徐子涵， 李聲燦， 呂紅斌， 張 濤

中南大學(xué)湘雅醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)科，器官損傷衰老與再生醫(yī)學(xué)湖南省重點實驗室，長沙 410008

目前，全民健身運動在我國廣泛開展，各類運動損傷人數(shù)也不斷增加[1]。骨腱界面(bone-tendon interface，BTI)損傷是一類非常常見的運動系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，特別是以肩袖損傷和交叉韌帶損傷為代表的骨腱界面損傷，具有較高的發(fā)病率和致殘率，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。在美國每年有超過27萬例肩袖損傷患者需要手術(shù)修復(fù)，同時，肩袖損傷術(shù)后再撕裂發(fā)生率居高不下，如單純岡上肌腱損傷修復(fù)術(shù)后的再撕裂率約為25%，巨大肩袖損傷修復(fù)術(shù)后的再撕裂率高達75%[3-4],給患者帶來巨大痛苦，甚至使其喪失勞動能力。目前骨腱界面損傷修復(fù)的研究多聚焦于干細胞和生物材料方面，卻忽略了干細胞以及生物材料所處微環(huán)境的作用。作為炎癥反應(yīng)過程中具有遞呈抗原和吞噬作用的重要細胞，巨噬細胞在機體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，迅速匯聚至病灶區(qū)域，參與組織損傷的修復(fù)，被認為是機體損傷修復(fù)局部微環(huán)境調(diào)控的核心[5-7]。本文將結(jié)合骨腱界面的連接類型、巨噬細胞的來源及極化對巨噬細胞在骨腱界面修復(fù)中的作用進行闡述。

1 骨腱界面的連接類型及其修復(fù)

骨腱界面連接存在兩種方式，即纖維軟骨性連接和纖維性連接[8]。

纖維軟骨性連接又稱為直接連接，是肌腱附著于骨時形成空間梯度漸變的連接結(jié)構(gòu)，經(jīng)典的纖維軟骨性骨腱界面由4部分組成：肌腱、未鈣化纖維軟骨、鈣化纖維軟骨和骨。這種結(jié)構(gòu)利于肌肉收縮產(chǎn)生的力在骨與軟組織間有效緩沖傳遞，避免應(yīng)力集中[9]。在鈣化纖維軟骨層與未鈣化纖維軟骨層之間存在一條連續(xù)的分界區(qū)，稱為潮線(tidemark)。相比腱-腱斷裂修復(fù)和骨-骨斷裂修復(fù)，這種涉及到的骨、纖維軟骨、肌腱的多層過渡結(jié)構(gòu)的修復(fù)更為復(fù)雜[10]。另外，該部位血供差且再生能力弱，嚴重創(chuàng)傷后其形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性幾乎不可能恢復(fù)至損傷前水平[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)兔髕骨-髕腱界面損傷后16周再生的纖維軟骨層厚度僅達到正常的50%左右[12-13]，國內(nèi)外學(xué)者的系列研究也證實骨腱界面損傷后纖維軟骨層的再生情況與其損傷修復(fù)質(zhì)量密切相關(guān)[14-15]。因此，明確骨腱界面損傷后纖維軟骨層再生的機制至關(guān)重要。

纖維性連接又稱為間接連接，是肌腱通過Sharpey纖維直接與骨膜連接的方式，沒有纖維軟骨層的介入，一般發(fā)生在長骨骨干位置。這種特殊的連接方式能分散縱向拉力和側(cè)向剪切力，使單個膠原束應(yīng)力最小化[16]。在運動醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，間接連接一般出現(xiàn)在移植物肌腱與骨隧道間[17]。Shen等[18]通過對兔行前交叉韌帶重建術(shù)并采取懸吊式固定探討懸吊固定的骨隧道肌腱愈合模式及骨誘導(dǎo)磷酸鈣陶瓷(osteoinductive calcium phosphate ceramics，OICPC)對修復(fù)愈合的影響。其中對照組未經(jīng)OICPC處理，術(shù)后修復(fù)過程中出現(xiàn)新骨生成，直至12周時部分切片觀察到sharpey纖維，但未見到經(jīng)典四層結(jié)構(gòu)的直接連接方式；而OICPC組在12周時幾乎所有標(biāo)本均存在間接連接，且其中有2個標(biāo)本同時還出現(xiàn)了經(jīng)典四層結(jié)構(gòu)的直接連接方式。

此前，國內(nèi)外已有研究表明，移植物的固定方式、骨的性質(zhì)、骨隧道的長度及半徑等因素均可影響骨隧道內(nèi)骨腱界面的修復(fù)[19-21]，而何種條件下骨腱界面以間接連接方式或直接連接方式修復(fù)，間接連接修復(fù)和直接連接修復(fù)的過程是彼此獨立還是相互轉(zhuǎn)化的，目前還有待進一步的觀察和研究。

2 巨噬細胞的來源及極化

巨噬細胞主要包括由造血干細胞經(jīng)單核細胞分化而來的巨噬細胞和定植于局部組織的定居巨噬細胞(tissue-resident macrophages，trM)[22]。當(dāng)機體未受到侵害時，胚胎源性的組織定居巨噬細胞在組織中不斷進行自我更新并維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。然而，當(dāng)感染和組織損傷造成組織定居巨噬細胞大量消耗時，原有的組織定居巨噬細胞分泌趨化因子、趨化蛋白如白細胞介素-10(IL-10)、細菌脂多糖(LPS)等，活化并募集循環(huán)血液中的單核細胞穿過血管內(nèi)皮參與組織定居巨噬細胞的長期重建[6，23]。募集而來的巨噬細胞具有很強的可塑性，這種可塑性表現(xiàn)在通過改變自身表型和生理特征來改變和適應(yīng)不同微環(huán)境[24-25]，這種形態(tài)和功能隨不同微環(huán)境刺激而顯著改變的過程稱為極化。根據(jù)功能的不同，巨噬細胞主要可分為M1型經(jīng)典活化(classically activated)巨噬細胞和M2型選擇性活化(alternatively activated)巨噬細胞，分泌不同的炎癥因子，包括促炎因子和抗炎因子，而炎癥因子是骨腱界面微環(huán)境至關(guān)重要的組成部分[26-27]。巨噬細胞在干擾素-γ(IFN-γ)、LPS和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等因子刺激下極化成為M1型巨噬細胞，分泌促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ)、活性氧(ROS)、氮中間產(chǎn)物、趨化因子(CXCL9、CXCL10)等，在急性炎癥早期主要發(fā)揮吞噬功能，清理損傷部位內(nèi)環(huán)境，參與Th1免疫應(yīng)答。巨噬細胞在白介素(IL-4、IL-10、IL-13)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等刺激下，可向M2型巨噬細胞極化并分泌一些抗炎因子(TGF-β、IL-4、IL-10)和促血管生成因子[如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)]等，在炎癥反應(yīng)后期參與Th2免疫應(yīng)答，下調(diào)炎癥反應(yīng)，通過促進損傷部位血管再生及組織重建，加快修復(fù)進程[28-29]。損傷修復(fù)過程中，M1、M2型巨噬細胞的相繼出現(xiàn)是巨噬細胞極化的動態(tài)變化過程還是新血源性單核細胞的加入，仍是一個有爭論的話題[30]。

目前，巨噬細胞的極化機制尚未完全明確。近些年研究表明，細胞代謝通路可能是巨噬細胞感知微環(huán)境及形態(tài)功能改變的基礎(chǔ)，巨噬細胞通過與基質(zhì)細胞的雙向溝通，進行糖酵解代謝重編程、調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)的代謝水平，進而改變自身線粒體功能，調(diào)節(jié)巨噬細胞的活化及可塑性[31-32]。目前已知的分子機制包括JAK/STAT信號通路、Notch信號通路、IRF信號通路等，一些研究表明miRNA及l(fā)ncRNA也在極化中起到一定作用[33-36]。

3 巨噬細胞在骨腱界面損傷修復(fù)中的作用

3.1 纖維軟骨性骨腱界面

纖維軟骨性骨腱界面修復(fù)過程大致可分為4個階段：起始的炎癥反應(yīng)期、新生骨形成與纖維軟骨樣結(jié)構(gòu)的再生期、編織骨重塑與再生纖維軟骨層成熟期、最終的重塑期[37]。纖維軟骨層再生經(jīng)歷著炎癥期局部壞死組織降解、再生期干細胞遷移及定向分化、重塑期膠原纖維重排與纖維軟骨細胞成熟等變化。Raggatt等[38]在Fas誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡的轉(zhuǎn)基因小鼠骨折模型中發(fā)現(xiàn)，骨折修復(fù)的啟動需要巨噬細胞的參與，巨噬細胞對骨折修復(fù)具有實質(zhì)性和長期的貢獻。同樣，巨噬細胞在骨腱界面修復(fù)的整個過程中也扮演著重要的角色[18]。在肩袖急性損傷模型中，氯磷酸二鈉脂質(zhì)體局部清除損傷界面巨噬細胞后，可觀察到低強度脈沖超聲對骨腱界面損傷的促修復(fù)作用減弱甚至消失[39]。

3.1.1 起始炎癥反應(yīng)期 纖維軟骨性骨腱界面損傷的急性期以腱止點處肌腱的全部或部分斷裂為主要特征，早期表現(xiàn)為明顯的充血腫脹。修復(fù)開始階段主要表現(xiàn)為骨腱界面炎癥細胞的浸潤，組織定居巨噬細胞分泌趨化因子、促炎因子等，招募并極化更多的血源性單核細胞以及組織定居巨噬細胞至損傷部位。在此階段，主要的巨噬細胞為M1型巨噬細胞。M1型巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α等炎癥反應(yīng)初期啟動因子，誘發(fā)IL-1β、IL-6、IFN-γ和其他炎癥因子的釋放，激活免疫反應(yīng)，可以有效清除細胞碎片及壞死細胞，防御病原體感染。但是，如果巨噬細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)沒有在適當(dāng)?shù)臅r期終止，可能會導(dǎo)致組織的損傷，往往預(yù)示著不良結(jié)局，比如組織纖維性愈合，與周圍組織發(fā)生粘連，限制肌腱的滑動。有研究表明，骨腱界面損傷后早期制動至關(guān)重要，可避免因肢體活動導(dǎo)致組織的進一步損傷及炎癥期的延長，促進愈合，但其機制是單純加快炎癥性巨噬細胞的消退還是減少了組織細胞的凋亡壞死，目前尚無定論[40-41]。

3.1.2 新生骨形成與纖維軟骨樣結(jié)構(gòu)的再生期 在纖維軟骨再生期，損傷的骨腱界面出現(xiàn)新生骨和纖維軟骨樣結(jié)構(gòu)。新生骨組織與正常骨組織相比，骨髓腔小而多，骨髓腔內(nèi)骨細胞數(shù)量較多，無軟骨細胞和膠原纖維。新生纖維軟骨樣結(jié)構(gòu)與正常纖維軟骨相比，膠原纖維束交錯排列，軟骨細胞小而少，分布于纖維束之間。巨噬細胞在該階段的極化混雜，有M1和M2兩種，通過釋放細胞因子調(diào)節(jié)成纖維細胞、成骨細胞、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)等細胞的募集、增殖與分化，為骨腱界面的修復(fù)提供“材料”[42]。M1型巨噬細胞在清理壞死組織細胞的同時，也被認為參與組織修復(fù)，其主要作用是招募干細胞、促進干細胞遷移至損傷部位。M2型巨噬細胞則促進干細胞存活、定向成骨分化[43]。有研究表明，巨噬細胞分泌的這些細胞因子中TGF-β在骨腱界面修復(fù)中起著重要調(diào)節(jié)作用[44]。TGF-β可促進成纖維細胞以及成骨細胞的募集和增殖，而成纖維細胞產(chǎn)生的新膠原蛋白基質(zhì)有利于損傷部位及周圍軟組織對VEGF的附著[45]，VEGF可通過促進血管內(nèi)皮細胞增殖，為纖維軟骨層再生提供營養(yǎng)基礎(chǔ)，促進骨腱界面損傷處血管的新生。成骨細胞則是構(gòu)成新生骨的重要細胞，其通過合成分泌糖蛋白和膠原促進骨基質(zhì)形成，并鈣化基質(zhì)形成骨組織。研究表明，巨噬細胞能夠通過分泌TGF-β招募干細胞至損傷部位[46]，并調(diào)控干細胞的成骨分化能力[47]。巨噬細胞分泌的另外一種細胞因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，對肌腱干細胞(tendon derived stem cells，TDSCs)具有很強的分化誘導(dǎo)活性，BMP-2可誘導(dǎo)TDSCs向成骨、成脂、成軟骨方向分化[48]，從而促進骨腱界面的修復(fù)。近期，Zhang等[49]發(fā)現(xiàn)巨噬細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3，NT-3)可能通過ERK1/2和PI3K/Akt信號通路促進TDSCs的異位骨化(heterotopic ossification，HO)形成和成骨作用。

3.1.3 編織骨重塑與再生纖維軟骨層成熟期 隨著修復(fù)的進展，骨腱愈合界面編織骨逐步成熟，自損傷面向遠端肌腱長入。界面區(qū)域可見大量軟骨細胞，并且細胞沿著骨腱縱軸方向排列，軟骨細胞呈灶狀分散在鈣化灶內(nèi)，最終于兩組織交匯處形成纖維軟骨層[50-51]。該階段巨噬細胞通過分泌一定水平的細胞因子(如IL-1、IL-10及NO等)誘導(dǎo)各類細胞的增殖分化，促進膠原纖維的有序排列，使修復(fù)組織的組成及結(jié)構(gòu)進一步成熟[5，52]。有研究證明IL-1可通過活化谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶促進軟骨基質(zhì)磷灰石沉積，從而促進軟骨基質(zhì)的鈣化，該階段骨長入和鈣化的程度直接影響骨腱修復(fù)后的生物力學(xué)性能[53-54]。骨腱界面未鈣化纖維軟骨層及肌腱區(qū)血供較差，主要依賴骨髓腔內(nèi)血管營養(yǎng)物質(zhì)彌散透過鈣化纖維軟骨層的方式供給營養(yǎng)。有研究認為損傷早期VEGF的高表達有利于血管形成，為修復(fù)部位提供營養(yǎng)成分，促進骨腱愈合；但如果后期VEGF仍高表達，持續(xù)的血管再生可導(dǎo)致疼痛持續(xù)存在而被視為肌腱末端愈合不理想的表現(xiàn)[55]。此外，巨噬細胞代謝產(chǎn)生的NO水平對于骨腱界面的修復(fù)至關(guān)重要，適當(dāng)水平的NO經(jīng)一系列反應(yīng)可使血管平滑肌舒張，保障損傷區(qū)域營養(yǎng)供應(yīng)，同時抑制血小板聚集；但如果NO水平過高，則具有細胞毒性，可導(dǎo)致修復(fù)過程中軟骨細胞的異常凋亡[56]。

3.1.4 最終的重塑期 重塑期骨腱界面巨噬細胞數(shù)量逐漸減少，微環(huán)境細胞因子水平趨于穩(wěn)定。如果某些細胞因子仍高表達，如VEGF，往往預(yù)示著不良結(jié)局。纖維軟骨層作為肌腱與骨的過渡區(qū)，可避免應(yīng)力集中，起到緩沖作用[9]，而纖維軟骨層作為骨腱界面的一種較為特殊的結(jié)構(gòu)，由于血供較差，營養(yǎng)供應(yīng)相對匱乏，該處的修復(fù)注定是一個緩慢而困難的過程，Leung等[57]在對兔髕骨與髕韌帶連接點的研究中發(fā)現(xiàn)，重建術(shù)后24周，再生纖維軟骨層的厚度僅為正常纖維軟骨層厚度的十分之一。有研究表明，此階段骨腱界面的愈合不再依賴于細胞的增殖，而更多地依賴生物力學(xué)刺激等手段來優(yōu)化重塑期骨腱界面結(jié)構(gòu)及功能的修復(fù)[58]。

3.2 纖維性骨腱界面

目前關(guān)于纖維性骨腱界面修復(fù)的研究不多，其修復(fù)過程也沒有明確的分期。下面以自然狀態(tài)下前交叉韌帶重建術(shù)后的骨隧道環(huán)境為背景，對巨噬細胞在纖維性骨腱界面修復(fù)中的作用進行闡述[59]。

在肌腱植入骨隧道后的3～7 d，肌腱與隧道之間滲透著疏松的維管組織，周圍環(huán)境以成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞浸潤的炎癥反應(yīng)為特征。Hays等[60]在大鼠前交叉韌帶損傷模型中，通過術(shù)前及術(shù)后靜脈注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)能夠有效提高前交叉韌帶重建術(shù)后早期骨腱界面的愈合質(zhì)量，其中可能的機制是與巨噬細胞分泌的TGF-β減少有關(guān)。但是，另有研究證實巨噬細胞通過分泌TGF-β能夠募集干細胞至損傷部位[46]，并調(diào)控干細胞的成骨分化能力[47]。所以，巨噬細胞在損傷后早期具體作用機制仍有待于進一步探索。

在術(shù)后1～2周，巨噬細胞分泌的各種細胞因子，如VEGF、成纖維細胞生長因子(FGF)和BMPs等，在促進界面成纖維細胞、骨細胞和軟骨細胞分化等方面發(fā)揮著重要作用，使隧道內(nèi)形成新生血管，在骨壁附近稀疏可見新形成的骨小梁[61-62]。

在手術(shù)后約4周，界面的維管組織變得密集且有序，且伴隨Ⅱ型膠原沉積及軟骨樣細胞從骨移入肌腱移植物而逐漸發(fā)生退化。新形成的板層骨和早期的纖維軟骨逐步成長為界面組織。由于新骨的形成，肌腱周圍的骨壁變厚。然而，在這一階段，膠原纖維仍然排列紊亂，肌腱和骨骼之間偶爾可見連接。破骨細胞作為終末分化的組織定居巨噬細胞在長骨的形成和修復(fù)過程中起著重要作用[63-64]。此時，骨隧道中骨腱界面的愈合依賴于骨的向內(nèi)生長，而破骨細胞的過度活動可打破骨吸收與骨生成之間的平衡，擴寬隧道阻礙修復(fù)。Rodeo等[65]發(fā)現(xiàn)，給予抑制破骨細胞生成的骨保護素(osteoprotegerin，OPG)可促進隧道內(nèi)新生骨形成，提高前交叉韌帶重建的穩(wěn)定性。

之后的第6周，膠原纖維變得更加成熟，肌腱和隧道骨骼之間重新建立起連接。在第8周時骨腱界面可見垂直排列的Sharpey纖維，這些纖維由Ⅲ型膠原蛋白構(gòu)成，連接骨與肌腱移植物，被認為是肌腱與骨整合的最早征象[17，66]。類比正常的前交叉韌帶附著部位，直接連接被認為是理想的愈合方式，但愈合方式和愈合時間仍受多種因素影響[59]，如骨腱界面修復(fù)在骨隧道內(nèi)所承受的力學(xué)環(huán)境刺激有別于經(jīng)典修復(fù)模式，骨隧道內(nèi)骨腱界面承受著肌腱的非生理性剪切力，而經(jīng)典修復(fù)模式下骨腱界面承受著肌腱的生理性拉伸力，這可能是產(chǎn)生差異性連接的眾多原因之一[16]。

4 巨噬細胞相關(guān)治療策略的總結(jié)及展望

目前，在其他領(lǐng)域疾病的治療研究中，針對巨噬細胞開發(fā)的治療策略相繼出現(xiàn)。在以巨噬細胞為基礎(chǔ)的治療中，通過注射氧糖剝奪預(yù)處理后的M2樣小膠質(zhì)細胞，可促進腦梗塞恢復(fù)[67]；在以巨噬細胞代謝為基礎(chǔ)的治療中，Jing等[68]通過抑制Fcγ受體介導(dǎo)的巨噬細胞糖酵解過程，可有效減少腎巨噬細胞的激活及促炎因子的分泌，達到治療狼瘡性腎炎的目的[68]；在以巨噬細胞細胞器為基礎(chǔ)的治療中，Mills等[69]發(fā)現(xiàn)魚藤酮通過線粒體解偶聯(lián)和表達替代性氧化酶，可以阻止巨噬細胞線粒體活性氧的產(chǎn)生，保護小鼠免受LPS致死[69]；在以巨噬細胞lncRNA為基礎(chǔ)的治療中，Sun等[70]證實通過靶向巨噬細胞的microRNA-183-5p/ITGB1通路，抑制動脈粥樣硬化進展相關(guān)的lncRNA-RAPIA，可抑制動脈粥樣硬化的進展。

在骨腱界面修復(fù)過程中，巨噬細胞及其細胞因子出現(xiàn)的時空順序及表達水平對骨腱界面的修復(fù)至關(guān)重要[71]。如何在體內(nèi)誘導(dǎo)巨噬細胞定向分化，使其充分發(fā)揮促進修復(fù)的作用，避免不良結(jié)局，是巨噬細胞在骨腱界面損傷發(fā)揮臨床療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。