鄭若欣，易 嘯，陳 濤，吳小娟，魏勁松，劉小剛

（1.四川國檢檢測(cè)有限責(zé)任公司，四川 瀘州 646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000）

瑪咖（Lepidium meyeniiWalp.）為十字花科獨(dú)行菜屬一年生或兩年生草本植物，原產(chǎn)于高海拔南美安第斯山地區(qū)，我國自20世紀(jì)初引種，在云南、西藏、新疆和四川等地種植，2011年被中國衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新食品原料[1-3]。目前以瑪咖作為原料已經(jīng)開發(fā)生產(chǎn)了47種保健食品，其中與中藥配伍的有27種，同時(shí)還有多項(xiàng)專利對(duì)瑪咖進(jìn)行研究[4]。而瑪咖作為配制酒原料也已得到普遍應(yīng)用?，斂е械幕瘜W(xué)物質(zhì)如氨基酸[5-6]、瑪咖酰胺和瑪咖烯類[7]、芥子油苷和異硫氰酸酯類[8]、生物堿[9]、黃酮[10]等都已有相應(yīng)的研究進(jìn)展?，斂е泻胸S富的皂苷類物質(zhì)，是有效的活性成分之一，作為配制酒中的原材料應(yīng)用愈加廣泛。瑪咖中含有豐富的皂苷類物質(zhì)，是有效的活性成分之一，作為配制酒中的原材料應(yīng)用愈加廣泛。

皂苷類物質(zhì)研究方法多為高效液相色譜法及高效液相色譜質(zhì)譜法[11-20]，但目前針對(duì)瑪咖及其配制酒中總皂苷含量測(cè)定的研究較少，不能有效的表征該類產(chǎn)品中總皂苷的含量水平?，F(xiàn)有的測(cè)定總皂苷標(biāo)準(zhǔn)方法有4項(xiàng)[21-24]，其中保健食品中總皂苷的檢測(cè)方法主要為《保健食品理化及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（2020年版）》，采用Amberlite-XAD-2大孔樹脂（或D-101大孔樹脂）純化樣品總皂苷[23]；普通食品多引用T/AHFIA 004—2018《食品中總皂苷含量的測(cè)定分光光度法》，采用XAD-2大孔樹脂分離純化[24]。比較已有的方法可以看出，總皂苷的純化分離均使用樹脂填充柱，在檢測(cè)過程中由于手工填柱導(dǎo)致可重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度均偏低，操作時(shí)間偏長。因此本實(shí)驗(yàn)擬采用SPEC18柱作為固相萃取方式進(jìn)行瑪咖酒中總皂苷的純化分離，通過方法確認(rèn)來考察該方法的可行性。以期建立一種準(zhǔn)確性、重復(fù)性高，操作性強(qiáng)的瑪咖酒試樣中總皂苷檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑪咖酒（52% vol）：瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司；人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：中國藥品生物制品檢定所；Amberlite-XAD-2大孔樹脂：美國Sigma化學(xué)公司；D101大孔吸附樹脂：成都市科龍化工試劑廠；甲醇（色譜純）：美國Thermo Fisher公司；中性氧化鋁（100～200目）、乙醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸等（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水均為一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3900紫外可見分光光度計(jì)：日本HITACHI公司；MPEva GS平行濃縮儀：睿萊博儀器（廣州）有限公司；CPA225D電子天平：德國賽多利斯公司；SPE-12固相萃取裝置：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；SPEC18柱（500 mg填料，3 mL）：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液溶液配制

稱取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。

1.3.2 最大吸收波長測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別取0、0.05mL、0.075mL、0.100mL、0.150mL、0.175mL、0.200 mL人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，60 ℃氮吹至干。加0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸后于60 ℃水浴中保溫10 min，自來水冷卻后加入5 mL冰乙酸，混勻后以試劑空白為參比，用系列標(biāo)準(zhǔn)溶液全波段掃描確定最大吸收波長后，測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值。以人參皂苷Re質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 大孔樹脂填充柱及SPEC18柱預(yù)處理

大孔樹脂填充柱：取適量Amberlite-XAD-2大孔樹脂和D101大孔吸附樹脂適量于燒杯中，使用無水乙醇浸泡（覆蓋樹脂2.5～5.0 cm），緩慢攪拌樹脂1 min以充分混合，靜置2 h。倒出乙醇，用一級(jí)水沖洗，直至無醇味。然后再用等量的無水乙醇洗滌，充分混合靜置20 min，再用一級(jí)水洗至無醇味，備用。用10 mL玻璃注射器作層析管，分別裝入柱高3 cm預(yù)處理過的D101大孔吸附樹脂和Amberlite-XAD-2大孔樹脂，用一級(jí)水洗至無醇味后，加入柱高1 cm中性氧化鋁。先用25 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗柱，再用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，待上樣。

SPEC18柱：取20 mL一級(jí)水淋洗SPEC18柱，然后用20 mL甲醇進(jìn)行活化，再用20 mL一級(jí)水平衡，待水與柱篩板近平時(shí)上樣。

1.3.4 大孔樹脂填充柱及SPEC18柱分離能力比較

取瑪咖酒試樣20 mL于50 mL蒸發(fā)皿中，60 ℃水浴上揮干，5 mL水溶解后洗脫至10 mL容量瓶中，定容為樣品提取液。

樹脂填充柱分離：取樣品提取液2 mL注入填充柱中保留20 min，先用25 mL水洗柱，控制流速1.5～2.0 mL/min，棄去洗脫液，再用25 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗脫，控制流速1.5～2.0 mL/min，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，60 ℃水浴揮干，測(cè)定（同1.3.2中標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定方法）。

SPEC18柱分離：取樣品提取液2 mL注入預(yù)先處理的SPEC18柱中，保留20 min后控制流速在1滴/s流出，待測(cè)液與柱篩板近平時(shí)加入10 mL水淋洗SPEC18柱，棄去流出液。加入6 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗脫SPEC18柱，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，60 ℃水浴揮干，測(cè)定（同1.3.2中標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定方法）。

1.3.5 檢測(cè)方法優(yōu)化及確認(rèn)

洗脫液濃度對(duì)皂苷含量影響：分別取6組提取液2 mL注入預(yù)先處理的SPEC18柱中，保留20 min后控制流速在1滴/s流出，待測(cè)液與柱篩板近平時(shí)加入10 mL水淋洗SPEC18柱，棄去流出液。分別加入6 mL體積分?jǐn)?shù)為70%、75%、80%、85%、90%、95%的乙醇洗脫SPEC18柱，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，60 ℃水浴揮干，測(cè)定（同1.3.2中標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定方法）。

方法檢出限：參考GB/T 27417—2017《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》中檢出限目視評(píng)價(jià)法[25]。以52% vol的濃香型白酒為空白基質(zhì)添加已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制成5個(gè)質(zhì)量濃度梯度（5.5mg/L、5.0mg/L、4.5mg/L、4.0mg/L、3.0 mg/L）的人參皂苷Re溶液，進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度的平行測(cè)試次數(shù)7次。以正好不能檢出目標(biāo)組分的濃度為參考，將其上一個(gè)正好能被檢出的濃度作為檢出限參考值。計(jì)算該濃度下7組測(cè)定值平均值mˉ及總標(biāo)準(zhǔn)偏差S，檢出限即為mˉ+3S。

方法正確度：以52% vol的濃香型白酒為空白基質(zhì)，配制成人參皂苷Re質(zhì)量濃度分別為5 mg/L、15 mg/L、50 mg/L。分別取上述6組溶液20 mL于水浴鍋60 ℃揮干，5 mL水溶解后洗脫至10 mL容量瓶中定容。取2 mL提取液于已預(yù)處理的SPEC18柱保留20 min后控制流速在1滴/秒流出，待測(cè)液與柱篩板近平時(shí)加入10 mL一級(jí)水淋洗SPEC18柱，棄去流出液。加入6 mL（95%）乙醇洗脫SPEC18柱，收集洗脫液于10 mL比色管中，60 ℃氮吹至干，顯色測(cè)定。以平行試驗(yàn)的均值與加入濃度后測(cè)定值比較。

方法精密度：分別取6組瑪咖酒樣各20 mL，60 ℃水浴揮干，用5 mL水溶解后洗脫至10 mL容量瓶中定容。于SPEC18柱凈化后60 ℃氮吹至干（同正確度實(shí)驗(yàn)方法），顯色測(cè)定。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）（n=6）。

方法加標(biāo)回收率：分別取3組瑪咖酒樣各20 mL，每組加標(biāo)量的質(zhì)量濃度分別為5 mg/L、10 mg/L、25 mg/L，于水浴鍋60 ℃揮干，5 mL水溶解后洗脫至10 mL容量瓶中定容。SPEC18柱凈化后測(cè)定（同正確度實(shí)驗(yàn)方法）。其回收率計(jì)算方式為回收率=（標(biāo)準(zhǔn)加入測(cè)定值-本底值）/標(biāo)準(zhǔn)加入值×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長及標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.3.2方法進(jìn)行試驗(yàn)，通過全波段掃描該方法最大吸收波長為560 nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1可知，以人參皂苷Re質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程A=4.457 2C-0.0.052 0（R2=0.990 1），線性范圍0～0.20 mg/mL。

圖1 人參皂苷Re的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ginsenoside Re

2.2 樹脂填充柱和SPEC18柱測(cè)定結(jié)果比較

按照1.3.4的方法進(jìn)行兩次平行試驗(yàn)，比較不同方式固相萃取純化分離總皂苷的差異，結(jié)果見表1。由表1可知，填充柱測(cè)定值結(jié)果相對(duì)偏小且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大于10%，而SPEC18柱結(jié)果值穩(wěn)定且純化分離結(jié)果較好。同時(shí)在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)填充柱容易出現(xiàn)柱塌陷，流速難以控制，不同批次之間回收結(jié)果差異大。因此選用SPEC18柱作為固相萃取純化柱具有良好的實(shí)用性和高效性。

表1 樹脂填充柱和SPEC18柱總皂苷測(cè)定結(jié)果比較Table 1 Comparison of total saponins determination results between resin packed column and SPEC18 column

2.3 檢測(cè)方法優(yōu)化及確認(rèn)結(jié)果

2.3.1 洗脫液濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

按照洗脫液濃度對(duì)皂苷含量影響的方法進(jìn)行試驗(yàn)，考察乙醇洗脫液濃度對(duì)總皂苷檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，70%～95%乙醇體積分?jǐn)?shù)下總皂苷含量無明顯差異，而在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿水浴揮干和比色管中氮吹兩種方式下，氮吹法更為穩(wěn)定且不需再顯色后再轉(zhuǎn)移，因此選擇體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇作為洗脫劑以達(dá)到快速氮吹至干的目的。

表2 乙醇洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)總皂苷測(cè)定結(jié)果的影響Table 2 Effect of ethanol elution volume fraction on total saponins determination results

2.3.2 方法檢出限

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，空白基質(zhì)質(zhì)量濃度＞5 mg/L以上的陽性檢出率為100%，空白基質(zhì)質(zhì)量濃度＜5 mg/L的陽性檢出率為0%，測(cè)定值平均值為4.07 mg/L，計(jì)算總標(biāo)準(zhǔn)偏差S為0.18，因此檢出限為4.6 mg/L。

2.3.3 方法正確度

方法的正確度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可知，檢出限、中值（1～10倍檢出限）、高值（10倍檢出限）3水平下空白基質(zhì)加標(biāo)后平均值與加標(biāo)濃度比較偏差分別＜20%、＜10%，均在可信任區(qū)間范圍內(nèi)，由此可證明該方法系統(tǒng)誤差較小。

表3 方法正確度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of method accuracy

2.3.4 方法精密度

方法的精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表4。由表4可知，對(duì)總皂苷精密度試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6）為2.24%。試驗(yàn)表明，該方法測(cè)定總皂苷含量具有較好的可重復(fù)性。

表4 方法精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of method precision

2.3.5 方法加標(biāo)回收率

按照回收率方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。試驗(yàn)表明，以瑪咖酒中總皂苷含量（平均值15.60 mg/L）為基礎(chǔ)值，3水平下回收率均在90%～103%之間，滿足GB/T 27417—2017中1～100 mg/kg質(zhì)量濃度下回收率偏差要求90%～110%[12]。該方法測(cè)定總皂苷含量偏倚度小具有較高的準(zhǔn)確性。

表5 方法的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of standard recovery rate of the method

3 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)對(duì)瑪咖酒試樣中總皂苷含量測(cè)定的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，并考察該方法的可行性。結(jié)果表明，瑪咖酒試樣采用SPEC18柱純化，選用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇作為洗脫劑；人參皂苷Re吸光度值與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系（R2=0.990 1），線性范圍0～0.20 mg/mL；方法檢出限為4.6 mg/L；方法正確度的偏差在5 mg/L添加水平＜20%、在15 mg/L及50 mg/L添加水平均＜10%，符合要求；精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.24%；加標(biāo)回收率在90%～103%。建立的瑪咖酒試樣中總皂苷檢測(cè)方法正確度及精密度高，適用于該產(chǎn)品總皂苷含量的測(cè)定。