas and the clinical significance based on TCGA database. Methods： LGG and GBM information were screened through the TCGA database，and after the data were standardized through bioinformatics analysis，the two groups of data with different pathological grades of gliomas were classified according to their grades，and then combined for analysis. To analyze the expression of GPR84 mRNA level in different pathological grades of glioma，and the relationship between the expression of GPR84 and clinical information and prognosis. Result： The expression of GPR84 was significantly increasing in GBM compare with LGG （p<0.001）. The high expression of GPR84 was correlated with the high-age group of glioma （p<0.001）. And the correlation between GPR84 expression and age was statistically significant in LGG and GBM，respectively （p<0.001 in LGG，p<0.05 in GBM）. Patients with brain glioma with high expression of GPR84 had a lower overall survival，and the difference was statistically significant （p<0.001）. The relationship between high expression of GPR84 and low overall survival of glioma was independent of its correlation with pathological grade of glioma. There was a significant correlation between high expression of GPR84 and low survival in LGG and GBM，respectively （p<0.001 in LGG，p<0.05 in GBM）. Conclusion： The expression of GPR84 gene in glioma is correlated with pathological grade，and the high expression of GPR84 in glioma may indicate poor prognosis.

Key words： GPR84，Glioma，LGG，GBM，TCGA Database

【中圖分類號(hào)】R4?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A?【文章編號(hào)】1673-9026（2021）13-03

1前言

1.1G蛋白偶聯(lián)受體84

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）家族，是由一系列對(duì)外界光、氣味，以及對(duì)多肽、核苷酸、神經(jīng)遞質(zhì)和激素等刺激敏感的細(xì)胞表面受體組成[1]。研究表明，一部分GPCRs可以被游離脂肪酸（y free fatty acids ，F(xiàn)FAs）激活[1]。G蛋白偶聯(lián)受體84（G-protein-coupled receptor 84，GPR84），是2001年Yousefi等人，從人類外周血中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的GPCRs家族一員。它可以被中鏈脂肪酸（medium-chain fatty acid，MCFA）激活，是FFAs受體[2-3]。

研究發(fā)現(xiàn)，GPR84主要表達(dá)于免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞中、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，同時(shí)也表達(dá)于脂肪細(xì)胞[4]。研究表明，GPR84在免疫代謝中發(fā)揮重要的作用，可作為TNF-α、IL-1等促炎因子受體發(fā)揮重要作用[4]。

目前，GPR84參與疾病發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制研究較少，主要在大腦神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、惡性血液病中的病理機(jī)制初步得到揭示[6]。在白血病干細(xì)胞中，GPR84可以維持異常的β-catenin信號(hào)處于持續(xù)活化狀態(tài)，在ALL和MLL的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[6]。

1.2GPR84與腦膠質(zhì)瘤

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外胚層衍化而來的膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的腫瘤，是顱內(nèi)腫瘤最常見的一種，根據(jù)惡性程度的不同分為不同的級(jí)別。低級(jí)別膠質(zhì)瘤（Low-grade gliomas，LGG）是指WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中，I、II級(jí)的膠質(zhì)瘤。低級(jí)別膠質(zhì)瘤發(fā)展緩慢，預(yù)后較好。高級(jí)別膠質(zhì)瘤進(jìn)展快，術(shù)后復(fù)發(fā)率極高，預(yù)后差，而其中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma，GBM）是星形細(xì)胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤[11]。

目前，尚未有GPR84表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤中的研究，但是已有研究發(fā)現(xiàn)，GPR84在腦膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，并在阿茲海默癥模型小鼠中的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[5]，但GPR84在小膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)不僅受到內(nèi)毒素等影響，還與其他因素相關(guān)。

1.3?TCGA中的腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)

癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)，整合了大量高質(zhì)量的的研究文獻(xiàn)及芯片數(shù)據(jù)，是當(dāng)前世界上最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.cancergenome.nih.gov/）是國(guó)家癌癥研究所（National Cancer Institute）和美國(guó)人類基因組研究所（National Human Genome Research Institute）共同監(jiān)督的一個(gè)項(xiàng)目，旨在應(yīng)用高通量的基因組分析研究提高對(duì)于癌癥的預(yù)防、診斷和治療能力。數(shù)據(jù)庫(kù)中整合了大量的腦膠質(zhì)瘤的基因表達(dá)、測(cè)序和臨床信息數(shù)據(jù)。我們通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的“TCGA-GBM”和“TCGA-LGG”項(xiàng)目中的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，分析GPR84在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況以及其與腦膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)、預(yù)后的關(guān)系。

2材料與方法

2.1TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選膠質(zhì)瘤不同分級(jí)GBM和LGG轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

GBM轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄了GBM病例共有617例，本研究通過如下設(shè)定進(jìn)一步篩選數(shù)據(jù)：本研究通過如下設(shè)定進(jìn)一步篩選數(shù)據(jù)：（1）Primary size： Brain;（2）Project： TCGA-GBM;（3）Disease Type： Gliomas;（4）Vital status： dead，alive，下載轉(zhuǎn)錄組HTSeq-Counts文件和臨床信息文件。

LGG轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄了LGG病例共有516例，進(jìn)一步篩選：將上述GBM篩選過程中“Project： TCGA-GBM”設(shè)定為“Project： TCGA-LGG”，其余同GBM轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選。

在RStudio軟件中，將GBM和LGG兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)HTSeq-Counts進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、整理、合并臨床信息，并進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)合并。最終，得到包含GPR84基因mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)GBM共 159例，LGG共 510例。

2.2TCGA轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中GPR84的mRNA表達(dá)量與臨床特征分析

以標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析GPR84的mRNA表達(dá)量與患者年齡、性別、膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的關(guān)系。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0（SPSS，Chicago，IL，USA） 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示。生存分析數(shù)據(jù)采用Mantel-Cox 回歸進(jìn)行生存分析。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1GPR84在mRNA水平的表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的關(guān)系

分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中符合基本信息明確、病理分級(jí)明確，且包含GPR84的mRNA表達(dá)量的腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)共669例，其中低級(jí)別膠質(zhì)瘤510例（LGG=510），膠質(zhì)母細(xì)胞瘤159例（GBM=159）。通過分析發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中GPR84的mRNA表達(dá)量顯著高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.001）（Fig.3.1.1）

Fig.3.1.1 GPR84基因在不同病理分級(jí)的腦膠質(zhì)瘤中的mRNA表達(dá)情況?低級(jí)別膠質(zhì)瘤 LGG=510，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤GBM=159，t（227.155）=15.069，95%置信區(qū)間 CI[-1.560，-1.174]，P<0.001。GPR84的mRNA水平在GBM中顯著高于LGG，在GBM平均表達(dá)量7.832，在LGG平均表達(dá)量6.608。

3.2GPR84基因與腦膠質(zhì)瘤患者臨床信息的關(guān)系

分析腦膠質(zhì)瘤患者中GPR84的mRNA表達(dá)水平與患者的年齡、性別的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)GPR84的mRNA表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者的年齡存在相關(guān)性，年齡≥40的患者GPR84的表達(dá)水平顯著高于年齡<40的患者（p<0.001）（Fig.3.2.1.A）。GPR84的mRNA表達(dá)水平與患者的性別無關(guān)（Fig.3.2.1.B）。

Fig.3.2.1 GPR84基因mRNA表達(dá)情況與腦膠質(zhì)瘤患者年齡、性別的關(guān)系?A.GPR84基因mRNA表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者年齡的關(guān)系 其中年齡<40歲患者253例，年齡≥40歲患者416例，t（634.019）=-4.079，95%置信區(qū)間 CI[-0.462，-0.147]，P<0.001。B.GPR84基因mRNA表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者性別的關(guān)系 其中女性患者284例，男性患者385例，P=0.253。

分別分析GPR84在LGG中mRNA水平與患者的發(fā)病年齡、性別的關(guān)系，及其在GBM中的上述相關(guān)性分析。GPR84的mRNA表達(dá)水平與LGG患者的年齡相關(guān)，高齡（年齡≥40）的患者GPR84的mRNA表達(dá)水平顯著高于低齡組患者（p<0.001）（Fig.3.2.2.A）。在GBM中，與上述同樣的年齡分組并不存在相關(guān)性（p=0.059）（Fig.3.2.2.C）。但年齡劃分為35歲時(shí)，GBM中同樣出現(xiàn)齡（年齡≥35）的患者GPR84的mRNA表達(dá)水平顯著高于低齡組患者（p<0.05）。在LGG和GBM，均顯示出GPR84的mRNA高表達(dá)與高年齡組相關(guān)。

Fig.3.2.2 GPR84基因mRNA表達(dá)情況分別于LGG、GBM患者年齡、性別的關(guān)系?A.GPR84基因mRNA表達(dá)與LGG年齡的關(guān)系 其中年齡<40歲患者240例，年齡≥40歲患者270例，t（496.647）=2.151，95%置信區(qū)間 CI[0.016，0.366]，P<0.05。B-C.GPR84基因mRNA表達(dá)與GBM年齡的關(guān)系其中年齡<35歲患者9例，年齡≥35歲患者150例，t（9.023）=-2.285，95%置信區(qū)間 CI[0.097，-1.464]，P<0.05。年齡<40歲患者13例，年齡≥40歲患者146例，P=0.059。

3.3GPR84與腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系

利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)信息，去除確診后存活期小于30天病例，對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中GPR84 mRNA表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者生存期關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GPR84高表達(dá)組患者總生存時(shí)間顯著低于GPR84低表達(dá)組（p<0.0001），提示GPR84基因高表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤預(yù)后不良相關(guān)（Fig.3.3.1.A）。繼而，我們分別在LGG與GBM中進(jìn)行GPR84表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者生存期關(guān)系分析，結(jié)果顯示，在LGG、GBM中GPR84高表達(dá)均提示預(yù)后不良。（LGG中p<0.01，GBM中p<0.05）。這表明，GPR84的高表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良，且獨(dú)立于腦膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)。

Fig.3.3.1 GPR84基因mRNA表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系?A.全部腦膠質(zhì)瘤病例GPR84基因mRNA高表達(dá)組317例，低表達(dá)組277例，GPR84基因mRNA高表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤預(yù)后不良顯著相關(guān)（p<0.0001）。B. LGG病例中 GPR84基因mRNA高表達(dá)組286例，低表達(dá)組158例，GPR84基因mRNA高表達(dá)與LGG預(yù)后不良相關(guān)（p<0.01）。C. GBM中 GPR84基因mRNA高表達(dá)組30例，低表達(dá)組120例，GPR84基因mRNA高表達(dá)與GBM預(yù)后不良相關(guān)（p<0.05）。

3.4GPR84相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析GPR84蛋白的相關(guān)作用蛋白，以GPR84為中心，發(fā)現(xiàn)多個(gè)共表達(dá)蛋白（Fig.3.4.1.A）。進(jìn)一步通過Kmeans聚類分析，通過將于GPR84相關(guān)蛋白分簇?cái)?shù)設(shè)定為6，找到與GPR84可能與其最相關(guān)的共表達(dá)蛋白CLEC5A（SCORE 0.953）（Fig.3.4.1.B）

4討論

隨著對(duì)GPR84研究逐步深入，已知GPR84蛋白在多種代謝過程中發(fā)揮重要作用。GPR84作為免疫代謝受體，參與免疫代謝調(diào)控，可以調(diào)控多種免疫細(xì)胞發(fā)揮功能[8]。同時(shí)，有研究表明TNFα可提高脂肪細(xì)胞中GPR84的表達(dá)[9]。

GPR84在惡性腫瘤中的研究處于起步階段，通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，GPR84除了與血液淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤相關(guān)，還在膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、乳腺癌等腫瘤中高表達(dá)，其中與臨床意義密切相關(guān)的是GPR84在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病與先天遺傳基因存在高危因素相關(guān)，同時(shí)也與環(huán)境相關(guān)，腦膠質(zhì)瘤具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高及患者預(yù)后差等特點(diǎn)，給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)[10]。通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，我們發(fā)現(xiàn)GPR84與腦膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)密切相關(guān)、與年齡相關(guān)，并且GPR84高表達(dá)可能對(duì)腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后具有提示作用。但是，除了GPR84在MLL和ALL的病理機(jī)制初步被揭示之外，GPR84在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用的機(jī)制尚未明確。通過其蛋白相互關(guān)系分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CLEC5A、LILRB2等參與免疫調(diào)控的分子與GPR84共表達(dá)，進(jìn)一步表明其主要通過免疫代謝調(diào)控的方式發(fā)揮作用。

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作者簡(jiǎn)介：洪麗萍，第一作者，1988年出生，女，碩士，天津市腫瘤醫(yī)院空港醫(yī)院，從事腫瘤學(xué)與腫瘤臨床轉(zhuǎn)化方向研究。

本研究受以下基金資助：1.天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院?院級(jí)課題項(xiàng)目?編號(hào)：1809;2.天津市衛(wèi)生健康科技項(xiàng)目編號(hào)：RC20189