王慕華，麻 杰，曹 睿，彭曉光

（山西省生物研究院有限公司，山西 太原 030006）

益生菌是指一類活的微生物，當攝取足夠數(shù)量時，對宿主產(chǎn)生一種或多種特殊且確切的功能性健康益處[1-2]，這與當前通用的聯(lián)合國糧農(nóng)組織（food and agriculture organization of the united nations，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）對益生菌的定義相近[3]。2010年4月，衛(wèi)生部印發(fā)了初版可食用菌種名單，包括雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）在內(nèi)的三個菌屬大類的21種菌種，隨后對名單進行了多次更新及豐富。截止2017年12月，明確可以用于食品的益生菌已有10個屬共計35種。目前，國內(nèi)市場益生菌菌株90%以上被國外公司所壟斷，國內(nèi)主要由江南大學的陳衛(wèi)院士和內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學的張和平老師團隊進行益生菌篩選，篩選菌株大多通過生理生化實驗、16S rDNA測序、全基因測序來進行鑒定，選育的益生菌多屬雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等[4-5]。作為益生菌必須要滿足兩個條件，一是能夠在人體胃腸道內(nèi)存活，具有耐酸、耐膽鹽能力，以及分解膽固醇和抗氧化性等重要的益生功能[6]；二是可以高密度培養(yǎng)，收集大量菌體，益生菌的高密度培養(yǎng)技術(shù)需要優(yōu)化一系列相關(guān)的工藝參數(shù)來對發(fā)酵過程進行嚴格的控制。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）屬于乳桿菌屬，革蘭氏陽性、厭氧或兼性厭氧、最適生長溫度為30～35 ℃，常見于乳品、奶油、肉類、發(fā)酵果蔬中，也存在于人的腸道內(nèi)[7]。研究表明，植物乳桿菌（L.plantarum）具有調(diào)節(jié)腸道菌群、改善乳糖不耐受、提高免疫力、降低膽固醇、降低血壓、清除自由基抗氧化等功效[8-11]。于長青等[12]對兩株植物乳桿菌進行紫外線誘變處理后，得到了2株具有強降膽固醇能力同時性能較穩(wěn)定的突變菌株，膽固醇的降解率分別為48.7%和44.2%。張鳳敏等[13]從發(fā)酵食品中分離出2株能耐受1 mmol/L過氧化氫的植物乳桿菌，試驗顯示細胞濃度為109CFU/mL的L1001完整細胞與無細胞提取物的DPPH自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical，DPPH·）清除率分別為36.2%和37.9%。由于植物乳桿菌（L.plantarum）在調(diào)節(jié)腸道微生物、維護人體健康方面的影響，其在食品發(fā)酵、乳品工業(yè)、醫(yī)療保健等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[14-15]。本研究為獲得性能優(yōu)良的益生菌生產(chǎn)菌株，通過乳酸菌的溶鈣圈篩選，耐酸、耐膽鹽檢測及體外抗氧化和分解膽固醇能力測試進行了菌株的選育；對篩選菌株進行16S rRNA基因測序及生理生化特性鑒定；采用正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，并對發(fā)酵特性研究，實現(xiàn)菌體高密度發(fā)酵，為其在益生菌產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：分離于山西維爾生物乳制品有限公司生牛乳儲藏罐中。

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid polymerase，DNA）聚合酶、T4DNA連接酶、脫氧核糖核酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）、MgCl2、ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker、克隆載體pMD18-T、DNA膠回收試劑盒、DMEGA細菌DNA提取試劑盒：大連Takara公司；牛膽酸鈉（分析純）：北京Solarbio科技有限公司。其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；MRS碳酸鈣培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基中加入20 g/L的碳酸鈣；高膽固醇MRS培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基中加入0.1 g/L的膽固醇及3 g/L的牛膽酸鈉。

1.2 儀器與設(shè)備

BJ-2CD超凈工作臺、YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器、SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；FE28-standard PH計：瑞士梅特勒-托利多公司；MTV-1漩渦振蕩器：杭州奧盛儀器有限公司；H1850R冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Minispin plus高速離心機：德國艾本德股份公司；DK-8D電熱恒溫水浴槽：常州諾基儀器有限公司；UV-1500紫外分光光度計：上海美析儀器有限公司；Masterecycler nexus GX2聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國艾本德股份公司；C-32 厭氧培養(yǎng)盒：日本三菱瓦斯化學株式會社。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌初篩

從山西維爾生物乳制品有限公司生牛乳儲藏罐中收集殘余牛乳于無菌三角瓶中，用滅菌生理鹽水將牛乳樣品稀釋至10-5，取原液、10-1、10-3、10-5各0.1 mL涂布MRS碳酸鈣培養(yǎng)基平板，35 ℃厭氧培養(yǎng)盒培養(yǎng)48 h，挑選溶鈣圈比較大的單菌落，重復劃線分離，挑選單菌落用200 mL/L甘油管-80 ℃保藏備用[16]。

1.3.2 耐酸菌株篩選

將初篩的菌株按活菌數(shù)2×1010CFU/mL的接種量接種于裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，35 ℃靜置培養(yǎng)24 h，6000r/min離心8 min，收集菌體，滅菌生理鹽水洗滌3次，最后懸浮為108CFU/mL的菌懸液。調(diào)滅菌MRS液體培養(yǎng)基pH值為2.5，取10 mL分裝試管。將調(diào)好菌濃度的菌懸液按1%（V/V）的量加入其中，混勻，37 ℃水浴放置。分別于0、2 h取1 mL用生理鹽水做系列10倍稀釋，取10-1、10-3、10-5各0.1 mL涂MRS 瓊脂平板，35 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，進行菌落計數(shù)，計算菌株耐酸生長率，其計算公式如下：

1.3.3 耐膽鹽菌株篩選

分別配制含有0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L牛膽酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基，將各菌株以活菌數(shù)2×1010CFU/mL的接種量依次接入以上培養(yǎng)基中35 ℃、16 h傳代培養(yǎng)馴化，最后再接入MRS液體培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)24 h，6 000 r/mim離心8 min，收集菌體，滅菌生理鹽水洗滌3次，最后懸浮為108CFU/mL的菌懸液，取1 mL用生理鹽水做系列10倍稀釋，取10-1、10-3、10-5各0.1 mL涂布含有3.0 g/L牛膽酸鈉和不含牛膽酸鈉的MRS瓊脂培養(yǎng)基平板，35 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，進行菌落計數(shù)，計算菌株耐膽鹽生長率，其計算公式如下：

1.3.4 抗氧化能力測試

（1）清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基能力的測定

分別取1×108CFU/mL、1×109CFU/mL、1×1010CFU/mL的細胞懸液2 mL，加入1 mL DPPH·溶液（0.2 mmol/L，以無水乙醇溶解），混合均勻，置于室溫下避光反應(yīng)30 min，6 000 r/min離心8 min，取上清，測定樣品在波長517 nm處的吸光度值A(chǔ)i，測3次取平均值。對照組樣品以等體積蒸餾水代替細胞懸液，以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液作參比[17-18]。DPPH·清除率計算公式如下：

式中：A0為對照組吸光度值；Ai為樣品組吸光度值。

（2）清除羥自由基能力的測定

在10 mL具塞試管中依次加入1 mL FeSO4水溶液（5 mmol/L）、1 mL水楊酸-乙醇溶液（5 mmol/L）、1mL H2O2水溶液（3 mmol/L），混合均勻后向上述體系中加入1×108、1×109、1×1010CFU/mL的細胞懸液2 mL，用雙蒸水補齊至刻度，37 ℃水浴15 min，6 000 r/min離心8 min，以雙蒸水作參比，在波長510 nm下測定吸光度A值，吸光度值數(shù)據(jù)平行測定3 次[13]?！H清除率計算公式如下：

式中：A0為對照樣品的吸光度值，Ax為加入待測乳酸菌細胞懸液的吸光度值。

1.3.5 分解膽固醇能力測試

挑選菌株經(jīng)MRS培養(yǎng)基活化后，以活菌數(shù)5×1010CFU/mL的接種量接種于高膽固醇MRS-CHOL培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液6 000 r/min 離心8 min，取上清液，采用鄰苯二甲醛比色法測定膽固醇含量[12，19]。膽固醇分解率計算公式如下：

式中：A0為未接菌對照的吸光度值，A為菌體培養(yǎng)后培養(yǎng)液的吸光度值。

1.3.6 乳酸菌鑒定

乳酸菌的形態(tài)學觀察和生理生化實驗：菌株的生理生化鑒定參照《常見細菌鑒定手冊》和《微生物分類學》，觀察各菌株的形態(tài)特征，并對菌株進行生理生化實驗，對篩選菌株進行初步的分類鑒定[20]。

公司技術(shù)優(yōu)勢明顯，注重研發(fā)投入，致力于為客戶提供技術(shù)領(lǐng)先的系列化產(chǎn)品。2015年至2017年，公司研發(fā)投入從970.51萬元激增至2515.12萬元，增幅達159.15%。2009年以來，上機數(shù)控連續(xù)多次被評為高新技術(shù)企業(yè)，并且擁有市級企業(yè)技術(shù)中心。公司的研發(fā)能力主要體現(xiàn)在強大的整機設(shè)計能力、一流的數(shù)控技術(shù)開發(fā)能力、先進的核心精密部件制造技術(shù)和豐富的新品研發(fā)經(jīng)驗。

分子生物學鑒定：使用OMEGA細菌DNA提取試劑盒對培養(yǎng)菌株進行DNA提取，使用細菌16S rRNA通用引物F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；R 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），純化后的PCR回收產(chǎn)物與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coliDH5α，質(zhì)粒提取后由金唯智公司進行DNA序列的測定。將測得的DNA序列提交到GenBank美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）進行基本局部比對，搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）。應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST程序?qū)π蛄羞M行聚類、應(yīng)用Mega軟件做基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.7 高密度發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

以MRS培養(yǎng)基為種子液，在MRS培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，以磷酸氫二鉀（A），檸檬酸氫二胺（B），乙酸鈉（C），葡萄糖（D）添加量作為影響因素，在MRS原有添加量的基礎(chǔ)上，上下浮動設(shè)定不同的水平，以生物量（OD600nm值）為評價指標設(shè)計正交試驗，20 mL/L接種量，35 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方[21]。

1.3.8 高密度發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

以MRS培養(yǎng)基為種子液，以優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為發(fā)酵液，以接種量（E）、發(fā)酵溫度（F）、起始pH值（G）、溶氧量（H）作為影響因素，在植物乳桿菌常規(guī)培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，上下浮動設(shè)定不同的水平，以生物量（OD600nm值）為評價指標設(shè)計正交試驗，優(yōu)化發(fā)酵條件[22-23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的初篩

使用MRS碳酸鈣培養(yǎng)基，從生牛乳儲罐殘余牛乳中分離出88株乳酸菌，編號為SX1～SX88，其中溶鈣圈較大的乳酸菌菌株，純化后用20%的甘油管保存，進行下一步的篩選，部分菌株的溶鈣圈情況見圖1。

圖1 篩選乳酸菌的溶鈣圈Fig.1 Calcium dissolving circle of screened lactic acid bacteria

2.2 耐酸菌株篩選

作為益生菌菌株，要能夠耐胃酸，才能進一步到達腸道起到益生作用，通常胃液pH值為1.3～1.8，飯后由于食物中和、稀釋，胃內(nèi)pH值會達到3.5，因此通過耐酸實驗，篩選耐酸菌株。88株菌中，在pH 2.5的培養(yǎng)液中處理2 h，稀釋到10-5仍可在MRS 瓊脂平板生長的菌株共12株，其耐酸生長率見表1。

表1 篩選菌株的耐酸生長率Table 1 Acid resistant growth rate of screened strains

由表1可知，篩選到的12株產(chǎn)酸菌株耐酸生長率都在30%以上，其中菌株SX36、SX44、SX68、SX80的耐酸生長率最高，為58.72%～66%.20。因此，選擇耐酸比較好的4株菌SX36、SX44、SX68、SX80進行下一步的實驗。

2.3 耐膽鹽菌株篩選

對其中耐酸比較好的4株菌SX36、SX44、SX68、SX80進行耐膽鹽篩選，4株菌的耐膽鹽生長率見表2。由表2可知，菌株SX36的耐膽鹽生長率為20.56%，菌株SX44、SX68、SX80的耐膽鹽生長率在37.85%～48.72%。因此，選擇耐膽鹽比較好的3株菌SSX44、SX68、SX80進行下一步的實驗。

表2 篩選菌株的耐膽鹽生長率Table 2 Bile salt tolerance growth rate of screened strains

2.4 抗氧化能力測定

對其中耐酸、耐膽鹽比較好的3株菌SX44、SX68、SX80進行抗氧化能力測定，3株菌的抗氧化能力見圖2。

圖2 篩選菌株對DPPH·（A）及·OH（B）的清除率Fig.2 Scavenging rates of screened strains on DPPH·(A) and·OH (B)

由圖2可知，3株菌在菌體濃度達到1010CFU/mL的情況下，DPPH·清除率可以達到32.7%以上，·OH清除率可以達到73.8%以上，其中菌株SX68的DPPH·清除率為41.3%，·OH清除率為83.0%。提高菌體濃度，DPPH·和·OH的清除率有可能會再提高，考慮到實際應(yīng)用中菌體在體內(nèi)濃度，確定以1010CFU/mL菌體濃度下菌株SX68的抗氧化能力最強。

2.5 分解膽固醇能力測定

對其中耐酸、耐膽鹽比較好的3株菌SX44、SX68、SX80進行分解膽固醇能力測定，3株菌的分解膽固醇能力見圖3。

由圖3可知，菌株SX68的膽固醇分解能力最強，可以達到45.7%，菌株為初篩獲得，如經(jīng)過菌株馴化和誘變選育，分解膽固醇能力可能會進一步加強。綜合上述試驗對篩選到的SX68菌株進行菌種鑒定。

圖3 篩選菌株的膽固醇分解率Fig.3 Cholesterol decomposition rate of screened strains

2.6 菌株SX68的鑒定

2.6.1 形態(tài)學觀察

菌株SX68的菌落及菌體形態(tài)見圖4。由圖4a可知，菌株SX68的菌落直徑約1～3 mm左右，凸起，呈圓形，表面光滑，細密，白色。由圖4b可知，菌株SX68的菌體形態(tài)呈短桿狀、成短鏈，革蘭氏染色為陽性，無芽孢，產(chǎn)酸，兼性厭氧。從菌落及細胞形態(tài)初步判斷菌株SX68為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

圖4 菌株SX68的菌落（a）及菌體（b）形態(tài)Fig.4 Colony (a) and cell (b) morphology of strain SX68

2.6.2 生理生化特性

由表3可知，菌株SX68過氧化氫酶、氧化酶、淀粉水解、明膠液化試驗結(jié)果呈陰性，以及甲基紅實驗結(jié)果呈陽性，進一步驗證了菌株SX68為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

表3 菌株SX68的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain SX68

2.6.3 分子生物學鑒定

菌株SX68的16S rRNA基因測序后在GenBank（NCBI）的16S ribosomal RNA sequences（Bacteria and Archaea）數(shù)據(jù)庫進行BLAST 比對，序列相似性在98.65%以上的菌株有6株，比對結(jié)果見表4。應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST工具尋找相似菌株，并通過BLAST程序?qū)π蛄羞M行聚類、應(yīng)用Mega軟件做基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

表4 菌株SX68的16S rRNA基因序列比對結(jié)果Table 4 16S rRNA gene sequence alignment results of strain SX68

圖5 菌株SX68基于16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain SX68 based on 16S rRNA gene sequence

由表4可知，菌株SX68 與Lactobacillus plantarum模式株JCM 1149序列相似性99.58%，親緣關(guān)系密切。由圖5可知，菌株SX68屬于厚壁菌門（Firmicutes），和植物乳桿菌Zhang-LL、9714等親緣關(guān)系密切，親緣距離差異在0.000 4以內(nèi)。結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特性和16S rRNA 基因序列分析，將菌株SX68鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.7 高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

在MRS培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，以生物量（OD600nm值）為評價指標，以磷酸氫二鉀（A），檸檬酸氫二胺（B），乙酸鈉（C），葡萄糖（D）添加量為影響因素，設(shè)計正交試驗確定菌株SX68的發(fā)酵液配方，正交試驗結(jié)果見表5。

由表5可知，不同因素對菌株高密度培養(yǎng)影響大小依次為：磷酸氫二鉀＞葡萄糖＞檸檬酸氫二胺＞蛋白胨，其最佳添加量為磷酸氫二鉀3.0 g/L，葡萄糖30 g/L，檸檬酸氫二胺4 g/L，蛋白胨10 g/L。確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方組合為A2B2C2D2，即最佳添加量為磷酸氫二鉀3.0 g/L，葡萄糖30 g/L，檸檬酸氫二胺4 g/L，蛋白胨10 g/L。培養(yǎng)基組成為蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，K2HPO43 g/L，檸檬酸氫二胺4 g/L，乙酸鈉5 g/L，葡萄糖30 g/L，吐溫80 1 mL/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，pH 6.4。用此培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵，最高OD600nm值可達14.13，平板活菌計數(shù)，活菌量可達1.5×1012CFU/mL。

表5 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation medium formula optimization

2.8 高密度發(fā)酵條件優(yōu)化

在10 L發(fā)酵罐單因素試驗基礎(chǔ)上，以生物量（OD600nm值）為評價指標，以接種量（E）、發(fā)酵溫度（F）、起始pH值（G）、溶氧量（H）作為影響因素，正交試驗結(jié)果與分析見表6。

表6 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

由表6可知，不同因素對菌株高密度培養(yǎng)影響大小依次為：起始pH值＞發(fā)酵溫度＞接種量＞溶氧量，其最佳發(fā)酵條件組合為E2F2G2H1，即起始pH值6.5，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量20 mL/L，溶氧量＜100 mL/L。確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：起始pH 6.5，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量20 mL/L，溶氧量＜100 mL/L，攪拌轉(zhuǎn)速50 r/min，罐壓0.03 MPa。在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件下，最高OD600nm值可達15.68，活菌數(shù)可達9.6×1012CFU/mL。

3 結(jié)論

本研究篩選到的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SX68，pH 2.5條件下處理2 h耐酸生長率可達60.27%，耐3 g/L膽鹽生長率可達48.72%；在菌體濃度達到1010CFU/mL的情況下，DPPH·清除率可達41.3%，羥自由基清除率可達83.0%，膽固醇分解能力可達45.7%。具有很好的耐酸、耐膽鹽脅迫能力和較強的抗氧化、分解膽固醇益生功效。

菌株SX68優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，檸檬酸氫二胺4 g/L，乙酸鈉5 g/L，葡萄糖30 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，吐溫80 1 mL/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，pH 6.4；優(yōu)化發(fā)酵條件為：起始pH 6.5，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量20 mL/L，溶氧量＜100 mL/L，攪拌轉(zhuǎn)速50 r/min，罐壓0.03 MPa。此優(yōu)化條件下，最高發(fā)酵生物量（OD600nm值）可達15.68，活菌數(shù)可達9.6×1012CFU/mL，較文獻報道的109CFU/mL提高了1 000倍[24-26]，較王秋萍[27]報道的1.92×1012CFU/mL提高了5倍。本研究為菌株SX68用于益生菌生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。