丁 磊,陸文靜,2,楊彥君,馬 歡,吳云鋒,*

(1.西北農林科技大學植物保護學院,旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室,農業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室, 陜西楊凌 712100;2.黑龍江省農業(yè)科學院水稻研究所,黑龍江佳木斯 154026)

小麥藍矮病是我國西北麥區(qū)一種重要植原體病害，對小麥危害嚴重(Wuetal.,2010)。該病害由異沙葉蟬Psammotettixalienus持久?；詡鞑?，介體葉蟬傳毒成為病害流行的中心環(huán)節(jié)(顧沛雯等,2007)。明確小麥藍矮植原體(wheat blue dwarf phytoplasma,WBDp)蟲傳相關蛋白與何種葉蟬蛋白互作及葉蟬傳播小麥藍矮植原體的分子機制，探索植原體病害防治新途徑成為當前面臨的關鍵問題。

作者前期經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)，pWBD-2-ORF4(WBDp第2個質粒編碼的ORF4,P2-4)與泡桐叢枝植原體蟲傳蛋白pPaWBNy-1-ORF5的氨基酸序列(耿顯勝,2013)一致性為79.14%(Chenetal.,2014)。隨后進行蟲傳和嫁接對比實驗，qRT-PCR檢測表明傳染初期葉蟬傳播長春花植株中的P2-4表達量要明顯高于嫁接接種WBDp的植株中的，推測P2-4參與WBDp介體傳播。但如何影響沒有研究報道。因此，本研究構建了異沙葉蟬分離泛素酵母雙雜交膜系統(tǒng)cDNA文庫，用P2-4蛋白從文庫中篩選，獲得ATP6等異沙葉蟬互作蛋白；利用RNAi技術沉默互作蛋白，明確互作蛋白在WBDp傳播過程中的功能，對于阻斷異沙葉蟬的傳播過程和WBDp病害綠色防控具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

WBDp毒源、無毒介體異沙葉蟬由本實驗室提供。異沙葉蟬飼養(yǎng)于小麥小偃6號幼苗上，人工氣候室控制溫度24℃，相對濕度20%～40%，光周期16L∶8D，每15 d更換一次小麥幼苗。NMY51酵母菌株、pNubG-Fe65,pTSU2-APP,pBT3STE,pPR3-N和pOST1-NubI載體質粒購自上海海科生物技術有限公司，T7 RiboMAXTMExpress RNAi System購自Promega公司。

1.2 異沙葉蟬分離泛素酵母雙雜交膜系統(tǒng)cDNA文庫構建

異沙葉蟬總RNA的提取參照Trizol?Reagent (Invitrogen)操作手冊進行，分別用1.3%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢測RNA質量和濃度。使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)分離純化樣本mRNA。參照SMART cDNA Library Construction方法(Zhuetal.,2001)合成ds cDNA，將cDNA純化產物和pPR3-N同時用SfiⅠ酶切連接完成異沙葉蟬cDNA文庫的構建，并檢測文庫質量和滴度。

1.3 P2-4誘餌載體的構建

根據(jù)P2-4基因(GenBank登錄號:JX668988)序列設計帶有SfiⅠ酶切位點的克隆引物對P2-4-pBT3STE-F/R(表1)，使用CTAB法提取帶WBDp小麥葉片總DNA，再以總DNA為模板擴增P2-4基因，通過同源重組將目的基因構建到酵母雙雜交誘餌載體pBT3STE上，用引物P2-4-F/R(表1)和引物pBT3-F1/R1(表1)分別擴增目的片段無誤后，測序驗證。PCR反應體系(25 μL):DNA 模板2 μL,2×Taq Master Mix 12.5 μL,正反向引物(10 μmol/L)各 1 μL以及 ddH2O 8.5 μL。反應條件:94℃ 3 min;94℃ 30 s,51℃ 60 s,72℃ 90 s,30個循環(huán);最終延伸 72℃ 10 min。

1.4 誘餌載體pBT3STE-P2-4篩選葉蟬cDNA文庫

參照DUALhunter System操作方法(M?cklietal.,2008)，將誘餌載體pBT3STE-P2-4和異沙葉蟬cDNA文庫質粒共轉化到NMY51酵母菌中，將轉化產物涂布在DDO和QDO選擇培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)4～5 d。挑取單菌落重新在四缺培養(yǎng)基(QDO)培養(yǎng)基上培養(yǎng)并進行α-半乳糖苷酶檢測，挑選陽性克隆進行PCR鑒定并測序，測序結果在NCBI BLAST比對分析。同時對篩選到的互作蛋白進行GO注釋以及KEGG通路分析。

1.5 ATP6基因片段擴增

利用Primer Premier 5.0軟件在ATP6基因(GenBank登錄號:KX437742)功能區(qū)設計引物ATP6-F/R(表1)擴增ATP6基因片段。綠色熒光蛋白基因GFP(GenBank登錄號:KF718991)片段通過特異性引物(表1)從本實驗室保存的pCambia1302-GFP質粒上擴增。將ATP6和GFP片段純化后分別與pMD-18T載體(TaKaRa)連接得到pMD-18T-ATP6和pMD-18T-GFP，轉化大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞，鑒定出陽性克隆后提取質粒送測序驗證。

1.6 RNAi沉默ATP6基因后異沙葉蟬傳播WBDp能力的檢測

使用引物ATP6-TF/R(表1)和GFP-TF/R(表1)從1.5節(jié)構建的重組載體pMD-18T-ATP6和pMD-18T-GFP中PCR擴增目的基因ATP6和GFP，反應體系和反應條件見1.3節(jié)。以PCR產物為模板合成dsRNA。利用Promega公司的T7 Ribomax Express RNAi System試劑盒合成ATP6和GFP的dsRNA，dsGFP用于對照組。將2 μL dsRNA (5 μg/μL)與20 μL液體人工飼料混勻后，在玻璃雙通管內飼喂無毒異沙葉蟬3齡若蟲2 d(Fuetal.,2001;田宏剛,2009)，在飼喂結束后的第1,3,5,7,9和11天取樣進行qRT-PCR檢測異沙葉蟬3齡若蟲體內ATP6的表達情況，引物序列見表1。PCR反應體系(20 μL):cDNA模板1 μL,UltraSYBR Mixture 10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL以及 ddH2O 8 μL。反應條件:95℃ 10 min;95℃ 15 s,60℃退火/延伸 60 s,40個循環(huán)。生物學重復和技術重復各3次，每個生物學重復來自3頭個體，內參基因為Actin，內參基因引物序列為qActin-F/R(表1)。參照 2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量變化(Livak and Schmittgen,2001)，使用Microsoft Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理并作圖。

轉接無毒異沙葉蟬3齡若蟲至含有dsRNA的人工飼料飼喂2 d后再飼喂WBDp 7 d，每株小麥轉接3頭異沙葉蟬若蟲傳毒7 d，培養(yǎng)生長14 d后PCR檢測植株感病情況并分析沉默ATP6基因及對異沙葉蟬傳播WBDp能力的影響。先提取小麥葉片總DNA，再以總DNA為模板使用引物P1/P7(表1)和引物R16F2n/R2(表1)進行巢式PCR檢測小麥帶WBDp的情況。PCR反應體系和反應條件見1.3節(jié)。之后統(tǒng)計dsATP6組和dsGFP組(每處理組實驗重復3次，每次檢測小麥30株)帶WBDp的小麥植株數(shù)量，分別計算兩組小麥帶WBDp的百分率，即為異沙葉蟬對WBDp的傳播率。

1.7 數(shù)據(jù)分析

基因的相對表達量和WBDp傳播率著性檢驗方法采用SAS 9.2軟件中獨立樣本T檢驗(P<0.01)進行，結果表示為3次重復的平均值±標準誤。

2 結果

2.1 異沙葉蟬分離泛素酵母雙雜交膜系統(tǒng)cDNA文庫構建和質量檢測

電泳結果顯示提取的異沙葉蟬總RNA未降解，完整性較好，純化出3.9 μg mRNA，條帶清晰且分布均勻，符合建庫需要(圖1)。mRNA反轉錄產物ds cDNA經(jīng)SfiⅠ酶切后連接pPR3-N文庫載體，獲得了以pPR3-N為載體的酵母雙雜交膜系統(tǒng)cDNA文庫，原始文庫庫容量約為1.25×107cfu。PCR檢測顯示插入片段平均長度大于1.2 kb，文庫陽性率為100%(圖2)。擴繁文庫菌液并抽提質粒，得到文庫質粒2.5 mg。

圖1 異沙葉蟬總RNA和純化mRNA電泳Fig.1 Electrophoresis of total RNA and purified mRNA isolated from Psammotettix alienusM:DL12000;1:總RNA Total RNA;2:純化的mRNA Purified mRNA.

圖2 異沙葉蟬cDNA文庫插入片段的PCR檢測Fig.2 Detection of inserted fragments of cDNA library of Psammotettix alienus by PCRM:DL12000;1-24:24個隨機選取的克隆24 clones randomly selected.

2.2 P2-4雜交異沙葉蟬分離泛素酵母雙雜交膜系統(tǒng)cDNA文庫篩選互作蛋白

使用帶酶切位點的P2-4-pBT3STE-F/R引物擴增目的基因，經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收后將P2-4同源重組法連接至pBT3STE載體，構建了誘餌蛋白載體pBT3STE-P2-4。使用P2-4-F/R和pBT3-F1/R1引物擴增分別得到489 bp和591 bp條帶(圖3)，送測序驗證重組質粒序列無誤。

圖3 小麥藍矮植原體的P2-4基因及其重組質粒pBT3STE-P2-4的PCR電泳檢測Fig.3 Gel electrophoresis of P2-4 gene of wheat blue dwarf phytoplasma and its recombinant plasmid pBT3STE-P2-4 detected by PCRM:DS5000;1:P2-4;2:pBT3STE-P2-4.

將誘餌載體pBT3STE-P2-4與異沙葉蟬文庫質粒共轉化酵母NMY51感受態(tài)細胞，在DDO和QDO培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。結果獲得總菌落數(shù)為1.57×106cfu，轉化效率為5.39×104cfu/μg。提取酵母菌陽性克隆質粒并轉入到大腸桿菌中進行測序，將測序結果在BLAST分析后，獲得ATP synthase F0subunit 6(ATP6)等8種候選蛋白(表2)，回復驗證和α-半乳糖苷酶檢測結果顯示P2-4與以上8種蛋白互作(圖4)，其中與ATP6為強互作。

圖4 異沙葉蟬cDNA文庫中與WBDp的P2-4互作蛋白陽性克隆的α-半乳糖苷酶檢測Fig.4 Detection of α-galactosidase of positive clones interacting with P2-4 of WBDp in the cDNA library of Psammotettix alienusP:陽性Positive;N:陰性Negative;1-8:陽性克隆，對應的蛋白信息見表2 Positive clones,their corresponding proteins as in Table 2.

表2 從異沙葉蟬cDNA文庫篩選出與小麥藍矮植原體的P2-4互作的蛋白Table 2 Putative proteins screened in the cDNA library of Psammotettix alienus interacting with P2-4 of wheat blue dwarf phytoplasma

對篩選到的互作蛋白進行GO注釋，結果顯示上述蛋白參與的生物學進程包括ATP合成耦合質子運輸(ATP synthesis coupled proton transport)、三磷酸鳥苷生物合成過程(GTP biosynthetic process)、凋亡過程(apoptotic process)、調節(jié)肌肉細胞細胞內穩(wěn)態(tài)(muscle cell cellular homeostasis)、消化過程(digestive process)、運輸(transport)及細胞質翻譯(cytoplasmic translation)等；分子功能包括質子跨膜轉運體活性(proton transmembrane transporter activity)、核糖體結構成分(structural constituent of ribosome)、催化活性(catalytic activity)、細胞色素C的凋亡釋放(apoptotic release of cytochrome c)、肌動蛋白與金屬離子結合(actin and metal ion binding)、半胱氨酸型肽酶活性(cysteine-type peptidase activity)及脂質結合(lipid binding)等；細胞組成包括線粒體(mitochondrion)、細胞膜(membrane)、細胞質溶膠(cytosol)、線粒體內膜(mitochondrion inner membrane)和細胞骨架(cytoskeleton)等(圖5)。參考KEGG數(shù)據(jù)庫，上述蛋白參與異沙葉蟬體內能量代謝、跨膜運動和其他代謝調控過程。

圖5 異沙葉蟬cDNA文庫中與小麥藍矮植原體的P2-4互作蛋白的GO注釋Fig.5 GO annotation of proteins in cDNA library of Psammotettix alienus interacting with P2-4 of wheat blue dwarf phytoplasmaA:分子功能 Molecular function;B:生物學進程 Biological process;C:細胞組成 Cellular component.

2.3 ATP6片段擴增和dsRNA的合成

經(jīng)基因擴增，得到525 bp的ATP6和284 bp的GFP片段條帶(圖6)，分別純化后插入pMD-18T載體，得到pMD-18T-ATP6和pMD-18T-GFP，以從克隆載體中擴增的目的基因的PCR產物為模板合成dsRNA，經(jīng)過洗滌和純化，獲得ATP6的dsRNA和GFP的dsRNA。

圖6 ATP6和GFP擴增片段的電泳檢測Fig.6 Gel electrophoresis of ATP6 and GFP fragmentsM:DS2000;1:ATP6;2:GFP.

2.4 沉默ATP6對異沙葉蟬傳毒能力的影響

用ATP6和GFP的dsRNA 分別飼喂無毒異沙葉蟬3齡若蟲后，在6個時間點取樣進行qRT-PCR檢測，結果表明飼喂ATP6的dsRNA第1-11天異沙葉蟬體內ATP6的表達量降低，僅為對照組(dsGFP)的30%～40%(P<0.01)，第5天下降最明顯(圖7)，表明飼喂dsATP6能夠降低異沙葉蟬若蟲體內ATP6 mRNA水平。用飼喂dsRNA 2 d后的異沙葉蟬3齡若蟲進行傳毒能力測定，結果表明dsATP6飼喂組葉蟬的WBDp傳播率比對照組(dsGFP飼喂組)下降了23.33%±3.33%(圖8)。說明篩選到的ATP6蛋白對異沙葉蟬傳播小麥藍矮植原體的能力有一定影響，是一種重要的傳毒相關蛋白。

圖7 RNAi干擾ATP6對健康異沙葉蟬3齡若蟲中ATP6的相對表達量的影響Fig.7 Effect of RNAi of ATP6 on the relative expression level of ATP6 in the 3rd instar nymphs of healthy Psammotettix alienus圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上星號表示差異顯著(P<0.01,T檢驗)。Data in the figure are mean±SE.Asterisk above bars indicates significant differences (P<0.01,T-test).下同The same below.

3 討論

本研究運用SMART技術構建了高質量的異沙葉蟬分離泛素酵母雙雜交膜系統(tǒng)cDNA文庫，并以P2-4蛋白為誘餌，篩選到ATP合成酶等8種互作蛋白(表1)，可能與WBDp傳播相關。利用RNAi技術沉默ATP6基因表達后，異沙葉蟬3齡若蟲傳播WBDp的效率明顯降低了23.33%(圖8)，說明異沙葉蟬ATP6蛋白影響了WBDp的持久?；詡鞑?。從異沙葉蟬體內鑒定出的ATP6互作蛋白為研究WBDp與昆蟲介體互作機制和植原體病害的田間防治提供了理論基礎。

圖8 ATP6 RNAi對異沙葉蟬3齡若蟲的WBDp傳播率的影響Fig.8 Effect of RNAi of ATP6 on the WBDp transmission rate by the 3rd instar nymphs of Psammotettix alienus將無毒異沙葉蟬3齡若蟲飼喂含有dsRNA的人工飼料2 d后再飼喂WBDp 7 d，之后每株小麥轉接3頭異沙葉蟬若蟲傳毒7 d，接蟲14 d后PCR檢測小麥植株帶WBDp的情況；每處理組實驗重復3次，每次檢測30株小麥。The 3rd instar nymphs of healthy P. alienus were fed with WBDp for 7 d after fed with the artificial diet containing dsRNA for 2 d,and then three nymphs were transferred to a wheat plant for 7 d.The presence of WBDp in wheat plants were detected at 14 d after nymph infestation.Three repeat experiments were performed for each treatment,and a total of 30 wheat plants were examined for each repeat.

本實驗利用P2-4蛋白篩選異沙葉蟬酵母文庫，共獲得8種可能與WBD植原體傳播相關的異沙葉蟬蛋白。其中，ATP6的克隆數(shù)為7個，遠多于其他7種互作蛋白的克隆數(shù)。已有研究表明ATP合成酶通過兩個結構域F1和F0相互作用與細胞膜結合催化ATP的合成(Boyer,1997)，為各種細胞活動提供能量。由于植原體本身缺乏ATP合成途徑(Oshimaetal.,2004;Jietal.,2010)，在一定程度上依賴介體昆蟲體內的ATP完成運輸和繁殖(Christensenetal.,2005;Hogenhoutetal.,2008)。我們推測異沙葉蟬ATP6蛋白參與WBDp的傳播并首選ATP6蛋白進行后續(xù)驗證。利用RNAi技術沉默ATP6后，異沙葉蟬傳播WBDp的效率明顯下降(圖8)。表明異沙葉蟬ATP6蛋白是參與WBDp傳播的關鍵蛋白。太平洋白蝦LitopenaeusvannameiATP synthase β與白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus,WSSV)結合，并在宿主侵襲過程中發(fā)揮作用(Liangetal.,2010)。同時作為病毒受體，介導病毒顆粒進入宿主細胞(Fongsaranetal.,2014;Liangetal.,2015)。ATP synthase β也與植原體的免疫膜蛋白互作并參與植原體介體傳播(Galettoetal.,2011)。本研究中WBDp的P2-4蛋白和ATP6存在特異性互作，推測WBDp在進入介體消化系統(tǒng)的過程中，利用葉蟬體內ATP完成運輸和繁殖。本研究結合酵母雙雜交和RNAi技術，鑒定出一種參與WBDp傳播的關鍵蛋白ATP6，但是對于P2-4與ATP6蛋白的結合方式及互作機理仍不明確。在接下來的研究中，我們將利用GST-pull down和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)等方法進一步驗證二者的互作關系，并結合免疫熒光(immunofluorescence,IF)等技術揭示異沙葉蟬傳播WBDp的分子機理。

RNAi技術已經(jīng)有20余年的發(fā)展歷史，而且在害蟲控制中顯示出重要價值和巨大的應用潛力(Zhangetal.,2017)。RNAi不僅是基因功能鑒定的有效分子工具，也是開發(fā)害蟲和病害控制的新途徑，對環(huán)境影響小，目標特異性強，已經(jīng)廣泛應用于害蟲防治(Gu and Knipple,2013;Lietal.,2013;Jogaetal.,2016;Kanakala and Ghanim,2016)。本研究通過飼喂法將ATP6 dsRNA導入異沙葉蟬體內后沉默效果明顯(圖7)，表明ATP6在結合WBDp進入異沙葉蟬體內發(fā)揮重要作用。同時ATP6也有望成為降低異沙葉蟬對小麥藍矮植原體的傳播效率的有效靶標，對小麥藍矮植原體病害的防治具有重要意義。

致謝本研究異沙葉蟬RNAi實驗得到西北農林科技大學植物保護學院田宏剛老師的指導和幫助，特此致謝。