何嘉樂，葉仕根，趙小然

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連市海珍品疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023）

據(jù)文獻(xiàn)[1]報(bào)道，2018 年全球魚類、甲殼類、軟體類和其他水生動(dòng)物產(chǎn)量約1.79 億t，首次銷售額共計(jì)4 010 億美元，其中價(jià)值2 500 億美元的8 200 萬t 產(chǎn)量出自水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)?？偖a(chǎn)量中1.56 億t供人類消費(fèi)，相當(dāng)于人均每年供應(yīng)20.5 kg。水產(chǎn)養(yǎng)殖占總產(chǎn)量的46%和供人類消費(fèi)的魚類的52%。中國(guó)是水產(chǎn)生產(chǎn)大國(guó)，占2018 年全球魚類產(chǎn)量的35%。2019 年我國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到6 480.36 萬t，水產(chǎn)品人均占有量達(dá)到46.45 kg[2]。隨著水產(chǎn)品消費(fèi)量的提高和養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，由細(xì)菌引發(fā)的水產(chǎn)品安全問題也越發(fā)引起人們的重視。

由弧菌屬病原菌引起的疾病是世界各地海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種的主要流行病，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害最大的細(xì)菌性疾病。其中哈維氏弧菌就是弧菌屬一種常見的病原菌，具有運(yùn)動(dòng)性，廣泛分布于海洋及河口等水生生態(tài)系統(tǒng)。哈維氏弧菌是蝦類最常見且最嚴(yán)重的威脅之一，能引起對(duì)蝦的爛尾病和發(fā)光病等，病蝦胰腺、心臟、淋巴器官壞死，有的外骨骼出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，癥狀嚴(yán)重時(shí)會(huì)大量死亡。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖品種的增多，哈維氏弧菌能感染的宿主范圍也在逐漸擴(kuò)大，除了最常見的對(duì)蝦，還能感染金頭鯛、鱸、大黃魚、大菱鲆、虱目魚等[3-6]，其中不乏名貴的養(yǎng)殖品種，哈維氏弧菌感染引起的疾病給養(yǎng)殖戶造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

生物膜是細(xì)菌黏附在介質(zhì)表面后，以特定方式將代謝分泌的胞外基質(zhì)（如多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等）把細(xì)菌自身包裹其中而組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落。資料顯示，人類和動(dòng)物被微生物感染，至少65%是由穩(wěn)定的細(xì)菌群落——生物膜引起的[6]?，F(xiàn)從哈維氏弧菌生物膜形成過程、理化因素、生物膜調(diào)控機(jī)制、生物膜耐藥性、抑制生物膜形成的新藥物等方面進(jìn)行綜述。

1 生物膜的形成過程

細(xì)菌生物膜的形成會(huì)經(jīng)歷四個(gè)過程：黏附、聚集、成熟、擴(kuò)散。黏附是生物膜形成的初始階段，先決條件是細(xì)菌必須足夠靠近表面，此時(shí)吸引力和排斥力都起作用，最終的黏附力是由黏附因子或細(xì)菌表面的一些附屬結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的，具有特異性和選擇性。在距離表面10~20 nm 的地方，細(xì)菌表面的負(fù)電荷被大多數(shù)環(huán)境表面的負(fù)電荷所排斥，然而這種排斥又可以通過細(xì)菌細(xì)胞和黏附表面之間的范德華力以及使用菌毛和鞭毛提供表面的機(jī)械附著來克服。

當(dāng)生物膜的第一層建立，相同物種或其他物種的細(xì)胞從外環(huán)境中被補(bǔ)充到生物膜中，進(jìn)而使生物膜從一個(gè)薄層生長(zhǎng)成一個(gè)“蘑菇”或“塔”狀的結(jié)構(gòu)。在厚厚的生物膜中，細(xì)菌根據(jù)新陳代謝和空氣耐受性排列[7]。例如，厭氧菌更喜歡生活在更深層次以免暴露在空氣中。隨著細(xì)菌的聚集、增殖以及細(xì)菌間的群體感應(yīng)帶來的調(diào)節(jié)，生物膜趨于成熟，被包埋在生物膜中的細(xì)菌分泌更多的胞外物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸、多糖）從而使生物膜的“支架”形成，最終生成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的成熟生物膜。在此階段，生物膜達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，對(duì)環(huán)境有著最強(qiáng)的抗性[8]。

在生物膜成熟階段之后是擴(kuò)散階段，這也是生物膜生命周期的關(guān)鍵階段。當(dāng)生物膜達(dá)到一定的臨界質(zhì)量時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏、競(jìng)爭(zhēng)的激烈、細(xì)菌數(shù)量增長(zhǎng)過快等多種因素引起了生物膜的擴(kuò)散。這種現(xiàn)象可能是一個(gè)完整的生物膜發(fā)生擴(kuò)散，也可以只是其中一部分發(fā)生擴(kuò)散。當(dāng)穩(wěn)態(tài)生物膜形成時(shí)，最外層的細(xì)菌可以脫離生物膜并變成浮游細(xì)菌，這些浮游細(xì)菌能夠定居在新的介質(zhì)表面上。浮游細(xì)菌的釋放促進(jìn)了新的生物膜在其他介質(zhì)表面其他部位的生成[9]。

2 影響哈維氏弧菌生物膜形成的理化因子

生物膜的發(fā)育與成熟會(huì)受到很多因素的影響，包括生物因素、化學(xué)因素和物理因素，如pH 值、溫度和生物膜黏附介質(zhì)的性質(zhì)等。

2.1 菌液濃度

李海平等[10]和吳同壘等[11]的研究表明，哈維氏弧菌的黏附量與菌液濃度相關(guān)且呈正比關(guān)系。浮游細(xì)菌密度較低時(shí)，初期黏附在基質(zhì)表面的細(xì)菌量較少，當(dāng)菌液濃度升高時(shí)，生物膜形成量較大。因此，細(xì)菌黏附促進(jìn)了生物膜的形成，而細(xì)菌的黏附量會(huì)隨著菌液濃度的升高而增加。

2.2 pH 值

哈維氏弧菌在pH 值為5.5~9.0 時(shí)，均可生成生物膜，pH 值 6.0~7.5 時(shí)，生物膜的形成最明顯，pH值為7 的時(shí)候，生物膜形成量達(dá)到最大，pH 值大于8 或小于6 的時(shí)候，生物膜的生成會(huì)受到抑制，且堿性環(huán)境的抑制效果更為顯著[10]。吳同壘等[11]的研究表明，哈維氏弧菌在pH 值為2~10 時(shí)，都能形成生物膜，而在pH值為8 時(shí)，形成的生物膜量最大，這與李海平等[10]研究結(jié)果一致。

2.3 溫度

當(dāng)溫度為4~15 ℃時(shí)，哈維氏弧菌幾乎不生成生物膜，達(dá)到20 ℃時(shí)開始生成生物膜，30 ℃時(shí)達(dá)到頂峰，隨著溫度升高生物膜的生成量又開始下降[10]。吳同壘等[11]的試驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)果，25~35 ℃時(shí)為哈維氏弧菌形成生物膜的最適溫度。

2.4 滲透壓

w（NaCl）為1%~5%時(shí)，哈維氏弧菌的成膜量逐漸增加，為5%時(shí)達(dá)到最大，大于5%時(shí)成膜量又呈下降的趨勢(shì)，為0 和8%時(shí)幾乎不能形成生物膜[10]。吳同壘等[11]的研究中使用的哈維氏弧菌，在w（NaCl）為 2%~8%時(shí)，均可形成生物膜，為 0 時(shí)，幾乎不能形成生物膜。

3 哈維氏弧菌生物膜形成的調(diào)控機(jī)制

3.1 c-di-GMP

第二信使環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）是一種廣泛保守的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，對(duì)于控制不同細(xì)菌物種的生物膜形成、黏附、運(yùn)動(dòng)性、毒力和細(xì)胞形態(tài)都是十分重要的。c-di-GMP 是由兩個(gè)GTP 分子在腺苷酸環(huán)化酶（DGC）的催化作用下合成的，DGC 酶中的結(jié)構(gòu)域GGDEF 是產(chǎn)生該催化作用的活性中心。c-di-GMP 在PDE 酶（磷酸二酯酶類）的作用下降解，起主要酶活性的是EAL 結(jié)構(gòu)域（或者叫HD-GYP 結(jié)構(gòu)域）[12]。在許多細(xì)菌中，c-di-GMP 通過調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程來實(shí)現(xiàn)游離和靜止兩種生活方式之間的轉(zhuǎn)換。一般來說，細(xì)胞內(nèi)高濃度的c-di-GMP 促進(jìn)EPS（胞外多糖）的產(chǎn)生、生物膜的形成和粗糙度增加，同時(shí)抑制運(yùn)動(dòng)性和毒力基因的表達(dá)[13]。

2002 年，由 Boles 等[14]研究副溶血性弧菌和D’argenio 等[15]研究銅綠假單胞菌時(shí)，首次提出了cdi-GMP 在控制生物膜形成中的作用，當(dāng)時(shí)他們確定了編碼GGDEF 和EAL 結(jié)構(gòu)域蛋白的基因，這些基因在突變或過度表達(dá)時(shí)會(huì)影響生物膜的形成。Tischler 等[16]發(fā)現(xiàn)，在霍亂弧菌中過度表達(dá)分離的GGDEF 結(jié)構(gòu)域會(huì)導(dǎo)致編碼霍亂弧菌胞外多糖（VPS）的vpsA-Q 基因表達(dá)增加，同時(shí)伴隨著c-di-GMP水平的增加，而分離的EAL 結(jié)構(gòu)域的過度表達(dá)則達(dá)到相反的效果。

c-di-GMP 水平的增加往往會(huì)促進(jìn)生物膜的形成或抑制鞭毛的運(yùn)動(dòng)?；【绕渌?xì)菌含有更多的DGC 和PDE，這些豐富的控制c-di-GMP 合成和降解的酶表明了c-di-GMP 信號(hào)在弧菌生物學(xué)中的重要性?；【鷮倨渌【腸-di-GMP 研究與哈維氏弧菌相比較為深入，例如副溶血弧菌和霍亂弧菌的c-di-GMP 受到操縱子 scrABC 和 scrG 的調(diào)控[17]，PilZ 結(jié)構(gòu)域蛋白可以作為c-di-GMP 受體在霍亂弧菌和其他弧菌中調(diào)節(jié)c-di-GMP 依賴的過程[18]等。雖然每種弧菌的調(diào)節(jié)路線各有差別，但弧菌具有相似的調(diào)節(jié)蛋白和信號(hào)系統(tǒng)，對(duì)哈維氏弧菌的c-di-GMP 研究來說也具有很大的參考價(jià)值。

3.2 群體感應(yīng)系統(tǒng)

決定細(xì)菌生物膜形成能力的另一個(gè)重要因素是群體感應(yīng)（quorum sensing, QS）。群體感應(yīng)是細(xì)菌群體通過稱為自動(dòng)誘導(dǎo)因子（AI）的小分子進(jìn)行交流的一個(gè)過程。這種交流過程使細(xì)胞通過改變信號(hào)分子的閾值濃度來改變基因表達(dá)，從而同步協(xié)調(diào)它們?cè)谌后w中的行為。

哈維氏弧菌對(duì)三種不同類型的AI 產(chǎn)生反應(yīng)，這些信息被導(dǎo)入一個(gè)磷鏈級(jí)聯(lián)。第一種AI 是HAI-1，由合酶LuxM 合成的一種酰化高絲氨酸內(nèi)酯[N-（3-hydroxybutyryl）-homoserine lactone]，是哈維氏弧菌特有的信號(hào)分子[19]。第二種是AI-2，由LuxS 合成的一種呋喃糖基硼酸雙酯，因?yàn)槎喾N細(xì)菌都可產(chǎn)生，所以被認(rèn)為是一種全局信號(hào)分子[20]。第三種是CAI-1，由CqsA 產(chǎn)生的一種長(zhǎng)鏈氨基酮[（Z）3-aminoundec-2-en-4-one]（Ea-C8-CAI-1），對(duì)弧菌屬成員具有特異性[21]。這些AI 遵循不同的合成模式，每個(gè)AI 的濃度根據(jù)生長(zhǎng)階段而不同。AI-2 的濃度在指數(shù)生長(zhǎng)期增加，但HAI-1 和CAI-1 只有在指數(shù)生長(zhǎng)期后期才能檢測(cè)到[22]。HAI-1、AI2 和CAI-1被3 種不同的受體感知，分別是雜合組氨酸激酶LuxN、LuxQ（以及周質(zhì)結(jié)合蛋白LuxP）和CqsS。這些膜結(jié)合受體由一個(gè)遞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，包括具有二聚化和組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域（DHp）和一個(gè)催化ATP 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域（CA）。

在低細(xì)胞密度和低AI 濃度時(shí)，受體充當(dāng)激酶，自身磷酸化，隨后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至受體的天冬氨酸鹽中；接著，該磷酰基被轉(zhuǎn)移至組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白LuxU，LuxU 將天冬氨酸殘基上的響應(yīng)調(diào)節(jié)劑LuxO 磷酸化[23]。P-LuxO 被激活，并與 σ 因子一起誘導(dǎo)5 個(gè)小調(diào)節(jié)RNA（Qrr1-5）的轉(zhuǎn)錄。這些sRNA 和RNA 伴侶Hfq 共同作用，最終破壞并降解主要調(diào)控因子luxR 的mRNA，該調(diào)控因子通過將QS 維持在關(guān)閉狀態(tài)來調(diào)節(jié)其QS 表型[24]。在高細(xì)胞密度時(shí)，AI-2 與 LuxP 結(jié)合，LuxQ 作為磷酸酶使 LuxO 去磷酸化[25]。由于LuxO 的失活，下游誘導(dǎo)Qrr1-5 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)被抑制。因此，luxR 的mRNA 保持穩(wěn)定，從而維持著LuxR 的蛋白水平，LuxR 與產(chǎn)生并誘導(dǎo)生物發(fā)光、生物膜形成[26]的基因有關(guān)。LuxR 負(fù)責(zé)在細(xì)胞從低細(xì)胞密度向高細(xì)胞密度轉(zhuǎn)變的過程中重新配置基因表達(dá)，是一個(gè)關(guān)鍵但復(fù)雜的全局調(diào)節(jié)因子。因此，抑制AI-2 系統(tǒng)的化合物對(duì)于控制細(xì)菌毒力和生物膜形成是很重要的。

此外，哈維氏弧菌的QS 級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括5 個(gè)反饋環(huán)[27]。①LuxO 和LuxR 通過與相應(yīng)的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，負(fù)調(diào)控自己的轉(zhuǎn)錄。②LuxR 直接激活sRNA的轉(zhuǎn)錄。③sRNA 反過來通過隔離的方式控制luxO和mRNA。④luxMN 的翻譯受到sRNA（Qrr1-5）的負(fù)調(diào)控。⑤另一個(gè)主要調(diào)控因子AphA 在低細(xì)胞濃度時(shí)被誘導(dǎo)，并誘導(dǎo)Qrr1-5 的表達(dá)。在副溶血弧菌和霍亂弧菌中也存在AphA，且二者高度同源，功能高度相似，在副溶血弧菌和霍亂弧菌中AphA 間接抑制scrABC 和scrG 的表達(dá)是其促進(jìn)c-di-GMP 合成及生物膜形成的機(jī)制之一[28-29]，在此可推測(cè)AphA在哈維氏弧菌中可能有著相似的作用。

4 生物膜與耐藥性

養(yǎng)殖中抗菌藥物的使用使許多病原菌耐藥性的問題日益嚴(yán)重，有研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中分離得到的哈維氏弧菌對(duì)頭孢菌素類以及新型β-內(nèi)酰胺單酰胺環(huán)類的多種抗生素具有耐藥性[30]。從韓國(guó)西海（包括貝類養(yǎng)殖場(chǎng)附近）采集的海水中分離并鑒定了2 株哈維氏弧菌，這兩個(gè)分離株對(duì)先鋒霉素、萬古霉素、氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢替坦和鏈霉素具有耐藥性[31]。此外，有研究者[4]從大黃魚病料中分離得到54 株哈維氏弧菌，所有的分離株均對(duì)硫酸粘桿菌素、慶大霉素、四環(huán)素、氨芐西林、復(fù)方新諾明和阿莫西林6 種抗生素呈現(xiàn)高度耐受，對(duì)多種抗生素的耐藥率都在72.2%以上，耐藥性較為嚴(yán)重。

生物膜的存在使細(xì)菌對(duì)微環(huán)境壓力和抗菌藥物的耐受性均有所增強(qiáng)[32]。有研究表明[33]，成熟生物膜的形成是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵因素之一，抗生素可以殺滅生物膜表面的細(xì)菌，但不能穿透生物膜殺滅其內(nèi)部細(xì)菌，因此抗生素對(duì)生物膜的殺菌效果雖不明顯但可顯著抑制生物膜的擴(kuò)散和細(xì)菌的分裂增殖?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為生物膜的耐藥方式主要有3種[34]，一是生物膜黏附物質(zhì)的屏障作用，二是細(xì)菌生物膜內(nèi)部微環(huán)境的調(diào)節(jié)，三是生物膜中基因表型的改變。除此之外，產(chǎn)生QS 信號(hào)、分泌抗生素水解酶、啟動(dòng)抗生素外泵系統(tǒng)、激活應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)抗機(jī)體免疫防御機(jī)制等因素都在生物膜耐藥性形成中發(fā)揮了一定作用。

5 生物膜抑制

5.1 天然有效成分

天然有效成分在細(xì)菌耐藥性嚴(yán)重的背景下具有重要的作用。Kulwadee 等[35]研究的Gracilaria fisheri 乙醇提取物不僅可以減少哈維氏弧菌生物膜的生物量，而且顯著破壞成熟生物膜的結(jié)構(gòu)，還通過干擾AI-2 顯著抑制哈維氏弧菌的發(fā)光。Jothipandiyan 等[36]發(fā)現(xiàn)芳樟醇和木犀草素在亞抑制濃度下均能抑制生物膜的形成，這兩種化合物可破壞大約60%~70%的成熟生物膜，同時(shí)減少了哈維氏弧菌生物膜基質(zhì)中EPS 的生成，且均能抑制哈維氏弧菌QS 介導(dǎo)的群集運(yùn)動(dòng)和游動(dòng)。Ramesh 等[37]的研究中，十一酸分別與吲哚乙酸和吲哚丁酸聯(lián)合使用可有效阻止哈維氏弧菌的初始附著及微菌落的形成，也可破壞成熟的生物膜并抑制了哈維氏弧菌的生物發(fā)光和群集運(yùn)動(dòng)；此外，實(shí)時(shí)PCR 分析顯示，主調(diào)控子 luxO、luxQ、luxR和luxS 在藥物處理后表達(dá)下調(diào)。Aqawi 等[38]研究發(fā)現(xiàn)大麻酚可抑制哈維氏弧菌QS 調(diào)控的生物發(fā)光和生物膜的形成，在不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物濃度下，大麻酚降低哈維氏弧菌運(yùn)動(dòng)性的效果，呈現(xiàn)出劑量的依賴性。大麻酚增加了LuxO 的表達(dá)和活性，使luxR 的表達(dá)下調(diào)80%；研究也證明了大麻酚干擾了AIs 的傳遞，抑制QS 級(jí)聯(lián)進(jìn)而干擾了哈維氏弧菌生物膜的生成。這些研究表明，還有更多的天然有效成分值得人們?nèi)ヌ剿麝P(guān)注，從而研發(fā)新型生物膜抑制劑和抗菌藥。

5.2 噬菌體

自20 世紀(jì)初以來，噬菌體一直被用來治療細(xì)菌感染，并被證明可以減少細(xì)菌生物膜的形成[39]，例如，噬菌體T4 可以在大腸桿菌生物膜內(nèi)感染和復(fù)制，并通過殺死細(xì)菌細(xì)胞來破壞生物膜的形態(tài)。由于噬菌體具有特異性、高效和不影響共生菌群的優(yōu)點(diǎn)，近年來噬菌體作為一種生態(tài)友好的抗生素替代品用來抵御水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病原體。在對(duì)哈維氏弧菌引起的大菱鲆腹水病的噬菌體治療研究中觀察到兩種噬菌體的混合物可以作為抗生素的替代品，分別含有與宿主細(xì)胞裂解有關(guān)的穿孔素、內(nèi)溶素和裂解酶，兩種噬菌體的混合物比分別單獨(dú)使用都更有效[5]。多噬菌體混合被認(rèn)為是擴(kuò)大噬菌體寄主范圍的有效方法。此外，酶降解EPS 組分是破壞生物膜的另一種有用的策略，關(guān)于攜帶有多糖解聚酶的天然裂解噬菌體的報(bào)道表明，在自然系統(tǒng)中，噬菌體誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解和EPS 的降解相結(jié)合可用來減少細(xì)菌生物膜[5，39]。

6 展望

生物膜是細(xì)菌難以清除、在臨床上引發(fā)慢性及持續(xù)性細(xì)菌感染的重要原因，現(xiàn)如今細(xì)菌耐藥性在全世界日益嚴(yán)重，對(duì)抗菌藥的有效替代品的需求日益增加。無論減少EPS 的生成或促進(jìn)其降解，還是抑制QS 的級(jí)聯(lián)，尋找調(diào)控生物膜關(guān)鍵基因的抑制劑將有望減弱細(xì)菌的抗逆能力，從而降低其致病力。由于生物膜的形成過程復(fù)雜，參與因素較多，所以近年來對(duì)生物膜的研究也更多樣化，每一個(gè)參與生物膜形成的必要因素均可能成為攻克生物膜的突破點(diǎn)。在抗生物膜制劑方面，未來還有更廣闊的研究?jī)?nèi)容等著科研工作者去探索。