柳楊青， 汪艷芳

（河南省人民醫(yī)院/鄭州大學人民醫(yī)院/河南大學人民醫(yī)院 1編輯部，2內分泌科，河南鄭州450003）

肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）是轉化生長因子β 超家族成員之一，可顯著抑制肌肉增生、肥大［1］。MSTN 除可負向調控骨骼肌質量外，在蛋白質、脂肪和糖代謝調節(jié)中也發(fā)揮重要作用。既往研究表明，2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）及胰島素抵抗人群血清和骨骼肌中MSTN 水平升高［2］；T2DM 小鼠骨骼肌 MSTN 表達增加，接受 MSTN抗體注射后，空腹和餐后血糖水平降低［3］。推測MSTN可影響機體對葡萄糖的攝取和利用，參與胰島素抵抗的發(fā)生。但迄今為止MSTN 參與調節(jié)T2DM胰島素抵抗的分子機制尚不明確。本研究以MSTN基因敲除小鼠為基礎，采用高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素注射構建T2DM 動物模型，探究MSTN基因對T2DM 小鼠胰島素抵抗及骨骼肌胰島素信號通路的影響，現(xiàn)報道如下。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 采用CRISPR/Cas9 技術及高通量電轉受精卵方式構建雜合型MSTN基因敲除（MSTN+/-）小鼠，通過繁育及PCR 鑒定獲得純合型MSTN基因敲除（MSTN-/-）小鼠 12 只，雜合型MSTN基因敲除（MSTN+/-）小鼠 12 只，野生型（wild type，WT）小鼠12只，品系C57BL/6N，6周齡，雄性，由賽業(yè)生物科技有限公司提供。小鼠飼養(yǎng)于河南大學醫(yī)學院動物房［動物實驗許可證號SYXK（豫）2016-0006］，室內溫度22～24 ℃，濕度40%～60%，保持晝夜12 h 節(jié)律，自由進食飲水，適應性飼養(yǎng)1 周。本研究遵循動物倫理和實驗準則。

1.2 主要儀器與試劑 抓力測定儀（上海欣軟）；轉棒式疲勞儀（安徽正華）；血糖儀（江蘇魚躍）；酶標儀（BioTeK）；脫水機、包埋機和病理切片機（武漢俊杰）；光學顯微鏡及成像系統(tǒng)（Nikon）；勻漿儀（Bio-Spec）；脫色搖床和電泳儀（北京六一）。鏈脲佐菌素（Sigma）；胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒（Millipore）；兔抗小鼠胰島素受體（insulin receptor，InsR）、葡萄糖轉運體4（glucose transporter 4，GLUT4）、胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）和蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）抗體（武漢云克?。?；兔抗小鼠磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）抗體（武漢博奧森）；兔抗小鼠p-IRS1、p-PI3K、p-Akt、糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthetase kinase 3β，GSK3β）和p-GSK3β抗體（上海生工）。

2 方法

2.1 動物模型的建立與評價 將12 只WT 小鼠、12只MSTN+/-小鼠、12 只純合型MSTN-/-小鼠各隨機分為 2 組，每組 6 只，分別為：WT 組、MSTN+/-組、MSTN-/-組、WT+DM 組、MSTN+/-+DM 組和MSTN-/-+DM 組，前3 組給予普通飲食6 周，后3 組給予高脂飲食及鏈脲佐菌素腹腔注射6 周誘導T2DM 模型。WT+DM 組、MSTN+/-+DM 組和MSTN-/-+DM 組小鼠給予高脂飲食喂養(yǎng)6 周后，腹腔注射2%鏈脲佐菌素（35 mg/kg），72 h 后禁食6 h，檢測空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）≥16.7 mmol/L 即可認為造模成功。18 只小鼠均造模成功。另外3 組小鼠腹腔注射等劑量檸檬酸緩沖液作為對照。普通飲食：總熱量為3.85 kcal/g，糖類、脂肪、蛋白質分別占70%、10%、20%；高脂飲食：總熱量為5.24 kcal/g，糖類、脂肪、蛋白質分別占20%、60%、20%。

2.2 體重、體長和腹圍的測定 造模前及造模成功后，用電子秤測定小鼠體重，卷尺測定小鼠體長和腹圍。

2.3 抓力和轉棒力竭時間的測定 造模后測定小鼠抓力：將小鼠放置在抓力測定儀的抓具上，踩下腳踏開關，均勻用力向后拉小鼠，直至四肢均脫離抓具，軟件自動記錄抓力峰值。造模后測定小鼠轉棒力竭時間：將小鼠放置在直徑為3 cm 的轉棒式疲勞儀的旋轉桿上，轉速設定為20 r/min，每次同時測定5只小鼠，每個隔室中1 只。小鼠按與轉棒旋轉方向相反的方式奔跑，當進入疲勞狀態(tài)時即從轉棒上跌落。記錄小鼠從轉棒開始旋轉至掉落的時間，最大測定時間為10 min，每次休息20 min。同1 只小鼠連續(xù)測試抓力和力竭時間各3次，計算平均值。

2.4 胰島素抵抗程度的評估 造模后小鼠禁食6 h，取尾靜脈血，用血糖儀測定FPG，用ELISA 試劑盒測定空腹血清胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)Ins）并計算胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）=ln［1（/FPG×FIns）］，穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR）=（FPG×FIns）/22.5，嚴格按試劑盒說明書進行操作。葡萄糖耐量實驗（glucose tolerance test，GTT）和胰島素耐量實驗（insulin tolerance test，ITT）：小鼠分別以2 g/kg葡萄糖灌胃或5 mL/kg胰島素腹腔注射后，于 15、30、60 和 120 min 測取尾靜脈血測血糖，記錄血糖變化曲線并計算曲線下面積［AUC=（15×G0+30×G15+45×G30+90×G60+60×G120）/2］，其中 G0、G15、G30、G60 和 G120 表示空腹及各時點血糖。

2.5 動物處死與取材 以上實驗完成后處死小鼠，迅速解剖出右下肢腓腸肌及腹股溝、附睪、腸系膜白色脂肪組織，吸取表面血液及體液，用電子秤稱濕重，計算腓腸肌比重=右下肢腓腸肌質量/體重，白色脂肪比重=白色脂肪總質量/體重。稱重后將腓腸肌一半保存于液氮中，另一半保存于甲醛固定液中。

2.6 腓腸肌HE 染色 將甲醛固定好的腓腸肌用乙醇和二甲苯脫水后制成蠟塊并切片。依次進行脫蠟、蘇木素染色、脫水、伊紅染色、脫水、透明、封片。光學顯微鏡下采集圖像，ImageJ 軟件分析腓腸肌形態(tài)及細胞橫截面積。

2.7 骨骼肌胰島素信號通路相關蛋白水平的測定 取腓腸肌組織50 mg置于勻漿器，加入蛋白裂解液，反復多次勻漿以確保完全裂解。將勻漿液轉移至離心管中，12 000 r/min離心10 min后留取上清液。BCA 法測蛋白濃度。進行SDS-PAGE，加入樣品，電壓60 V，電泳至溴酚藍到達底部時停止電泳。加入含有甲醇的轉移緩沖液，電壓60 V 轉膜2 h，濕轉法將蛋白轉移至 PVDF 膜。TBST 洗膜 10 min × 3 次。5%脫脂奶粉溶液封閉PVDF 膜1 h。加入TBST 稀釋Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜 10 min × 3 次。加入TBST 稀釋Ⅱ抗，室溫下孵育1 h，TBST 洗膜10 min ×3 次。ECL A、B 液等量混勻后加至 PVDF 膜，暗匣曝光，依次顯影、定影。晾干，掃描膠片。以β-actin 為內參照，采用ImageJ軟件分析目標條帶的吸光度值。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 造模后小鼠體質量、體長、腹圍和體成分的比較

造模前各組小鼠體重、體長和腹圍的差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），見表1。造模后：WT+DM 組小鼠體重、腹圍和腓腸肌比重小于WT 組，白色脂肪比重大于WT 組（P＜0.05）；MSTN-/-組小鼠體重大于WT 組（P＜0.05），體長、腹圍、腓腸肌比重大于WT組、MSTN+/-組（P＜0.05），白色脂肪比重與 WT 組、MSTN+/-組比較差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05）；MSTN-/-+DM 組體重、體長、腹圍和腓腸肌比重大于WT+DM 組 ，白色 脂肪比 重 小于 WT+DM 組（P＜0.05），見表1、2。

表1 造模前后小鼠體重、體長和腹圍的比較Table 1. BM，BL and AC of mice before and after modeling（Mean±SD. n=6）

2 造模后小鼠抓力和轉棒力竭時間的比較

DM 模型后，小鼠的抓力和轉棒力竭時間均小于相應的正常飲食小鼠（P＜0.05）；WT+DM組的抓力和轉棒力竭時間小于WT 組（P＜0.05）；MSTN-/-組抓力大于WT 組（P＜0.05），MSTN-/-+DM 組抓力大于WT+DM組（P＜0.05）。見表3。

3 造模后小鼠胰島素抵抗程度的比較

WT+DM 組 FPG、HOMA-IR、GTT-AUC 和 ITTAUC 高于 WT 組，F(xiàn)Ins 和 ISI 低于 WT 組（P＜0.05）；MSTN-/-組 GTT-AUC 低 于 WT 組 、MSTN+/-組（P＜0.05），ITT-AUC 高于 WT 組和MSTN+/-組（P＜0.05），F(xiàn)PG、FIns、ISI 和 HOMA-IR 與 WT 組和MSTN+/-組比較差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05）；MSTN-/-+DM 組ISI 高于 WT+DM 組（P＜0.05），HOMA-IR、GTT-AUC和ITT-AUC低于WT+DM組（P＜0.05），見圖1、表3。

表3 造模后小鼠抓力、轉棒力竭時間和胰島素抵抗程度的比較Table 3. Gripping force，rotating time and insulin resistance of mice after modeling（Mean±SD. n=6）

4 造模后小鼠腓腸肌細胞形態(tài)的變化及橫截面積的比較

WT 組肌細胞排列規(guī)則，細胞完整，無萎縮、水腫、壞死，WT+DM 組肌細胞排列松散，肌纖維萎縮，邊緣角化，細胞橫截面積明顯小于WT 組（P＜0.05）。WT 組、MSTN+/-組和MSTN-/-組小鼠腓腸肌細胞體積逐漸增大，MSTN-/-組肌細胞排列緊密，邊緣圓潤，細胞間隙明顯縮小，細胞橫截面積明顯大于WT 組（P＜0.05）。MSTN-/-+DM 組腓腸肌細胞橫截面積明顯大于 WT+DM 組（P＜0.05），形 態(tài) 接 近 WT 組 ，見圖2、3。

表2 造模后小鼠體成分的比較Table 2. Body mass composition of the mice after modeling（Mean±SD. n=6）

Figure 1. GTT（A）and ITT（B）of the mice after modeling. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs WT group；#P＜0.05 vs MSTN+/- group；&P＜0.05 vs MSTN-/-group；+P＜0.05 vs WT+DM group；△P＜0.05 vs MSTN+/-+DM group.圖1 造模后小鼠GTT及ITT

Figure 2. HE staining of gastrocnemius tissue in the mice（scale bar=100 μm）.圖2 造模后小鼠腓腸肌HE染色

Figure 3. Cross-sectional area of gastrocnemius fibers in the mice after modeling. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs WT group；#P＜0.05 vs MSTN+/- group；&P＜0.05 vs MSTN-/- group；+P＜0.05 vs WT+DM group；△P＜0.05 vs MSTN+/-+DM group.圖3 造模后小鼠腓腸肌細胞橫截面積的比較

5 造模后小鼠骨骼肌胰島素信號通路相關蛋白水平的比較

WT+DM 組 InsR 和 GLUT4 蛋 白 水 平 及 IRS1、PI3K、Akt 和 GSK3β 磷酸化比例低于 WT 組（P＜0.05）；MSTN-/-組 GLUT4 蛋白水平及 PI3K、Akt 和GSK3β 磷酸化比例高于 WT 組（P＜0.05）；MSTN-/-+DM 組的 InsR 和 GLUT4 蛋白水平及 IRS1、PI3K、Akt和GSK3β 的磷酸化比例高于WT+DM 組（P＜0.05），見圖4。

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因敲除小鼠肌肉質量增加，脂肪質量減少，可抵抗高脂飲食誘導的肥胖［4-6］。本研究結果顯示，造模前MSTN-/-組小鼠體重、體長、腹圍略大于WT 組，但差異無統(tǒng)計學顯著性，可能與小鼠周齡較小，MSTN基因敲除后變化不明顯有關；造模后MSTN-/-組小鼠較WT 組體重、體長和腹圍明顯增大，腓腸肌比重及肌細胞橫截面積明顯增加，表明MSTN可負向調節(jié)骨骼肌質量和體積，抑制肌肉肥大。白色脂肪堆積是T2DM 的顯著特征之一，與代謝綜合征、胰島素抵抗關系密切［7］。本研究結果顯示，WT+DM 組小鼠腓腸肌比重明顯減小，白色脂肪比重明顯增多，而MSTN-/-+DM 組較WT+DM 組有明顯改善，表明抑制MSTN表達可在一定程度上拮抗T2DM 引起的肌量減少，白色脂肪堆積，改善體成分分布。

研究顯示，MSTN基因敲除可增強小鼠的骨骼肌力量，縮短跑臺運動及游泳疲勞時間［8-9］。本研究采用抓力和轉棒力竭時間評價小鼠肌力及抗疲勞能力，結果顯示，MSTN-/-組小鼠抓力較野生型顯著增強，表明MSTN負向調控肌量的同時，也對肌力產(chǎn)生負性影響。MSTN-/-+DM 組小鼠抓力較WT+DM 組顯著提高，甚至接近WT 組水平，提示抑制MSTN表達可拮抗T2DM 引起的肌力減弱。而MSTN基因敲除小鼠轉棒力竭時間卻無明顯變化，因此尚不能確定MSTN對抗疲勞能力的影響。

目前普遍認為胰島素抵抗是糖尿病、肥胖、脂代謝異常等疾病的共同發(fā)病基礎。胰島素-胰島素受體-胰島素受體底物-磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B-葡萄糖轉運體4/糖原合成酶激酶3β 信號通路是胰島素介導葡萄糖攝取和轉運的重要途徑，通路中任一分子異常均可能影響骨骼肌對葡萄糖的轉運和利用，引起糖耐量受損和胰島素抵抗［10-12］。既往研究［2-3，13］發(fā)現(xiàn)，MSTN 可能影響機體對葡萄糖的攝取利用，參與胰島素抵抗的發(fā)生；抑制MSTN 表達可促進高脂飲食喂養(yǎng)肥胖小鼠葡萄糖代謝。本研究結果顯示，純合型小鼠較雜合型及野生型小鼠糖耐量明顯改善，胰島素敏感性增強，骨骼肌胰島素信號通路各蛋白表達水平及磷酸化比例增加，表明MSTN基因表達缺失可上調胰島素信號通路，促進葡萄糖轉運及糖原合成，增強血糖調控能力，改善胰島素抵抗，拮抗T2DM對糖代謝的負性影響。本研究腓腸肌HE染色結果顯示，MSTN-/-組、MSTN-/-+DM 組小鼠腓腸肌纖維明顯增粗，推測骨骼肌形態(tài)特性改變致其細胞膜InsR 和GLUT4 等受體增多，胰島素信號通路傳導增強，葡萄糖轉運和糖原合成加快，導致胰島素敏感性增強，胰島素抵抗減輕。

肌少癥是與增齡有關的以進行性肌量減少和（或）肌強度下降或肌肉功能減退為特征的疾病。中年男性和女性血清MSTN水平均高于年輕組，肌肉質量與血清MSTN水平呈負相關［14-15］，握力水平較高的老年男性血清MSTN水平較低［16］，而握力是反映肌肉力量的重要指標，提示MSTN與肌少癥有關。T2DM 患者往往早期就可出現(xiàn)肌肉質量減少和肌肉功能減退，可能與代謝異常、炎癥通路激活、激素變化等多種機制有關。橫斷面調查顯示，北京地區(qū)60歲以上T2DM 患者肌少癥患病率為8.5%［17］。T2DM合并肌少癥人群中同時存在胰島素抵抗與肌量減少、肌力減弱，而骨骼肌是攝取利用葡萄糖的主要靶器官，因此肌少癥可對全身葡萄糖代謝產(chǎn)生巨大影響。本研究結果顯示，T2DM 小鼠較野生型小鼠肌肉質量明顯減少，肌力明顯減弱，胰島素敏感性降低，胰島素抵抗增加，而抑制MSTN表達可在一定程度上減輕T2DM 對肌量、肌力、糖調節(jié)能力的負性影響。目前對于T2DM 合并肌少癥這一疾病還缺乏有效的治療手段，而本研究通過動物實驗證實，抑制MSTN的表達不僅可有效提高肌量和肌力，還可通過上調胰島素信號通路在一定程度上改善機體的胰島素抵抗，為T2DM合并肌少癥的治療提供新思路。

Figure 4. Protein expression on insulin signaling pathway in skeletal muscle of the mice after modeling. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs WT group；#P＜0.05 vs MSTN+/- group；&P＜0.05 vs MSTN-/- group；+P＜0.05 vs WT+DM group；△P＜0.05 vs MSTN+/-+DM group.圖4 造模后小鼠骨骼肌胰島素信號通路相關蛋白水平的比較

本研究結果提示，抑制MSTN 表達可引起肌量、肌力增加以及肌細胞肥大，上調胰島素信號通路，減輕胰島素抵抗；可在一定程度上拮抗T2DM 對肌量、肌力及胰島素信號通路的負性影響，改善糖耐量及胰島素抵抗。但本研究為動物實驗，樣本量較小，結論有一定局限性，MSTN基因參與T2DM 胰島素抵抗的機制需進一步深入研究。