王文華， 劉 洋， 呂 洋， 趙亞如， 王海萍

河北北方學(xué)院干細(xì)胞與生殖生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，張家口 075000

近年來(lái)，盡管社會(huì)經(jīng)濟(jì)穩(wěn)步提高，但是心血管疾病的患病率卻居高不下。在臨床上發(fā)現(xiàn)，心肌梗死(myocardial infarction，MI)伴隨著心肌細(xì)胞的缺血、缺氧、凋亡壞死，梗死的組織被瘢痕組織代替，造成心肌局部功能障礙、心室重塑和擴(kuò)張，最終演變成心力衰竭。目前MI的治療手段包括藥物、介入、手術(shù)等綜合治療方法，但是不能從根本上治愈，只是在一定程度上緩解病情。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具備自我更新以及多向分化的能力，在體外特定環(huán)境下可分化為多種細(xì)胞，從而成為治療心肌梗死最理想的種子細(xì)胞[1-2]，本綜述對(duì)BMSCs的來(lái)源、特點(diǎn)、作用機(jī)制、誘導(dǎo)方法進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)，為BMSCs在心血管疾病治療中的作用提供參考。

1 BMSCs的生物學(xué)特性

BMSCs是一種能夠從骨髓中分離出的多能干細(xì)胞，是一種成體干細(xì)胞(adult stem cells，ASCs)。它具有自我更新和多向分化的能力[3]，在體外通過特定的條件，可分化成脂肪、骨、軟骨、成纖維、心肌等細(xì)胞[3-5]，同時(shí)BMSCs具有獲取便利，操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，且可以大量培養(yǎng)擴(kuò)增[6]。BMSCs還具有免疫抑制的特點(diǎn)，自我調(diào)節(jié)免疫排斥反應(yīng)，對(duì)自身免疫性疾病和器官移植而言是理想選擇[7]。

2 BMSCs治療心肌方面疾病的作用機(jī)制

BMSCs治療心肌方面疾病的機(jī)制，主要為旁分泌作用。其可以分泌多種活性細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)、趨化性細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子具有促進(jìn)血管生成、炎癥抑制、抗纖維化以及趨化歸巢等作用，參與并協(xié)助BMSCs修復(fù)損傷的心肌組織[8-9]。BMSCs具有極化的作用，可以在急性炎癥的環(huán)境下，使促炎型MSC1和抗炎型MSC2相互轉(zhuǎn)化，從而緩解炎癥對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。有研究表明，當(dāng)心肌組織受損時(shí)，炎癥因子促使MI型巨噬細(xì)胞大量分化，產(chǎn)生的促炎因子，如IFN-γ和TNF-α，加速M(fèi)SCs獲得抗炎型MSC2，從而對(duì)淋巴細(xì)胞功能產(chǎn)生抑制作用，減少免疫反應(yīng)，減少過度應(yīng)激導(dǎo)致的組織損傷[10]。在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌梗死區(qū)域中人的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞可以將MSC1轉(zhuǎn)換成MSC2，從而減輕炎癥，改善心臟的功能[11]。BMSCs在歸巢的作用中可以分泌CC趨化因子、HGF/c-Met等。CC趨化因子，包括CCL2、CCL3、CCL4均對(duì)細(xì)胞有趨化作用。有研究發(fā)現(xiàn)，通過過表達(dá)CCL3受體CCR1，可以使MSCs實(shí)現(xiàn)歸巢，對(duì)受損心肌部位的作用顯著提高[12]。c-Met作為HGF的受體，是一種酪氨酸激酶，二者相結(jié)合后，HGF/c-Met信號(hào)通路參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移、抗凋亡、血管生成等[13]。

3 體外誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的方法

研究發(fā)現(xiàn)，體外條件誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化有多種方法。其中化學(xué)因素、生物因素等是最早且相對(duì)簡(jiǎn)單的誘導(dǎo)方式。除此之外還包括一些物理因素的干預(yù)、中藥單體及復(fù)方等，在很多研究中發(fā)現(xiàn)一定的條件下均可以增強(qiáng)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的效率[14-16]。

3.1 化學(xué)因素

5-氮胞苷(5-azacytidine，5-Aza)是最早、最經(jīng)典的心源性化學(xué)誘導(dǎo)劑。Makino等[17]早在1999年就首次證實(shí)了在體外能夠?qū)㈤g充質(zhì)干細(xì)胞成功地誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，5-Aza的發(fā)現(xiàn)為藥物誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞的分化奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。有研究表明，5-Aza在體外誘導(dǎo)形成的心肌細(xì)胞有肌管形成，且具有類似心肌細(xì)胞的肌小節(jié)結(jié)構(gòu)和動(dòng)作電位，這些都是心肌細(xì)胞獨(dú)有的特征[18]。由于5-Aza屬于細(xì)胞抑制劑，一直被應(yīng)用于腫瘤治療，但是其去甲基化作用可以使其作為一個(gè)心源性誘導(dǎo)劑，由于它具有一定的細(xì)胞毒性，對(duì)濃度的要求嚴(yán)格，所以單獨(dú)運(yùn)用5-Aza誘導(dǎo)的研究較少[19]。因此，有研究發(fā)現(xiàn)5-Aza與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)聯(lián)合使用可以減少細(xì)胞的凋亡，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用[20]。

環(huán)磷腺苷葡胺(MCA)是環(huán)磷腺苷的衍生物[21]，具有一定的脂溶性，因此能輕易穿過脂溶性細(xì)胞膜對(duì)心肌發(fā)揮作用。主要是通過興奮-收縮加強(qiáng)心肌收縮，增加心肌細(xì)胞代謝，恢復(fù)心肌功能[22-23]。周榮等[24]關(guān)于MCA對(duì)BMSCs向心肌細(xì)胞方向分化影響的研究中發(fā)現(xiàn)，MCA可以進(jìn)入BMSCs，在cAMP/PKA信號(hào)通路的作用下可以促進(jìn)BMSCs表達(dá)出心肌特異性基因。李丹等[25]在MCA對(duì)BMSCs誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞的研究中，證實(shí)了其參與誘導(dǎo)的主要機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路的激活有關(guān)。

二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)主要的作用機(jī)制是通過抑制C-MYC基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞內(nèi)源性聚腺苷二磷酸核苷的水平降低。有研究證實(shí)，在體外通過DMSO誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞方向分化，分化后的心肌細(xì)胞具備心肌的表型。也有研究表明，DMSO對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用[26-29]。

3.2 生物因素

3.2.1 細(xì)胞因子 細(xì)胞因子屬于生物因子，因此具有天然的親和力。與其他外源試劑相比，具有很大的優(yōu)勢(shì)。參與心肌細(xì)胞分化的因子種類很多。有報(bào)道指出，心肌細(xì)胞是可以自分泌出TGF-β類生長(zhǎng)因子，并能夠調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞平滑肌肌動(dòng)蛋白、橫紋肌肌動(dòng)蛋白和β-肌球蛋白的表達(dá)[30]。在很多研究中發(fā)現(xiàn)TGF-β類生長(zhǎng)因子是可以調(diào)節(jié)胚胎組織的重要生長(zhǎng)因子，對(duì)心臟的發(fā)育具有重要作用[31]。BMP-2是TGF-β家族中重要一員，是心臟中重要的細(xì)胞因子，對(duì)胚胎發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用。同時(shí)還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡[32]。BMP-2在參與心臟發(fā)育的過程中可能與Cdc42、PAK、LIMK1、p38、MK2及Hsp25通路有關(guān)，在BMP-2誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞遷移的過程中發(fā)揮重要作用[33-34]。此外，BMP信號(hào)通路調(diào)節(jié)心臟基因的表達(dá)，Smad1作為BMP信號(hào)通路的效應(yīng)器，與心肌蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)BMP信號(hào)通路在心血管發(fā)育中發(fā)揮作用[35]。有研究發(fā)現(xiàn)，BMP可以誘導(dǎo)雞的非心臟前中胚層細(xì)胞中心臟轉(zhuǎn)錄因子的異位表達(dá)并使心肌細(xì)胞跳動(dòng)，這表明BMPs可以參與心臟發(fā)育[36]。但是誘導(dǎo)后的心肌細(xì)胞是否是天然的心肌細(xì)胞還有待探討。

3.2.2 模擬心肌微環(huán)境 模擬心肌微環(huán)境法包括直接接觸共培養(yǎng)法和間接接觸共培養(yǎng)法。間接接觸共培養(yǎng)法只是在培養(yǎng)方式上不同于直接接觸法。直接接觸共培養(yǎng)方式不僅可以進(jìn)行化學(xué)信號(hào)的融合，而且可以收到心肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)而產(chǎn)生的機(jī)械牽拉和機(jī)械信號(hào)的感應(yīng)。相反，間接接觸共培養(yǎng)方式是通過物理屏障將兩種細(xì)胞分開培養(yǎng)，盡管這兩種細(xì)胞不能直接接觸，但是依舊可以受到各自分泌的化學(xué)因子的作用和影響。直接接觸共培養(yǎng)法包括心肌細(xì)胞裂解液法、凍融液法及與心肌細(xì)胞接觸法。

心肌細(xì)胞裂解液法：主要是體外模擬心肌微環(huán)境[36]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過制備小型豬的心肌細(xì)胞裂解液，能夠?qū)MSCs向心肌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化發(fā)揮作用[37]，李琴等[38]發(fā)現(xiàn)通過制備小型豬的心肌細(xì)胞裂解液，能夠?qū)MSCs向心肌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化發(fā)揮作用。在心肌裂解液環(huán)境下，觀察誘導(dǎo)BMSCs分化的心肌樣細(xì)胞，在透射電鏡和掃描電鏡下均可以看到心肌細(xì)胞的表型結(jié)構(gòu)，而且在連續(xù)誘導(dǎo)12 d后發(fā)現(xiàn)很多區(qū)域有自律性波動(dòng)的多核肌管結(jié)構(gòu)等，這些結(jié)果均可以說(shuō)明良好的心肌微環(huán)境是可以提高誘導(dǎo)效率，并且誘導(dǎo)后的心肌樣細(xì)胞具備一定的心肌細(xì)胞的典型性特征結(jié)構(gòu)和一些功能活動(dòng)。

心肌細(xì)胞凍融液法：其制備方式與制備心肌細(xì)胞裂解液的方式相似，其作用都是去模擬一個(gè)適合心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境。關(guān)于心肌細(xì)胞凍融液法也有很多相關(guān)研究。屈佳等[39]通過心肌細(xì)胞凍融液在體外模擬心肌微環(huán)境時(shí)發(fā)現(xiàn)，用此種方法可以高效率地將BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，在心肌細(xì)胞凍融液環(huán)境中培養(yǎng)的BMSCs生長(zhǎng)旺盛。除此之外，還包括心肌細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)法，這3種方法均可提高BMSCs的誘導(dǎo)效率。但在誘導(dǎo)過程中，細(xì)胞密度、血清濃度等都會(huì)影響誘導(dǎo)的結(jié)果。

間接接觸共培養(yǎng)主要是利用Transwell小室，通過兩種細(xì)胞不接觸的方式模擬心肌微環(huán)境，從而影響心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。Haneef等[40]在研究中增加了心肌細(xì)胞共培養(yǎng)組。結(jié)果證實(shí)，在白介素-7轉(zhuǎn)染的BMSCs和心肌細(xì)胞共培養(yǎng)組中，誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞數(shù)量顯著增加。Li等[41]通過將Nkx2.5或GATA-4外源基因轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，并增加心肌外環(huán)境共同培養(yǎng)，證實(shí)該方法可提高BMSCs向心肌細(xì)胞分化的效率。

與直接接觸培養(yǎng)相比較，間接接觸培養(yǎng)可以規(guī)避直接接觸后不確定因素的影響，但是同樣存在不足，即不能直接接觸可能會(huì)導(dǎo)致缺少細(xì)胞間的牽拉等一些物理因素的影響，總之主要的誘導(dǎo)機(jī)制仍需進(jìn)一步的探討和研究[42-44]。

3.3 物理因素

心臟是在一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境中通過自身的動(dòng)力維持全身血液的正常運(yùn)行，其外部環(huán)境包括化學(xué)、力學(xué)、電學(xué)等3種因素。

力學(xué)因素：主要是機(jī)械刺激，基于生物學(xué)基礎(chǔ)和Frank-Starling機(jī)制，心肌細(xì)胞收縮力增加時(shí)，舒張期的心肌纖維的拉伸力也會(huì)隨之增加[45]。心肌細(xì)胞在收縮的時(shí)候能夠產(chǎn)生一定的血流動(dòng)力學(xué)作用，從而促進(jìn)心臟的發(fā)育，并且能夠誘導(dǎo)心肌相關(guān)的基因表達(dá)分化，所以機(jī)械刺激可以加快心肌細(xì)胞成熟。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)細(xì)胞施加牽張力或流動(dòng)剪切應(yīng)力，可以提高心肌細(xì)胞的成熟[46]。力學(xué)生物學(xué)概念提出后，很多學(xué)者對(duì)心肌細(xì)胞增殖分化和力的關(guān)系進(jìn)行了研究。盡管相關(guān)研究并不多，但是早在1990年，Komuro等[47]研究發(fā)現(xiàn)力學(xué)拉伸確實(shí)對(duì)心肌有增強(qiáng)作用。此外，Wang等[48]在2000年的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，周期力學(xué)可以增強(qiáng)心肌方面蛋白的表達(dá)如Cx43。同年，Ruwhof等[49]發(fā)現(xiàn)力學(xué)刺激能夠使心肌及心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生生物因子。Huang等[50]應(yīng)用了流體剪切應(yīng)力(FSS)通過流動(dòng)腔中的培養(yǎng)液循環(huán)流動(dòng)對(duì)MSCs施加剪切應(yīng)力，在穩(wěn)定層流條件下，大鼠的BMSCs在剪切應(yīng)力為10 dyne/cm2的時(shí)候表現(xiàn)出最顯著的心肌細(xì)胞定向分化。Huang等[51]還發(fā)現(xiàn)10%牽張應(yīng)力、1 Hz頻率、24 h為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞的最佳條件。充分證實(shí)了不同強(qiáng)度、不同頻率、不同時(shí)間的動(dòng)態(tài)牽張應(yīng)力對(duì)心肌方向相關(guān)基因表達(dá)會(huì)產(chǎn)生不同的作用。牽張應(yīng)力和流動(dòng)剪切應(yīng)力是現(xiàn)在研究中最常見的機(jī)械應(yīng)力。

電學(xué)因素：電脈沖傳導(dǎo)與心臟的節(jié)律性搏動(dòng)有關(guān)，因此電場(chǎng)環(huán)境對(duì)心肌細(xì)胞的形成具有一定的作用。體外電刺激可以對(duì)心肌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)定向的控制。到目前為止，在組織工程中，已經(jīng)開始應(yīng)用電刺激去改善心臟的收縮和導(dǎo)電性能，從而加強(qiáng)干細(xì)胞的增殖分化。Tandon等[52]通過構(gòu)建微型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，使用電刺激培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)人脂肪干細(xì)胞經(jīng)過6 d的電刺激，在2 ms持續(xù)時(shí)間1 Hz、180 μm寬電極、間距200 μm的條件下脂肪來(lái)源的干細(xì)胞表達(dá)更多的Cx43。Radisic等[53]應(yīng)用電脈沖來(lái)刺激增強(qiáng)心肌細(xì)胞的分化，8 d后發(fā)現(xiàn)受刺激的結(jié)構(gòu)顯示出顯著的超微節(jié)后分化水平，并且在某些方面與天然心肌相似。

3.4 其他因素

3.4.1 單體及復(fù)方中藥 為了建立一個(gè)完整的誘導(dǎo)體系，經(jīng)過研究者不斷的探索，除了常見的化學(xué)誘導(dǎo)劑、細(xì)胞因子等外，單體及復(fù)方中藥也在逐漸成為研究者研究的誘導(dǎo)分化劑，如丹酚酸B、黃芪甲苷等。黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ，As-Ⅳ)是中藥黃芪的有效成分之一。有研究發(fā)現(xiàn)，含有As-Ⅳ的黃芪注射液，在心力衰竭治療方面有顯著作用，提示其具有類似強(qiáng)心苷類藥物的正性肌力作用[54]。丹酚酸B(Sla-B)是丹參的有效成分，能夠保護(hù)心肌細(xì)胞，防止心肌損傷[55]。心肌細(xì)胞發(fā)生氧化損傷時(shí)，Sla-B可以起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[56]。人參皂苷Rh2是人參的有效成分之一，對(duì)心血管疾病具有一定的作用[57]。王樂等[58]的研究發(fā)現(xiàn)，在體外，人參皂苷Rh2可顯著增強(qiáng)催產(chǎn)素誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。表皮生長(zhǎng)因子可以激活PI3K/Akt信號(hào)，促進(jìn)BMSCs增殖和遷移[59]，人參皂苷Rh2也可能是通過該信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs增殖的[60]。由于中藥成分復(fù)雜，對(duì)中藥成分的提純具有嚴(yán)格的要求，因此還需要進(jìn)一步探究。

3.4.2 基因轉(zhuǎn)染 病毒載體是基因轉(zhuǎn)染中的重要工具。在構(gòu)建病毒載體時(shí)，為確保安全性，病毒載體必須經(jīng)過改造才能投入應(yīng)用。改造方式就是剔除病毒復(fù)制所需的基因和致病基因，形成的空間再插入所需的目的基因。這樣經(jīng)過改造后的病毒，既可以保留感染性又無(wú)致病性，才能成為介導(dǎo)治療基因進(jìn)入細(xì)胞的良好載體。目前常用的載體有慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒等[61]。這些載體在應(yīng)用中存在一些問題：反轉(zhuǎn)錄病毒載體僅僅感染分裂期的細(xì)胞，而腺病毒載體存在的主要問題是基因組相對(duì)較大，構(gòu)建起來(lái)相對(duì)復(fù)雜，而且治療基因不能長(zhǎng)期表達(dá)，還容易引起免疫反應(yīng)[62]。慢病毒載體主要是以人類免疫缺陷病毒HIV為基礎(chǔ)的載體，可感染大多數(shù)細(xì)胞，并可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)外源基因[63]。

有研究證明通過構(gòu)建過表達(dá)微小RNA-1(miR-1)重組慢病毒表達(dá)載體，BMSCs向心肌細(xì)胞方向分化的效率與質(zhì)粒載體相比明顯增強(qiáng)[64]。李詩(shī)鵬等[62]發(fā)現(xiàn)與腺病毒相比，慢病毒載體介導(dǎo)BMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs時(shí)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和持續(xù)時(shí)間上具有一定優(yōu)勢(shì)。

4 展望

在BMSCs向心肌細(xì)胞方向分化的過程中，有眾多因素影響著分化的效率，本文綜合討論了各種誘導(dǎo)方法，但是缺乏關(guān)于BMSCs在心血管疾病方面應(yīng)用的論述。盡管能夠體外誘導(dǎo)出心肌樣細(xì)胞，但是依然存在很多問題需要進(jìn)一步的探討。隨著研究的深入，在發(fā)現(xiàn)其干細(xì)胞表現(xiàn)的優(yōu)越性的同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了一些問題。第一是關(guān)于BMSCs自身的問題，體外獲取的干細(xì)胞是否是純化的干細(xì)胞，是否是真正意義上的干細(xì)胞，以及體外擴(kuò)增的干細(xì)胞的可控性，包括今后在臨床上應(yīng)用后是否可以監(jiān)控都還有待商榷。第二是關(guān)于誘導(dǎo)方法，誘導(dǎo)劑法是利用率最高的方法，但隨著新的誘導(dǎo)劑的不斷出現(xiàn)，化學(xué)誘導(dǎo)劑是否具有一定的細(xì)胞毒性，是否影響誘導(dǎo)后的心肌細(xì)胞分化效率以及是否存在臨床上應(yīng)用的安全隱患，都是需要考慮的問題。第三是誘導(dǎo)分化后的心肌細(xì)胞是否是真正意義上的心肌細(xì)胞，是否與天然的心肌細(xì)胞的特性一致，除了具有的表型特征外還是否具有心肌細(xì)胞的其他功能。第四是BMSCs向心肌細(xì)胞方向分化的具體機(jī)制需要進(jìn)一步明確。