馬艷蕊，于 紅，初 樂，趙 巖，朱風(fēng)濤，和法濤，范 琳，劉光鵬*

（1.中華全國(guó)供銷合作總社 濟(jì)南果品研究院，山東 濟(jì)南 250200；2.威海職業(yè)學(xué)院 康養(yǎng)學(xué)院，山東 威海 264210）

蘋果具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，富含粗纖維素、多糖、維生素、多酚、人體必需的微量元素等[1-5]，是日常生活中最受人們喜愛的水果之一。隨著蘋果種類的不斷豐富，種植面積的不斷擴(kuò)大，我國(guó)蘋果產(chǎn)量也日漸攀升，2020年全國(guó)蘋果產(chǎn)量達(dá)4 100萬(wàn)t，隨之出現(xiàn)的蘋果精深加工產(chǎn)業(yè)日漸完善，在滿足人們多樣化食用需求的同時(shí)，也逐步實(shí)現(xiàn)了蘋果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6]。

蘋果醋是以鮮蘋果或蘋果汁為原料，經(jīng)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵后得到的一種健康飲品，不僅風(fēng)味優(yōu)良，而且兼有水果和食醋的營(yíng)養(yǎng)和保健效用[7-8]。蘋果醋中富含有機(jī)酸、維生素、氨基酸、果膠、礦物質(zhì)等成分[9-11]，具有改善血液循環(huán)、抵抗病菌侵害、對(duì)抗關(guān)節(jié)炎、延緩衰老、促進(jìn)消化、美容護(hù)膚、防止血壓升高和動(dòng)脈硬化、排除毒素、調(diào)節(jié)鈣質(zhì)代謝等多種保健功效[12-14]。隨著人們對(duì)食品要求的不斷提高，蘋果醋產(chǎn)品日漸受到消費(fèi)者的青睞。

蘋果醋中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)及活性成分含量是決定蘋果醋風(fēng)味的關(guān)鍵，也是決定蘋果醋品質(zhì)的重要因素[15]，在以往的研究中，人們多關(guān)注于發(fā)酵工藝對(duì)蘋果醋風(fēng)味的影響，而殺菌作為蘋果醋生產(chǎn)中的必要環(huán)節(jié)，其對(duì)蘋果醋風(fēng)味的影響研究鮮有報(bào)道。鄧娜娜[16]研究了加熱、超聲波、微波三種殺菌方式對(duì)桑葚醋風(fēng)味的影響，結(jié)果表明微波殺菌后的桑葚醋香氣品質(zhì)最好，但由于微波殺菌成本較高，不適于在果醋加工產(chǎn)業(yè)中廣泛應(yīng)用。熱力殺菌是蘋果醋生產(chǎn)過程中最常用的殺菌方式，主要的熱力殺菌方式有：低溫長(zhǎng)時(shí)（low temperature long time，LTLT）殺菌、高溫短時(shí)（high temperature short time，HTST）殺菌及超高溫瞬時(shí)（ultra high temperature short time，UHTS）殺菌等。LTLT殺菌法也稱為巴氏殺菌，處理溫度通常在100 ℃以下，典型的巴氏殺菌的條件是62.8 ℃、30 min，LTLT殺菌簡(jiǎn)單、方便，殺菌效果達(dá)99%，致病菌完全被殺死，但不能殺死嗜熱、耐熱性細(xì)菌、孢子，以及一些殘存的酶類。HTST殺菌是指100 ℃以上，130 ℃以下的殺菌處理，其加熱時(shí)間短，營(yíng)養(yǎng)成分損失少，處理量大，適于連續(xù)化生產(chǎn)，節(jié)省熱源，成本低。UHTS殺菌是指130～150 ℃持續(xù)時(shí)間幾秒的處理，UHTS殺菌溫度高，殺菌時(shí)間極短，殺菌效果顯著，引起的化學(xué)變化少，但設(shè)備成本較高。不同的加熱方式、加熱溫度、加熱時(shí)間都會(huì)對(duì)蘋果醋的揮發(fā)性香氣成分、營(yíng)養(yǎng)及活性成分含量產(chǎn)生很大影響。本研究擬采用HTST殺菌方式對(duì)蘋果醋原液進(jìn)行殺菌處理，并探究不同殺菌溫度和殺菌時(shí)間下蘋果醋中風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)及活性成分的變化，深入了解HTST殺菌對(duì)蘋果醋品質(zhì)影響，為蘋果醋的殺菌技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)蘋果醋生產(chǎn)中穩(wěn)定品質(zhì)具有實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

新鮮蘋果：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BV818：安琪酵母股份有限公司；弱氧化醋酸桿菌（Acetobacter suboxydans）（滬釀1.01）：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖（分析純）、無水硫酸鎂（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈣、氫氧化鈉、硝酸鋁（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；酵母膏（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸二氫鉀（分析純）：天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；瓊脂（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

醋酸菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1.5%，磷酸二氫鉀0.05%，無水硫酸鎂0.05%，pH自然，121 ℃滅菌20 min后冷卻至室溫，加入體積分?jǐn)?shù)為3%的乙醇。

醋酸菌固體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏1%，碳酸鈣2%，瓊脂2%，pH自然，121 ℃滅菌20 min后冷卻至50 ℃左右，加入體積分?jǐn)?shù)為3%的乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LX-100A高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；ST-20高溫殺菌設(shè)備：上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SWCJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；RS-232恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；BIOF-6010B/S/B/Z微生物發(fā)酵罐：上海高機(jī)生物工程有限公司；6890N-5973N氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS）儀：美國(guó)安捷倫（中國(guó)）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸菌的活化

在無菌條件下，從菌種保藏斜面中挑取一環(huán)醋酸菌菌種，以劃線方式在醋酸菌固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d。從固體平板上挑取活化后的菌種接入50 mL醋酸菌液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)過夜，制成一級(jí)種子液。取15 mL一級(jí)種子液接入300 mL滅菌后的蘋果汁中，置于30 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)過夜，制成二級(jí)種子液。

1.3.2 蘋果醋的制備

將鮮蘋果破碎壓榨過濾取汁，加熱至90 ℃殺菌后灌入發(fā)酵罐中，按0.2‰接種量接入活性干酵母，30 ℃條件下靜置發(fā)酵5～7 d，直至殘?zhí)墙抵?.4%以下，得到蘋果酒。將蘋果酒用硅藻土進(jìn)行過濾，盡量去除酵泥，按10%的接種量接入上步制得的醋酸菌二級(jí)種子液，設(shè)定發(fā)酵罐溫度為30 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為1 200 r/min，通風(fēng)速率為2 L/min發(fā)酵3～4 d，直至發(fā)酵液的酸度不再上升，設(shè)置不同條件進(jìn)行殺菌處理，得到蘋果醋。

1.3.3 殺菌條件的設(shè)計(jì)

如表1所示，設(shè)定五種不同殺菌條件，五種殺菌條件處理后的蘋果原醋均能達(dá)到商業(yè)無菌要求，其中樣品S1為未經(jīng)過殺菌處理的對(duì)照組。

表1 蘋果醋樣品殺菌條件的設(shè)計(jì)Table 1 Design of sterilization conditions for apple vinegar samples

1.3.4 分析檢測(cè)

（1）揮發(fā)性香氣成分的測(cè)定

蘋果醋中揮發(fā)性香氣成分測(cè)定采用GC-MS法。準(zhǔn)確稱取5.00 g果醋置于20 mL樣品瓶中，加入10 μL質(zhì)量濃度為32.88 μg/mL的2-辛醇內(nèi)標(biāo)，加蓋密封，待測(cè)。

GC分析條件：DB-5MS色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He）（純度99.999%）；流速1.660 mL/min，不分流；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持8 min。

MS條件：離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度為280 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，掃描范圍為50～600 m/z。

（2）總酚測(cè)定

采用福林-肖卡法（Folin-Ciocalteu）對(duì)蘋果醋中總酚含量進(jìn)行測(cè)定[17]。

（3）總黃酮測(cè)定

參考范祺等[18]的硝酸鋁顯色法對(duì)蘋果醋中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶解并定容至100 mL，制備成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍分別吸取0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液置于試管中，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇稀釋補(bǔ)充至2.5 mL，漩渦混勻后加入5%的NaNO2溶液0.15 mL，搖勻后靜置6 min，加入10%的Al（NO3）3溶液0.15 mL，漩渦混勻，室溫放置6 min，隨后加入1 mol/L的NaOH溶液2 mL，搖勻，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值，得到以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為：y=0.005 5x-0.003 6（R2=0.999 5），按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

（4）抗壞血酸測(cè)定

參考國(guó)標(biāo)GB 5009.86—2016《食品中抗壞血酸的測(cè)定》中的2,6-二氯靛酚滴定法。

（5）有機(jī)酸測(cè)定

參考國(guó)標(biāo)GB 5009.157—2016《食品中有機(jī)酸的測(cè)定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌條件下蘋果醋中營(yíng)養(yǎng)及活性成分含量的變化

經(jīng)過檢測(cè)分析，六種樣品中的營(yíng)養(yǎng)及活性成分含量測(cè)定結(jié)果見圖1。由圖1A可知，與對(duì)照樣S1相比，殺菌后樣品的總酸含量變化并不顯著（P＞0.05）；由圖1B可知，與對(duì)照樣S1相比，樣品S2和S3總酚含量變化不顯著（P＞0.05），而樣品S4、S5及S6總酚含量顯著降低（P＜0.05）；由圖1C可知，與對(duì)照樣S1相比，樣品S2、S3及S4抗壞血酸含量變化不顯著（P＞0.05），樣品S5抗壞血酸含量顯著降低（P＜0.05），樣品S6抗壞血酸含量極顯著降低（P＜0.01）；由圖1D可知，與對(duì)照樣S1相比，樣品S2和S4總黃酮含量變化不顯著（P＞0.05），而樣品S3、S5及S6總黃酮含量顯著降低（P＜0.05），說明隨著溫度的升高，會(huì)對(duì)酚類物質(zhì)、抗壞血酸和黃酮產(chǎn)生破壞，致使含量下降[19]。由圖1E可知，與對(duì)照樣S1相比，除樣品S5蘋果酸含量顯著增加（P＜0.05），其余樣品蘋果酸含量變化不顯著（P＞0.05）。與對(duì)照樣S1相比，所有樣品檸檬酸含量均有極顯著增加（P＜0.01），可能是由于高溫使得檸檬酸鹽分解。

圖1 不同殺菌條件下蘋果醋中營(yíng)養(yǎng)及活性成分含量的變化Fig.1 Changes of nutrition and active ingredients contents in apple vinegar under different sterilization conditions

總體來說，過高的殺菌溫度會(huì)對(duì)蘋果醋中的營(yíng)養(yǎng)及活性成分含量產(chǎn)生較大影響，較低的殺菌溫度對(duì)蘋果醋中有機(jī)物含量的變化影響較小，結(jié)合圖1中數(shù)據(jù)，100 ℃、30 s條件下殺菌對(duì)蘋果醋中的營(yíng)養(yǎng)及活性成分含量影響較小，為較佳殺菌條件。

2.2 不同殺菌條件下蘋果醋中揮發(fā)性香氣成分的變化

經(jīng)過GC-MS 檢測(cè)，不同殺菌條件下6種樣品中的揮發(fā)性香氣成分含量測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可知，在不同殺菌條件下的6種蘋果醋樣品中共檢測(cè)到50種揮發(fā)性香氣成分，其中有35種共有物質(zhì)。未經(jīng)殺菌處理的蘋果醋樣品S1中共檢測(cè)到38種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類15種，占比65.48%；酸類5種，占比9.96%；醇類8種，占比12.54%；醛類2種，占比0.88%；烴類2種，占比0.19%；酮類1種，占比0.17%；其他類5種，占比10.78%。樣品S2中共檢測(cè)到40種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類16種，占比61.53%，酸類5種，占比10.00%，醇類7種，占比13.83%，醛類2種，占比1.03%，烴類4種，占比1.75%，酮類1種，占比0.19%，其他類5種，占比10.79%。樣品S3中共檢測(cè)到41種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類15種，占比62.22%，酸類5種，占比9.93%，醇類8種，占比13.12%，醛類2種，占比1.58%，烴類2種，占比0.18%，酮類2種，占比0.49%，其他類7種，占比12.27%；樣品S4中共檢測(cè)到39種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類15種，占比61.32%，酸類5種，占比9.83%，醇類7種，占比13.10%，醛類2種，占比1.87%，烴類1種，占比0.09%，酮類2種，占比0.31%，其他類7種，占比12.48%；樣品S5中檢測(cè)到42種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類15種，占比57.91%，酸類5種，占比13.39%，醇類9種，占比13.74%，醛類2種，占比1.97%，烴類3種，占比0.41%，酮類2種，占比0.30%，其他類6種，占比13.48%；樣品S6中共檢測(cè)到46種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類17種，占比56.94%，酸類5種，占比12.69%，醇類11種，占比16.68%，醛類2種，占比2.01%，烴類3種，占比0.43%，酮類2種，占比0.29%，其他類6種，占比10.97%。由此可見，酯、醇、酸類物質(zhì)是蘋果醋中主要的揮發(fā)性香氣成分，其中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、正戊醇、苯乙醇、乙酸、仲丁基醚是對(duì)蘋果醋風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的特征香氣成分。

表2 不同殺菌條件下蘋果醋中揮發(fā)性香氣成分含量檢測(cè)結(jié)果Table 2 Determination results of volatile aroma components in apple cider vinegar under different sterilization conditions mg/L

續(xù)表

續(xù)表

2.2.1 酸、醇、酯類物質(zhì)變化

有機(jī)酸是蘋果醋中主要的呈酸物質(zhì)，包括蘋果酸、乙酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸等，乙酸是主要揮發(fā)性酸[20]，主要是由醋酸桿菌利用乙醇產(chǎn)生的[16]。在本實(shí)驗(yàn)的六個(gè)樣品中均有乙酸檢出，但含量比較少，可能是在發(fā)酵過程中乙酸轉(zhuǎn)化生成了其他的香氣成分[21]。經(jīng)過殺菌處理后大部分樣品中的酸類物質(zhì)有不同程度的上升，總體呈隨殺菌溫度升高而提高的趨勢(shì)，其中，醋樣S2和S3和醋樣S1中的酸類物質(zhì)含量接近。分析其原因可能是在高溫條件下酯類物質(zhì)分解，導(dǎo)致酸類物質(zhì)含量升高。

與對(duì)照醋樣相比，經(jīng)過不同殺菌條件處理后的蘋果醋樣品的醇類物質(zhì)總含量均有所上升，其中正戊醇和苯乙醇含量上升明顯，這可能是由于殺菌過程中的熱能使一些結(jié)合醇中的糖苷健斷裂[22]，或是氨基酸的去氨基及去碳酸基反應(yīng)使樣品中的醇類物質(zhì)含量升高[23]。

酯類物質(zhì)是蘋果醋中檢測(cè)到含量最多的一種化合物，常具有花香或果香，乙酸乙酯是其中含量最高的一種酯，除醋樣S2外，其他殺菌條件下的醋樣中乙酸乙酯含量均有所提升，這與樣品中乙酸含量的高低有直接聯(lián)系。而只有醋樣S2中產(chǎn)生了具有青香、藥草香、漿果香的己酸己酯，只有醋樣S6中產(chǎn)生了苯乙酸乙酯?？傮w來說，經(jīng)過殺菌處理后的蘋果醋樣品中的酯類物質(zhì)總含量與對(duì)照相比均有所下降，原因可能是加熱處理讓酯類物質(zhì)產(chǎn)生了分解反應(yīng)，同時(shí)生成了部分醇類和酸類物質(zhì)[24]。

2.2.2 酮、醛、烴類物質(zhì)變化

酮類物質(zhì)一般呈脂肪味和焦燃味，隨著碳鏈的增長(zhǎng)呈現(xiàn)出強(qiáng)的花香特征，蘋果醋經(jīng)過殺菌后酮類物質(zhì)含量均有所提升，除醋樣S2外，其他殺菌條件下處理的蘋果醋樣品中均檢測(cè)到3,4-二甲基-2-戊酮，具有強(qiáng)烈玫瑰花香氣的大馬士酮的含量也隨著殺菌溫度的升高而提升，可能是由于高溫產(chǎn)生的熱效應(yīng)，增強(qiáng)了分子的活化能，促進(jìn)了氧化反應(yīng)。

與對(duì)照相比，殺菌后樣品中的醛類物質(zhì)含量有明顯的升高。苯甲醛具有苦杏仁味，會(huì)給蘋果醋香氣帶來不利影響，其含量呈隨溫度升高而升高的趨勢(shì)，可能是由于加熱處理后有效激活了糖苷酶的活性，從而水解糖苷類物質(zhì)，使以糖苷類結(jié)合的苯甲醛游離[21]，因此蘋果醋的殺菌溫度不宜設(shè)定過高。

不同的殺菌條件對(duì)蘋果醋中烴類物質(zhì)的含量影響較大，其中只有在醋樣S2中檢測(cè)到α-法尼烯的產(chǎn)生，其具有強(qiáng)烈的花香氣味。

在本實(shí)驗(yàn)各樣品中，酯類物質(zhì)的含量高、種類多；酸類與醇類也是蘋果醋中的主要揮發(fā)性香氣成分，醛類、烴類和酮類的含量較少，這一結(jié)論與前人的研究結(jié)果一致[25-26]。隨著殺菌溫度的升高，酯類物質(zhì)在揮發(fā)性香氣成分中的占比總體呈下降趨勢(shì)，醋樣S1和S2中酯類物質(zhì)含量相對(duì)較高，且其他種類物質(zhì)含量與對(duì)照樣相比變化較小，為較適宜的殺菌條件。

3 結(jié)論

不同的殺菌條件會(huì)對(duì)蘋果醋中營(yíng)養(yǎng)、活性成分和揮發(fā)性香氣成分的變化產(chǎn)生較大影響?？傮w來說，較低的殺菌溫度對(duì)蘋果醋中總酸、總酚、黃酮、抗壞血酸、蘋果酸的含量影響不大，揮發(fā)性香氣成分含量小有浮動(dòng)，隨著殺菌溫度的升高，酯類物質(zhì)的含量明顯下降，而酸類、醇類和醛類物質(zhì)的含量呈上升趨勢(shì)，因此殺菌溫度不宜過高，以免破壞蘋果醋的風(fēng)味體系。結(jié)合對(duì)不同殺菌條件下蘋果醋中營(yíng)養(yǎng)、活性成分和揮發(fā)性香氣成分的分析，得出100 ℃，30 s殺菌條件下蘋果醋中的營(yíng)養(yǎng)、活性成分及揮發(fā)性香氣成分含量相對(duì)其他殺菌條件變化較小，為較佳殺菌條件。

蘋果醋的感官特征是由各種不同的有機(jī)物質(zhì)和揮發(fā)性香氣成分協(xié)調(diào)作用所產(chǎn)生的，六種蘋果醋樣品檢測(cè)出50種風(fēng)味成分，而共有的風(fēng)味成分僅35種，這說明不同的殺菌條件下蘋果醋中的風(fēng)味成分含量會(huì)產(chǎn)生較大變化，進(jìn)而影響蘋果醋的品質(zhì)。因而，殺菌條件對(duì)蘋果醋的影響及其香氣特征需要進(jìn)一步的研究，以便為蘋果醋品質(zhì)的提升及感官評(píng)價(jià)體系的建立提供更加科學(xué)的參考依據(jù)。