陳 娟，曾 楊，杜津昊，毛 婷，季 彬，祁宏山，王治業(yè)*

（1.甘肅省科學院 生物研究所，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

近年規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，產(chǎn)生大量禽畜糞便固體廢棄物[1-2]。畜禽糞便的棄置不僅對生態(tài)環(huán)境造成嚴重威脅，而且造成巨大的資源浪費，成為農(nóng)牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的制約因素[3]。因此，處理畜禽糞便，減少對環(huán)境的污染，具有重要的現(xiàn)實意義[4-5]。畜禽糞便中含有大量的有機質(zhì)、氮、磷、鉀、微量元素等營養(yǎng)成分，通過有益微生物的處理轉(zhuǎn)變成活性有機肥[6-8]，既對畜禽糞便無害化處理，又可以產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益[9-10]。

市場上生物有機肥種類繁多[11]，生物有機肥產(chǎn)品質(zhì)量的關鍵指標是產(chǎn)品的有效活菌數(shù)[12-14]，有效活菌數(shù)不達標等問題導致生物有機肥的質(zhì)量參差不齊[15]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）具有較強的產(chǎn)胞外蛋白酶的能力，而施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）分解脂肪類物質(zhì)以及雜環(huán)物質(zhì)的能力很強[16-19]，因此本試驗以枯草芽孢桿菌和施氏假單胞菌為復合菌種，以新鮮羊糞、玉米秸稈為原料發(fā)酵生產(chǎn)生物有機肥，研究堆肥發(fā)酵過程中原材料配比、初始含水率、復合菌液接種量、翻堆頻率對有效活菌數(shù)的影響，尋求有機肥生產(chǎn)中的最佳發(fā)酵工藝條件和參數(shù)，以期實現(xiàn)環(huán)境效益、經(jīng)濟效益和社會效益最大限度的統(tǒng)一[20-22]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）YJF1、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）YJF3：甘肅省微生物菌種保藏中心。復合菌液：將菌株YJF1、YJF3分別接入已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基500 mL搖瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，然后將YJF1、YJF3菌懸液按照1∶1制成復合菌液。

新鮮羊糞、玉米秸稈：甘肅綠能農(nóng)業(yè)科技股份有限公司。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，水1 000 mL，pH7.4～7.6，瓊脂20.0 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。上述培養(yǎng)基不添加瓊脂即為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SKY-100C恒溫搖床：上海蘇坤實業(yè)有限公司；MJ-150Ⅱ培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；AS型干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；LBH-300T多功能粉碎機：永康科徠爾有限公司。

1.3 方法

1.3.1 以畜禽糞便為基質(zhì)的生物有機肥發(fā)酵工藝流程

新鮮羊糞、玉米秸稈→干燥→粉碎→配料（新鮮羊糞與玉米秸稈按照要求配比、混勻）→增濕（調(diào)節(jié)物料的初始含水率）→堆量（物料堆積成寬1.5 m、高1 m的條形壟）→接種（接入復合菌液）→發(fā)酵（堆體溫度控制在45～65 ℃）→翻堆（從發(fā)酵的第1天開始按照要求頻率進行，直至發(fā)酵結(jié)束）→有效活菌數(shù)檢驗→干燥

1.3.2 以畜禽糞便為基質(zhì)的生物有機肥發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

設置基本發(fā)酵條件為原材料質(zhì)量比（新鮮羊糞∶玉米秸稈=1.0∶1.0），初始含水率為50%，復合菌液（YJF1∶YJF3=1∶1）接種量為15%，翻堆頻率1次/1 d。保持其他因素不變，只改變其中一個因素，分別考察原材料質(zhì)量比（新鮮羊糞∶玉米秸稈=1.0∶2.0、1.0∶1.5、1.0∶1.0、1.5∶1.0、2.0∶1.0），初始含水率（40%、45%、50%、55%、60%），復合菌液接種量（5%、10%、15%、20%、25%），翻堆頻率（1次/1 d、1次/2 d、1次/3 d）對生物有機肥發(fā)酵的影響。

1.3.3 以畜禽糞便為基質(zhì)的生物有機肥發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用4因素3水平正交試驗考察原材料配比（新鮮羊糞∶玉米秸稈）、初始含水率、復合菌液接種量、翻堆頻率對生物有機肥發(fā)酵的影響。正交試驗因素與水平見表1。

表1 生物有機肥發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of bio-organic fertilizer

1.3.4 測定方法

有效活菌數(shù)：按照NY/T 2321—2013《微生物肥料產(chǎn)品檢驗規(guī)程》中的方法進行測定[23]。

生物有機肥產(chǎn)品技術指標：按照NY884—2012《生物有機肥》中的方法測定[24]。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)分析，用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物有機肥發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 原材料質(zhì)量比對生物有機肥發(fā)酵的影響

由表2可知，隨著原材料配比的變化，生物有機肥的有效活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢，當新鮮羊糞與玉米秸稈質(zhì)量比為1.0∶1.5時，生物有機肥的有效活菌數(shù)最高，為0.82×108CFU/g。在發(fā)酵過程中，添加玉米秸稈主要是提供碳源和增加物料的孔隙度使得微生物的營養(yǎng)處于平衡狀態(tài)，最大限度滿足微生物生長的需要。當玉米秸稈比例較高時，堆肥物料孔隙度大，通風時有利于氧氣擴散，可以加快好氧發(fā)酵。因此，選擇新鮮羊糞與玉米秸稈最適質(zhì)量比為1.0∶1.5。

表2 原材料質(zhì)量比對生物有機肥發(fā)酵的影響Table 2 Effect of raw material mass ratio on bio-organic fertilizer fermentation

2.1.2 初始含水率對生物有機肥發(fā)酵的影響

由表3可知，隨著初始含水率的升高，生物有機肥的有效活菌數(shù)呈先上升后略有下降的趨勢，當初始含水率為40%～55%時，隨著初始含水率的升高，生物有機肥中的有效活菌數(shù)也隨之增加；當初始含水率為55%時，生物有機肥有效活菌數(shù)最高，為1.04×108CFU/g；當初始含水率為60%時，生物有機肥有效活菌數(shù)略低于初始含水率為55%的處理?；|(zhì)初始含水率是決定固態(tài)發(fā)酵成敗的關鍵因素之一，微生物生命活動需要不斷從周圍環(huán)境中吸收水分以維持正常的新陳代謝。當含水率過高時，水分取代空氣而占據(jù)了堆料孔隙，不利于微生物的生長繁殖；當含水率較低時，有機物中的營養(yǎng)成分無法充分溶解，阻礙微生物的生長。因此，選擇初始含水率為55%。

表3 初始含水率對生物有機肥發(fā)酵的影響Table 3 Effect of initial water contents on bio-organic fertilizer fermentation

2.1.3 復合菌液接種量對生物有機肥發(fā)酵的影響

由表4可知，隨復合菌液接種量的增加，生物有機肥有效活菌數(shù)逐漸增加；當復合菌液接種量為25%時，有效活菌數(shù)達到最高，為1.31×108CFU/g。當復合菌液接種量為20%、25%時，生物有機肥有效活菌數(shù)相差不大。菌株接種量的多少直接影響到降解蛋白質(zhì)速度的快慢，接種量過少會導致發(fā)酵過程緩慢，降解效果不佳；接種量過高，可能菌體過度生長抑制了蛋白酶的分泌，造成蛋白質(zhì)降解率下降。因此綜合考慮，選擇復合菌液接種量為20%。

表4 復合菌液接種量對生物有機肥發(fā)酵的影響Table 4 Effect of compound bacteria liquid inoculum on bio-organic fertilizer fermentation

2.1.4 翻堆頻率對生物有機肥發(fā)酵的影響

由表5可知，隨翻堆頻率的變化，生物有機肥的有效活菌數(shù)逐漸降低；翻堆頻率為1次/1 d時生物有機肥的有效活菌數(shù)最高，為0.70×108CFU/g。充足的氧氣供應是好氧堆肥的必備條件之一，堆肥系統(tǒng)常用的通風供氧方式有定期翻堆、自然通風和強制通風，其中定期翻堆是目前最經(jīng)濟方便的供氧方式，有利于氧的供給、微生物的分解[25]。因此選擇翻堆頻率為1次/1 d。

表5 翻堆頻率對生物有機肥發(fā)酵的影響Table 5 Effect of turning frequency on bio-organic fertilizer fermentation

2.2 生物有機肥發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

由表6可知，根據(jù)正交試驗的極差R，各因素對生物有機肥有效活菌數(shù)的影響次序為C＞A＞B＞D，即復合菌液接種量＞原材料質(zhì)量比＞初始含水率＞翻堆頻率。生物有機肥發(fā)酵條件最優(yōu)組合為A2B2C3D1，即原材料配比（新鮮羊糞∶玉米秸稈）為1.0∶1.5，初始含水率為55%，復合菌液接種量為25%，翻堆頻率為1次/1 d。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵后的生物有機肥有效活菌數(shù)達到1.94×108CFU/g。

表6 生物有機肥發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of bio-organic fertilizer

2.3 生物有機肥發(fā)酵產(chǎn)品檢測結(jié)果

按最優(yōu)條件生產(chǎn)出生物有機肥產(chǎn)品，按標準取樣進行指標檢測，結(jié)果見表7。

表7 生物有機肥產(chǎn)品的技術指標Table 7 Quality indexes of bio-organic fertilizer product

由表7可知，按最優(yōu)條件生產(chǎn)出的生物有機肥產(chǎn)品各項指標均符合NY 884—2012《生物有機肥》的要求。

3 結(jié)論

以有效活菌數(shù)為考察指標，通過單因素試驗、正交試驗優(yōu)化生物有機肥發(fā)酵條件，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為新鮮羊糞∶玉米秸稈=1.0∶1.5（g∶g），初始含水率為55%，復合菌液接種量為20%、翻堆頻率為1次/d。在最佳發(fā)酵工藝條件下進行堆肥發(fā)酵試驗，生產(chǎn)出生物有機肥產(chǎn)品有效活菌數(shù)達到1.76×108CFU/g、有機質(zhì)含量達到47.4%、水分含量為25%、pH值為7.39、糞大腸菌群數(shù)86個/g、蛔蟲卵死亡率100%，符合NY884—2012《生物有機肥》的技術標準。利用畜禽糞便生產(chǎn)生物有機肥既可有效地解決規(guī)?；B(yǎng)殖場畜禽糞便引起的環(huán)境污染問題，又可提高經(jīng)濟效益，具有廣闊的應用前景。