湯 凱，楊勁松*，楊天澍，譚海生，字學(xué)娟，李 茂

（1.海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；3.海南大學(xué) 林學(xué)院，海南 ?？?570228；4.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種與資源研究所，海南 儋州 571737）

哺乳動(dòng)物在剛出生時(shí)，其胃腸道微生物是一個(gè)極其復(fù)雜的系統(tǒng)，并且在不同物種甚至個(gè)體之間都有極大的不同[1-2]。乳酸菌是一種可發(fā)酵糖類物質(zhì)、以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的細(xì)菌，因其對(duì)人類有潛在的益生作用為人們廣泛研究[3-5]。如今許多研究涉及乳酸菌的益生性，如乳酸菌與宿主腸粘膜相互作用而引起的免疫刺激和調(diào)節(jié)作用，以及提高宿主抗致病性滲透等功能[6-7]。乳酸菌在動(dòng)物胃腸道系統(tǒng)中廣泛存在，并且在維持動(dòng)物健康和生長(zhǎng)方面有重要作用[8]。

海南黑山羊歷史悠久，品質(zhì)優(yōu)良，因其味道鮮美、口味獨(dú)特以及膻味小等特點(diǎn)深受當(dāng)?shù)丶皟蓮V地區(qū)消費(fèi)者的喜愛[9]。黑山羊作為反芻動(dòng)物，體內(nèi)微生物種類豐富，焦金真等[10]研究了瀏陽(yáng)黑山羊胃腸道不同部位微生物數(shù)量的分布特征，結(jié)果表明瘤胃中微生物數(shù)量最多，盲腸、結(jié)腸、直腸居中，回腸次之，十二指腸和空腸最少。袁靜[11]采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳等技術(shù)構(gòu)建黑山羊瘤胃未培養(yǎng)微生物BAC宏基因組文庫(kù)，篩選到了纖維素酶克隆。張萬(wàn)昌等[12]從黑山羊瘤胃液中篩選到3株代表乳酸菌，分別是耐久腸球菌（Enterococcus durans）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。

本研究從海南省澄邁縣黑山羊小腸和直腸中分離、純化乳酸菌，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，并探究其生長(zhǎng)性能、產(chǎn)酸性能，酸、溫度、鹽耐受性能及對(duì)致病菌的抑菌能力，旨在篩選出優(yōu)良的乳酸菌，為黑山羊的養(yǎng)殖提供良好的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料和菌株

黑山羊小腸與直腸：海南省澄邁縣黑山羊養(yǎng)殖場(chǎng)。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

乙酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉（均為分析純）、二甲基亞砜（化學(xué)純）：廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液（固）體培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-17-D超凈工作臺(tái)：蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；PHS-3E型精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；MDF-382E型超低溫冰箱：日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；YM50FGN全自動(dòng)高壓滅菌鍋：上海滬譽(yù)貿(mào)易有限公司；XSP-C204光學(xué)顯微鏡：重慶光電儀器有限公司；SKP-01電熱恒溫培養(yǎng)箱：湖北省黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司；LC-LX-HR185高速冷凍離心機(jī)：桂林市儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

在無菌條件下分別吸取黑山羊小腸與直腸的腸道液，用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，選取10-3、10-4、10-53個(gè)稀釋梯度，各吸取100 μL涂布于含有1.5%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取溶鈣圈明顯且較大的單菌落劃線于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，反復(fù)純化多次，將純化得到的單菌落在-80 ℃保存。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

形態(tài)觀察[13-14]：觀察單菌落的色澤、形態(tài)、大小，并進(jìn)行革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)和過氧化氫酶觸實(shí)驗(yàn)，初步確定菌株是否為疑似乳酸菌菌株。

生理生化實(shí)驗(yàn)[15-19]：對(duì)所篩選的疑似乳酸菌進(jìn)行葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)，以確定菌種種屬的劃分。

分子生物學(xué)鑒定：根據(jù)生理生化結(jié)果和形態(tài)學(xué)特征將菌株進(jìn)行分組，并選取代表菌株送至華大公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行比對(duì)搜索，選擇序列同源性較高的菌株的16S rRNA基因序列，采用MEGA5軟件中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]，分析分離菌株與已知菌株的同源性。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸曲線的測(cè)定

將供試菌種以1%（V/V）的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，每株供試菌做3組平行，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測(cè)定各菌種發(fā)酵液的pH以及OD600nm值[12]，繪制產(chǎn)酸曲線和生長(zhǎng)曲線[21]。

1.3.4 耐受性測(cè)定

將供試菌種以1%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，分別在5 ℃、10 ℃、15 ℃、45 ℃、50 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察生長(zhǎng)狀況。

將供試菌種以1%（V/V）的接種量接種于不同pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和7.0）的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察其生長(zhǎng)狀況。

將供試菌種以1%（V/V）的接種量接入含不同NaCl含量（3.0%、6.5%）的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察其生長(zhǎng)狀況。

1.3.5 抑菌能力的測(cè)定

指示菌株的活化：將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和沙門氏菌分別劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h。然后挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h。將菌體濃度調(diào)整為1×107CFU/mL作為指示菌懸液。

上清液的制備：以1%（V/V）的接種量將乳酸菌種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)12 h，10 000 r/min離心2 min后取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆肹22]。

牛津杯法測(cè)定抑菌性能[4，23-24]：向培養(yǎng)皿中傾注15 mL滅菌后的2%營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，水平靜置凝固后，接種100 μL指示菌菌液，涂布均勻后備用。用鑷子將牛津杯垂直培養(yǎng)基表面均勻放置，牛津杯中加入100 μL乳酸菌上清液，4 ℃擴(kuò)散2 h后37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷菌株抑菌性能。抑菌圈直徑＞7 mm時(shí)，判定為有抑菌作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的形態(tài)特征與生理生化試驗(yàn)結(jié)果

從海南黑山羊小腸和直腸中共分離得到32株有明顯溶鈣圈的菌株，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，H2O2觸酶試驗(yàn)呈陰性，初步確定為乳酸菌。菌株在MRS固體培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)為圓形、中央凸起、表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的白色小菌落。將乳酸菌菌株進(jìn)行一系列生理生化鑒定試驗(yàn)，根據(jù)其形態(tài)特征和生理生化特性將32株菌株分成5類，分別為A類（8株菌）、B類（8株菌）、C類（6株菌）、D類（6株菌）、E類（4株菌），選取A類的代表菌株HCS6-1（細(xì)胞呈短桿狀）、B類的代表菌株HCA6-2（細(xì)胞呈短桿狀）、C類的代表菌株HCA5-3（細(xì)胞呈短桿狀，成對(duì)存在）、D類的代表菌株HCS4-1（細(xì)胞呈橢圓狀）及E類的代表菌株HCS4-3（細(xì)胞呈不規(guī)則的短棒狀）進(jìn)行進(jìn)一步研究。5株代表菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，5株代表菌株均不產(chǎn)氣，明膠液化試驗(yàn)及硝酸鹽還原試驗(yàn)均呈陰性。

表1 5株代表菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiology and biochemistry test results of 5 representative strains

2.2 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

5株代表菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1，由圖1可知，菌株HCS4-1、HCA5-3與發(fā)酵乳桿菌B35（GenBank登錄號(hào)：LC094437.1）聚于一枝，親緣關(guān)系最近，故將這兩株菌株鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。菌株HCS4-3與融合魏斯氏菌F213（GenBank登錄號(hào)：MW035598.1）聚于一枝，親緣關(guān)系最近，因此，將其鑒定為融合魏斯氏菌（Weissella confusa）。菌株HCS6-1、HCA6-2與植物乳桿菌BS16（GenBank登錄號(hào)：JX968493.1）聚于一枝，親緣關(guān)系最近，因此，將其鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖1 基于16S rDNA基因序列5株代表菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 5 representative strains based on 16S rDNA gene sequences

2.3 乳酸菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果

5株代表菌株的生長(zhǎng)曲線見圖2。

圖2 5株代表菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of 5 representative strains

由圖2可知，5株代表菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致，遲滯期為0～4 h，菌株生長(zhǎng)緩慢；4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌種快速生長(zhǎng)；到12 h后，進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)速率減緩；16 h后生長(zhǎng)基本趨于穩(wěn)定，整體趨向“S”型。由圖2亦可知，相比其他菌種，菌株HCA5-3在對(duì)數(shù)期長(zhǎng)勢(shì)較快，菌株HCS6-1在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)較平緩，達(dá)到穩(wěn)定期后，菌株HCA5-3長(zhǎng)勢(shì)最好，菌株HCS6-1長(zhǎng)勢(shì)較差。

2.4 乳酸菌產(chǎn)酸曲線測(cè)定結(jié)果

5株代表菌株的產(chǎn)酸曲線見圖3。

圖3 5株代表菌株的產(chǎn)酸曲線Fig.3 Acid production curve of 5 representative strains

由圖3可知，發(fā)酵2～8 h，5株代表菌株產(chǎn)酸量明顯增加，在14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，產(chǎn)酸效率減小，20 h后產(chǎn)酸量基本保持不變，pH基本保持恒定，整體呈現(xiàn)“S”型。其中菌株HCS4-1較其他菌株產(chǎn)酸速率較快，菌株HCA6-2產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。

2.5 乳酸菌耐受性測(cè)定

5株代表菌株的酸、溫度及鹽耐受性見表2。

表2 5株代表菌株的耐受性Table 2 Tolerance of 5 representative strains

由表2可知，在耐酸試驗(yàn)中，隨著環(huán)境pH值的升高，菌種生長(zhǎng)狀況逐漸變好。當(dāng)pH＜3.0之前，5株代表菌株均不能正常生長(zhǎng)；當(dāng)pH為3.5時(shí)，菌株HCS4-3生長(zhǎng)微弱，其他代表菌株不能正常生長(zhǎng)；當(dāng)pH為4.0時(shí)，菌株HCA6-2不能正常生長(zhǎng)，其他代表菌株均能微弱生長(zhǎng)；當(dāng)pH＞4.0之后，5株代表菌株均生長(zhǎng)較好。在耐溫試驗(yàn)中，所有菌株在5 ℃、50 ℃環(huán)境不能正常生長(zhǎng)，菌株HCA6-2、HCA5-3和HCS4-3在45 ℃時(shí)生長(zhǎng)良好，耐高溫能力較強(qiáng)，菌株HCA6-2、HCS4-3在10 ℃環(huán)境下可以微弱生長(zhǎng)，有較好的耐低溫能力。在耐鹽試驗(yàn)中，所有菌株在3.0% NaCl和6.5% NaCl環(huán)境下長(zhǎng)勢(shì)較好，耐鹽性能優(yōu)良。結(jié)果表明，菌株HCS4-3耐酸性（pH為3.5）較好；菌株HCA6-2、HCA5-3和HCS4-3耐高溫（45 ℃）能力較強(qiáng)，菌株HCA6-2、HCS4-3耐低溫（10 ℃）能力較強(qiáng)；所有菌株耐鹽性能較好。

2.6 乳酸菌抑菌能力的測(cè)定

5株代表菌株對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌能力見表3。

表3 5株代表菌株的抑菌能力Table 3 Antibacterial activity of 5 representative strains

由表3可知，5株代表菌株對(duì)致病菌的抑菌圈直徑均＞13 mm，抑菌效果明顯。其中，菌株HCA6-2對(duì)大腸桿菌的抑菌效果較好，顯著高于其他菌株（P＜0.05），菌株HCA5-3對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌效果較好（P＜0.05），顯著高于其他菌株。

綜上，菌株HCA5-3、HCS4-1、HCA6-2在生長(zhǎng)、產(chǎn)酸、耐受性以及抑菌性能方面表現(xiàn)優(yōu)良，后續(xù)可作為黑山羊飼料添加劑應(yīng)用到青貯飼料以及畜牧養(yǎng)殖中[25]。

3 結(jié)論

本研究從海南省澄邁縣黑山羊小腸與直腸中共分離到32株乳酸菌，根據(jù)菌株形態(tài)及生理生化試驗(yàn)結(jié)果將32株乳酸菌歸為5類，從中選取5株代表菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。經(jīng)鑒定，2株為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），2株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），1株為融合魏斯氏菌（Weissella confusa）。5株代表菌株中，菌株HCA5-3長(zhǎng)勢(shì)較好，菌株HCS4-1產(chǎn)酸速率較快，菌株HCA6-2產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。耐受性試驗(yàn)中，菌株HCS4-3可以在pH 3.5環(huán)境下生長(zhǎng)，耐酸能力較好；菌株HCA6-2、HCA5-3和HCS4-3在45 ℃環(huán)境下生長(zhǎng)良好，耐高溫能力較強(qiáng)，菌株HCA6-2、HCS4-3在10 ℃環(huán)境下可以生長(zhǎng)，耐低溫能力較強(qiáng)；5株菌株在6.5% NaCl環(huán)境下長(zhǎng)勢(shì)基本較好。在抑菌試驗(yàn)中，5株代表菌株對(duì)致病菌均有抑制作用，其中，菌株HCA5-3對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌有較好的抑制作用，菌株HCA6-2對(duì)大腸桿菌有較好的抑菌效果。