王海堅(jiān)，林建萍，鄭霜，邵偉，李超，童郁，戴顯寧

（溫州市人民醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

每年約有65萬人死于乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染所致的終末期肝臟疾病[1]。目前己發(fā)現(xiàn)的 HBV 有 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J 10 種基因型，中國(guó)以B和C基因型常見[2]，HBV基因型與疾病進(jìn)展、治療和預(yù)后密切相關(guān)[3]。

通常情況下，乙肝表面抗體（Hepatitis B surface antibody，HBsAb）會(huì)在機(jī)體清除乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）6 周-6 個(gè)月出現(xiàn)，是機(jī)體對(duì)抗HBV產(chǎn)生免疫力的標(biāo)志。在臨床實(shí)踐中偶爾會(huì)遇到HBsAb和HBsAg雙陽(yáng)性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其發(fā)生機(jī)制與臨床意義仍有爭(zhēng)論[4]。HBV“a”決定簇內(nèi)的堿基突變已被證實(shí)可顯著改變HBsAg結(jié)構(gòu)和抗原性[5]，從而影響HBsAb與HBsAg的結(jié)合，由野生型刺激產(chǎn)生的抗體對(duì)變異的HBsAg結(jié)合能力削弱，HBsAb無法完全中和體內(nèi)存在的HBsAg，從而產(chǎn)生變異的HBsAg和野生的HBsAb兩者共存的現(xiàn)象[6]。本文通過對(duì)HBsAg與HBsAb雙陽(yáng)性樣本的Pre-S1、Pre-S2及S區(qū)進(jìn)行測(cè)序，探索出現(xiàn)HBsAg與HBsAb雙陽(yáng)性的血清型模式與HBV S區(qū)與Pre-S1/S2基因突變的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2018年3月-2020年3月HBsAg/HBsAb雙陽(yáng)性慢性乙肝患者64例（雙陽(yáng)組），其中男 38 例，女 26 例，平均（40.6±12.4）歲，選擇同期HBsAg+/HBsAb-的慢性乙肝患者72例（對(duì)照組），其中男 42 例，女 30 例，平均（38.5±9.9）歲。兩組均符合《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，且無合并甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎，并排除由其他原因引起的肝病，如藥物性肝病、自身免疫性肝病、酒精性肝炎等。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過且患者知情同意。

1.2 方法 HBV-DNA采用熒光定量PCR（陜西天隆試劑，最低檢測(cè)線30-100拷貝）檢測(cè)；乙肝病毒Pre-S/S區(qū)擴(kuò)增使用引物及測(cè)序均由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司提供，通過巢氏PCR進(jìn)行擴(kuò)增。 （1）Pre-S1/S2 區(qū)引物： 第一輪：Pre-S1 F2814：GGGTCACCATATTCTTGGG，Pre-S1 R1006：GACCCACAATTCTTTGACAT；擴(kuò)增條件：95℃ 3分鐘，95℃ 15 秒、53℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘 30 個(gè)循環(huán)，72℃10 分鐘。 第二輪：Pre-S2 F2825：TTCTTGGGAACAAGAGCTAC； Pre-S2 R273： TTGAGAGAAGTCCACCACGA。擴(kuò)增條件：95℃3分鐘，95℃15秒、54℃30秒、72℃1分鐘 30個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘。 （2）S區(qū)引物：第一輪：Pre-S1F2818：CACCATATTCTTGGGAACAAG；Pre-S1R1428：GTAAACAAAGGACGTCCCGC；擴(kuò)增條件：95℃ 3 分鐘、95℃ 30 秒、55℃ 30 秒、72℃ 2分鐘30個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘。第二輪：Pre-S2 F56：CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC； Pre-S2 R1113：CTTG TAAGTTGGCGAGAAAGT。擴(kuò)增條件：95℃3分鐘、95℃ 30 秒、58℃30 秒、72℃1 分鐘 30 個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 通過對(duì)HBsAg與HBsAb雙陽(yáng)性樣本的 Pre-S1、Pre-S2及 S區(qū)進(jìn)行測(cè)序，通過（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）進(jìn)行HBV分型，確認(rèn)感染基因型。使用SnapGene4.3.6觀察峰形圖，與對(duì)應(yīng)基因型的參考序列（B 基因型：AF100309.1、D00329.1、KC774377.1、AB602818.1；C 基 因 型 ：AB033556.1、AB014381.1、X04615.1、AF533983.1）進(jìn)行比對(duì)分析，探討出現(xiàn)HBsAg與HBsAb雙陽(yáng)性的血清型模式與HBV S區(qū)、Pre-S1/S2基因突變的關(guān)聯(lián)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用（±s）表示，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的資料采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分率標(biāo)志，并采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血清亞型比較 雙陽(yáng)組、對(duì)照組B基因型的乙型肝炎病毒血清亞型均以adw2亞型為主，C基因型均以adrq+為主。兩組血清亞型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.068、χ2=1.929，P＞0.05）。詳見表 1。

表1 兩組血清亞型比較（n）

2.2 S區(qū)、Pre-S1區(qū)、Pre-S2區(qū)突變率比較 （1）圖1可知，雙陽(yáng)組S區(qū)中最易發(fā)生氨基酸突變的位點(diǎn)為T47、I126、T131，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），兩組 V14、F41、A45、S58、F161、M133、V224 位點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 （2）HBsAg與HBsAb共存可能與 S區(qū) N端（aa1-99）、C端（aa170-226）、“a”決定簇第一環(huán)（aa124-137）堿基突變相關(guān)（P＜0.05 或 P＜0.01）（表 2），且發(fā)現(xiàn)雙陽(yáng)組有7例標(biāo)本發(fā)生無義突變，突變率為10.9%（χ2=6.213，P＜0.05）。Pre-S1 區(qū)、Pre-S2 區(qū)氨基酸突變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但雙陽(yáng)組6例堿基大片段缺失，突變率 10.3%（χ2=5.104，P＜0.05），而對(duì)照組均無此類現(xiàn)象發(fā)生。雙陽(yáng)組的雜合突變率54.4%（35/64）也顯著高于對(duì)照組的 27.8%（20/72），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.186，P＜0.01）。 （3）對(duì)比相同基因型雙陽(yáng)組與對(duì)照組氨基酸序列后發(fā)現(xiàn)，兩組B基因型氨基酸突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表 2），兩組 C 基因型在 N 端、“a”決定簇第一環(huán)、C端差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表3。

表2 兩組S區(qū)、Pre-S1、Pre-S2突變率比較

表3 相同基因型S基因、Pre-S1基因、Pre-S2基因氨基酸殘基突變率比較

圖1 S 區(qū)氨基酸突變率分布圖（*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

乙型肝炎病毒感染是一個(gè)威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題，由于其“易突變”的特性，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于乙肝病毒突變分析越來越重視。

本研究發(fā)現(xiàn)，雙陽(yáng)組和對(duì)照組B基因型和C型基因差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.491，P＞0.05），未發(fā)現(xiàn)A、D、E等其他基因型的存在。有報(bào)道表明，C基因型比B基因型更容易出現(xiàn)肝臟疾病的發(fā)展和惡化，意味著HBV感染后HBsAg與HBsAb雙陽(yáng)性現(xiàn)象的出現(xiàn)使進(jìn)展為終末期肝病的風(fēng)險(xiǎn)提高[8]。

表2 提示，雙陽(yáng)組的 S 區(qū) N 端（aa1-99）、“a”決定簇的第一環(huán)（aa124-137）、C 端（aa170-226）均具有更高的突變率。據(jù)報(bào)道，S區(qū)基因的突變尤其是“a”決定簇的突變導(dǎo)致HBsAg抗原性發(fā)生改變，產(chǎn)生HBsAg與HBsAb共存的現(xiàn)象[9]，但進(jìn)行基因型分組對(duì)比后卻發(fā)現(xiàn)，在B基因型中，雙陽(yáng)組與對(duì)照組無論是在S區(qū)、Pre-S1、Pre-S2區(qū)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而C基因型在N端、“a”決定簇第一環(huán)、C端、Pre-S2區(qū)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Lin等[10]研究表明，HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性組較單純HBsAg陽(yáng)性組有更高的“a”決定簇內(nèi)點(diǎn)突變率，且C基因型具有更高的“a”決定簇突變率，B基因型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這都與本研究結(jié)論相似。此外，免疫應(yīng)答細(xì)胞和抗體通過定位這個(gè)區(qū)域識(shí)別HBsAg，從而對(duì)所有HBV產(chǎn)生抵抗力，這也是目前研究的熱點(diǎn)，其中雙陽(yáng)組每100個(gè)氨基酸殘基突變率最高的便是“a”決定簇第一環(huán)（aa124-137），高達(dá) 5.36（χ2=23.79，P＜0.01），而對(duì)照組各區(qū)每100個(gè)氨基酸殘基突變率普遍在0-2之間，但“a”決定簇第二環(huán)反而無顯著區(qū)別。 因此，可能“a”決定簇第一環(huán)（aa124-137）在維持HBsAg的穩(wěn)定性、空間構(gòu)象及免疫原性扮演著更重要的角色。

Zhu等[11]也同樣從HBsAg與HBsAb雙陽(yáng)性標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)了大片段缺失的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中，雙陽(yáng)組內(nèi)發(fā)現(xiàn)6例Pre-S區(qū)大片段缺失。Pre-S區(qū)由于含有與免疫應(yīng)答有關(guān)的T細(xì)胞、B細(xì)胞的抗原決定簇，缺失可能使宿主發(fā)生免疫逃避，且HBV包膜蛋白與病毒顆粒在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留，形成GGH（毛玻璃樣肝細(xì)胞）[12]，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的活性氧自由基，造成DNA損傷，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，最終發(fā)生肝細(xì)胞癌變，因此，Pre-S區(qū)發(fā)生大片段缺失可能是原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13]。且雙陽(yáng)組內(nèi)發(fā)現(xiàn)7例S區(qū)發(fā)生無義突變，在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。無義突變導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，且由于S區(qū)參與構(gòu)成主蛋白（HBsAg）、表面抗原中蛋白、表面抗原大蛋白，這將導(dǎo)致構(gòu)成HBV外膜的免疫原性與空間構(gòu)象等產(chǎn)生較大改變，造成HBsAb無法完全中和HBsAg而產(chǎn)生雙陽(yáng)性現(xiàn)象。

雙陽(yáng)組的Pre-S/S區(qū)雜合突變率54.4%（35/64）顯著高于對(duì)照組27.8%（20/72），測(cè)序中檢測(cè)到雜合突變峰可能是由于體內(nèi)存在不同的病毒優(yōu)勢(shì)株導(dǎo)致，人群中的HBV感染大多無法根治，少量變異株經(jīng)過長(zhǎng)年累月的復(fù)制，成為感染的優(yōu)勢(shì)株。雖然測(cè)序方法對(duì)于突變株的檢出相對(duì)不敏感，只能檢出含量達(dá)10%的突變株，但實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.104，P＜0.05），說明 HBsAg 和HBsAb雙陽(yáng)性的出現(xiàn)可能與體內(nèi)存在豐富的病毒準(zhǔn)種構(gòu)成有關(guān)。

綜上所述，乙肝病毒Pre-S區(qū)的“a”決定簇第一環(huán)、C端、N端發(fā)生氨基酸突變可能與HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性發(fā)生有關(guān)，且C基因型的突變率較B基因型高，可能與C基因型患者更易發(fā)生終末期肝病有關(guān)。同時(shí)，本文雙陽(yáng)組內(nèi)發(fā)現(xiàn)有S區(qū)無義突變、Pre-S區(qū)大片段堿基缺失、病毒準(zhǔn)種構(gòu)成豐富的現(xiàn)象，符合當(dāng)代學(xué)者對(duì)于產(chǎn)生HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性機(jī)制的猜想，但目前缺乏數(shù)據(jù)證實(shí)，因此，HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性現(xiàn)象更可能由多種原因共同驅(qū)動(dòng)所致。