張會芳， 向珈誼， 梁露群， 王 丹， 周星丞， 張小歡， 毛彥穩(wěn)， 王圓圓， 郭 兵

（貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室，貴州貴陽550025）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）慢性微血管并發(fā)癥之一，是一種高血糖誘導(dǎo)腎臟微血管病變并逐漸影響腎臟功能的嚴(yán)重并發(fā)癥［1］。在DKD 的發(fā)生過程中，糖脂代謝紊亂導(dǎo)致炎癥因子釋放［2］；腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展［3］；腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積引起的纖維化病變造成腎臟功能進(jìn)一步損傷［4］，表明炎癥反應(yīng)和凋亡在DKD的發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。

核轉(zhuǎn)錄因子 Krüppel 樣因子 6（Krüppel-like factor 6，KLF6）是 Sp1/Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個亞家族成員［5］，參與了包括肝纖維化、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）等多種肝臟疾病［6］。已有文獻(xiàn)報道，KLF6 通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物活化受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）參與了 NASH 的調(diào)節(jié)過程。在巨噬細(xì)胞，KLF6 可以負(fù)調(diào)控PPARγ 的表達(dá)，促進(jìn)炎癥因子的釋放［7］。而 KLF6 在 DKD 發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚未完全闡明。胰島素（insulin，INS）是胰島β 細(xì)胞分泌的一種肽類激素，具有較好的控制血糖水平的作用，是臨床治療DM 的常用藥物［8］。本研究擬予以INS 控制DM 大鼠血糖，觀察腎組織KLF6 的表達(dá)變化；將大鼠近端腎小管上皮NRK-52E細(xì)胞予以正常糖（normal glucose，NG）或高糖（high glucose，HG）刺激，或在HG 培養(yǎng)后置于NG 中培養(yǎng)，或分別過表達(dá)及敲減KLF6表達(dá)，觀察KLF6 表達(dá)變化和大鼠腎小管上皮細(xì)胞纖維化病變情況，探索KLF6 在DKD 發(fā)生發(fā)展的作用和機制，為DKD 的臨床治療提供一定的實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 清潔級6 周齡雄性SD 大鼠，體重（200±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2009-0007，質(zhì)量合格證號為0257330。

1.2 細(xì)胞 大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞系NRK-52E購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 試劑 辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG、免疫組織化學(xué)檢測試劑及顯色試劑盒均購自Vector；BCA蛋白定量試劑盒及ECL顯色劑購自北京碧云天生物研究所；抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、III 型膠原蛋白（collagen type III，Col III）、鈣黏蛋白（E-cadherin）和KLF6抗體均購自Proteintech；抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（Santa Cruz）；抗白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）抗體（北京博奧森）；抗PPARγ抗體（Cell Signaling Technology）；抗纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）抗體（Abcam）；抗β-actin 抗體（武漢普美克技術(shù)有限公司）；抗GAPDH 抗體（武漢普美克技術(shù)有限公司）；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ；Sigma）；INS（諾和諾德）；蛋白marker（賽默飛）；實時定量PCR 引物購自廣州銳博公司；實時定量GAPDH 引物購自上海生物工程公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物公司）；KLF6過表達(dá)質(zhì)粒（pCAG-GFP-Puro01-KLF6，OEKLF6）和KLF6小干擾 RNA（KLF6siRNA，si-KLF6）均購自上海毅樂生物科技有限公司。

2 方法

2.1 DM 模型的建立及分組 將SD 大鼠隨機分為正常對照（normal control，NC）組、DM 組和INS 治療組（INS組），每組6只。DM組及INS組大鼠采用腹腔注射55 mg/kg 鏈脲佐菌素的方法復(fù)制DM 模型，72 h后測量空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L 為造模成功。成模 4 周起 NC 組及 DKD 組予 0.1 mL 溶媒，INS 組于造模成功4周后給予INS治療，劑量為22 U。劑量實行個體化，隨機血糖控制在7～8 mmol/L 以下，治療6周。DKD 造模方法如下，將 STZ 溶于 0.1 mol/L 無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5），一次性尾靜脈注射 2% STZ（55 mg/kg）復(fù)制 DM 大鼠模型，72 h 測大鼠空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L 且尿糖陽性判斷為造模成功，成模1 周后行尿蛋白定性檢測，尿蛋白陽性為DKD模型復(fù)制成功。

2.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 正常大鼠腎小管上皮NRK-52E細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，在含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Gibco）和5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)液（Gibco）中進(jìn)行維持培養(yǎng)。含2% FBS 的NG（5.5 mmol/L 葡萄糖）培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h，為 NG 組；含 2% FBS 的HG（55 mmol/L 葡萄糖）培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 48 h，為 HG 組；含 2% FBS 的 HG 培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后，轉(zhuǎn)入含2% FBS 的NG 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，為HG轉(zhuǎn)入NG組（HG to NG組）。

待細(xì)胞融合度為40%～50%時，用Lipofectamine 2000（Invitrogen）瞬時轉(zhuǎn)染 NRK-52E 細(xì)胞，隨機將細(xì)胞分為NG+空載體（vector）組、NG+OE-KLF6 組、HG組和HG+si-KLF6組，培養(yǎng)48 h。

2.3 標(biāo)本采集及生化指標(biāo)的檢測 注射6 周INS后，將所有大鼠處死。大鼠處死前禁食6～8 h，乙醚麻醉，股動脈取血，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存，用于相應(yīng)血生化指標(biāo)的檢測。剖腹，用4 mL 生理鹽水于左心耳注入以灌洗臟器，取出雙側(cè)腎臟，部分用40 g/L 多聚甲醛固定，其余腎臟組織放入分裝管，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ∥膊磕┥胰肈CA Vantage Analyzer 檢測糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）；用 ONETOUCH SureStep（Hospital）穩(wěn)步型血糖儀檢測血糖；用雅培2000 全自動生化儀檢測甘油三酯、血尿素氮和尿蛋白。

2.4 腎臟組織病理學(xué)檢查 4%甲醛固定腎臟組織，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后制成3 μm 石蠟切片，HE 和天狼星紅染色后，在光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)變化并拍照保存。HE 染色觀察腎組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，天狼星紅染色觀察腎組織的纖維化病變程度。

2.5 免疫組織化學(xué)染色 將石蠟切片在60 ℃烤片1 h后脫蠟至水，洗滌后，30%H2O2與甲醇按1∶9的比例混合，滴于組織切片上，室溫10 min 滅活過氧化物酶。高壓抗原修復(fù)，驢血清封閉1 h，加入兔抗KLF6（1∶100）4 ℃孵育過夜。第2 天由冰箱取出后，洗滌3次，加入山羊抗兔IgG（1∶200），室溫孵育1 h。洗滌后，3-氨基-9-乙基咔唑（3-amino-9-ethylcarbazole，AEC）染色，自來水終止反應(yīng)，蘇木精溶液染核，封片，顯微鏡觀察。結(jié)果計數(shù)：采用ImageJ分析軟件在高倍（×200）鏡下每張切片隨機取10個視野確定陽性染色的區(qū)域，計算陽性染色的面積占總面積的比例（%）。

2.6 Western blot 檢測腎組織及NRK-52E 細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平 從-80 ℃冰箱里取出腎臟組織，用濾紙吸干水分，稱取50～100 mg，加入組織蛋白裂解液后置于勻漿器上研磨后，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，用BCA試劑盒測定各組蛋白濃度，按所得濃度計算出需要加入的loading buffer 體積，加入loading buffer后充分混勻，在預(yù)先準(zhǔn)備的沸水中煮15 min，上樣。6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞倒掉培養(yǎng)基，PBS清洗，加入細(xì)胞裂解液，刮取細(xì)胞蛋白于EP 管中，沸水煮10 min，上樣。蛋白經(jīng)過SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 洗膜，加入抗KLF6（1∶1 000）、PPARγ（1∶1 000）、α-SMA（1∶800）、Col III（1∶1 000）、IL-6（1∶1500）、TNF-α（1∶500）、Bax（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）和FN（1∶1 000）抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入相應(yīng)Ⅱ抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜后，加入ECL熒光顯色液，置于凝膠成像儀曝光，ImageJ軟件分析結(jié)果。

2.7 RT-qPCR 檢測 PPARγ 的 mRNA 表達(dá) Trizol法提取各組大鼠腎組織總RNA，且測定提取的總RNA濃度；按翊圣生物公司試劑盒說明書，以20 μL 反轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行PPARγ 的擴增。PPARγ 引物由廣州銳博有限公司合成，正向引物序列為5′-GGAATCAGCTCTGTGGACCTCTC-3′，反向引物序列為 5′-TGGAGAAATCAACCGTGGTAAAG-3′；GAPDH 引物由生工合成，正向引物序列為5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，反向引物序列為 5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′。 以 GAPDH為內(nèi)參照，采用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行qPCR實驗，結(jié)果以2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。

2.8 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 使用annexin VFITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。待細(xì)胞密度為80%時，胰酶消化細(xì)胞至于離心管中，用預(yù)冷的PBS 洗3次，并加入適量PBS 重懸細(xì)胞，將重懸好的細(xì)胞隨機分組：對照組、PE 單染組、FITC 單染組和實驗組（雙染），向相應(yīng)組別中加入 10 μL 的 PE 或者 FITC 標(biāo)記的抗體，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測，按照順序：對照組、PE 單染組、FITC 單染組和實驗組（雙染）依次設(shè)門，進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)，結(jié)果以百分?jǐn)?shù)表示。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較的數(shù)據(jù)用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠一般情況與相關(guān)生化指標(biāo)檢測結(jié)果

NC 組大鼠生長狀況良好，活動正常，精神狀態(tài)良好；DM 組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食等現(xiàn)象。與NC 組相比，DM 組大鼠腎重/體重、血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯、血尿素氮和尿蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與DM 組相比，經(jīng)過INS 治療后的大鼠腎重/體重、血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯、血尿素氮和尿蛋白水平均顯著下降（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠腎重/體重、血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯、尿素氮和尿蛋白水平的比較Table 1. The levels of kidney/body weight，blood glucose（BG），glycated hemoglobin（HbA1c），triglyceride（TG），blood urea nitrogen（BUN）and urine protein（UP）in rats（Mean±SD. n=6）

2 大鼠腎臟組織的病理學(xué)改變

HE 染色結(jié)果顯示，NC 組腎小球固有細(xì)胞未見明顯增生，系膜區(qū)未見明顯增寬，基底膜未見明顯增厚，腎小管未見明顯萎縮，上皮細(xì)胞可見少許顆粒變性，腎間質(zhì)未見纖維化及炎癥細(xì)胞浸潤，血管壁未見明顯增厚；DM 組系膜及間質(zhì)輕度節(jié)段增生，上皮細(xì)胞顆粒及灶狀空泡變性，基底膜未見明顯增厚，腎小管灶性萎縮（萎縮面積＜10%），腎間質(zhì)可見灶性淋巴細(xì)胞及單個核細(xì)胞浸潤，伴纖維化增生，小血管壁未見明顯增厚；與DM 組相比，INS 組上述病變均有所減輕。天狼星紅染色結(jié)果顯示，與NC組相比，DM 組伴有腎小管-間質(zhì)纖維化，陽性染色明顯增加；INS 組與DM組相比，陽性染色明顯減少。見圖1。

3 KLF6在各組腎組織中的表達(dá)和分布

免疫組化染色結(jié)果顯示，與NC組相比，DM 組腎小管胞漿及胞質(zhì)顆粒狀KLF6 蛋白陽性表達(dá)增加；INS處理后，KLF6在腎小管的陽性表達(dá)比例減少（P＜0.05），見圖 2A。Western blot 結(jié)果顯示，與 NC 組相比，DM 組 KLF6 蛋白表達(dá)明顯增加；經(jīng)過 INS 治療后，KLF6蛋白表達(dá)減少，見圖2B。

4 各組大鼠腎組織中PPARγ、α-SMA、Col III、IL-6、TNF-α和Bax表達(dá)的變化

Figure 1. Histological changes of rat kidney tissues in each group（×200）.圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化

Figure 2. The expression and distribution of KLF6 in rat renal tissues detected by immunohistochemical staining（A，×200）and Western blot（B）. KLF6 was expressed in the cytoplasm and nucleus of renal tubular epithelial cells in the renal cortex（black arrow）. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs DM group.圖2 免疫組化染色和Western blot檢測KLF6在各組大鼠腎組織中的表達(dá)與分布

與 NC 組相比較，DM 組 α-SMA、Col III、IL-6、TNF-α 和 Bax 的蛋白水平顯著升高，而 PPARγ 蛋白和mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與DM 組相比，INS 組IL-6、TNF-α、α-SMA、Col III 和Bax 的蛋白水平顯著降低，而PPARγ 蛋白和mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖3。

5 NG 條件下過表達(dá)KLF6 可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞損傷和纖維化

為了進(jìn)一步研究KLF6 與細(xì)胞表型的關(guān)系，在NG 環(huán)境中予 NRK-52E 細(xì)胞 Lipofectamine 2000 瞬時轉(zhuǎn)染KLF6 過表達(dá)質(zhì)粒，培養(yǎng)48 h，可見KLF6 表達(dá)水平明顯升高（圖4A）。與NG+vector 組相比，NG+OEKLF6組NRK-52E 細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平顯著降低，纖維化指標(biāo)FN 及炎癥指標(biāo)IL-6表達(dá)水平均顯著升高（圖4B～E），細(xì)胞凋亡率亦顯著升高（圖4F）。

Figure 3. Expression of PPARγ，Col III，α-SMA，TNF-α，IL-6，and Bax in rat kidney tissues of each group. A：the protein levels of PPARγ，Col III，α-SMA，TNF-α，IL-6 and Bax determined by Western blot；B：the expression of PPARγ mRNA determined by RT-qPCR. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs DM group.圖3 各組大鼠腎組織中PPARγ、Col III、α-SMA、TNF-α、IL-6和Bax的表達(dá)

Figure 4. Effects of KLF6 overexpression on the protein levels of E-cadherin，F(xiàn)N and IL-6，and apoptosis of NRK-52E cells in NG environment. A：NRK-52E cells were transfected with empty vector（NG+vector）and KLF6-overexpressing plasmid（NG+OE-KLF6）using Lipofectamine 2000 on 6-well culture dishes；B to E：Western blot for determining the protein levels of E-cadherin，F(xiàn)N and IL-6；F：flow cytometry for analyzing the apoptosis of NRK-52E cells. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NG+vector group.圖4 NG環(huán)境中過表達(dá)KLF6對NRK-52E細(xì)胞E-cadherin、FN和IL-6蛋白水平和凋亡的影響

6 HG 條件下敲減KLF6 表達(dá)可減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷和纖維化

將NRK-52E 細(xì)胞以Lipofectamine 2000 瞬時轉(zhuǎn)染si-KLF6后置于HG 環(huán)境中，培養(yǎng)48 h，可見KLF 表達(dá)水平明顯降低（圖5A）。與HG 組相比，HG+si-KLF6組NRK-52E 細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平顯著降低，纖維化指標(biāo)FN 及炎癥指標(biāo)IL-6表達(dá)水平均顯著降低（圖5B～E），細(xì)胞凋亡率亦顯著降低（圖5F）。

7 PPARγ可能是KLF6的下游靶基因

與對照組相比，過表達(dá)KLF6后PPARγ蛋白表達(dá)水平降低，而敲減KLF6后PPARγ蛋白表達(dá)水平升高（圖6）。通過生物信息學(xué)網(wǎng)站JASPER，預(yù)測KLF6與PPARγ啟動子可能存在的結(jié)合位點（表2），進(jìn)一步提示PPARγ可能是KLF6的下游靶基因。

表2 用生物信息學(xué)網(wǎng)站JASPER預(yù)測KLF6與PPARγ的調(diào)控位點區(qū)域Table 2. Predicting the regulatory sites of KLF6 and PPARγ by the bioinformatics website JASPER

8 控制血糖對NRK-52E 細(xì)胞中KLF6、PPARγ、E-cadherin、FN和IL-6蛋白水平的影響

為了進(jìn)一步研究HG 對于NRK-52E 細(xì)胞中KLF6、PPARγ、E-cadherin、FN 和 IL-6 蛋白水平的影響，我們將NRK-52E 細(xì)胞于HG 培養(yǎng)基刺激24 h 后再置于NG 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。與NG 組相比，HG 組KLF6、纖維化指標(biāo)FN 及炎癥指標(biāo)IL-6 表達(dá)增多，PPARγ 和上皮細(xì)胞標(biāo)志物 E-cadherin 減少；與 HG 組相比，HG to NG 組 KLF6、FN 和 IL-6 表達(dá)減少， PPARγ和E-cadherin表達(dá)增加（P＜0.05），見圖7。

Figure 6. Effects of KLF6 overexpression（A）or knockdown（B）on the protein level of PPARγ in NRK-52E cells. The protein levels of KLF6 and PPARγ were determined by Western blot. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NG+vector group；#P＜0.05 vs HG group.圖6 過表達(dá)或敲減KLF6對NRK-52E細(xì)胞中PPARγ表達(dá)的影響

Figure 7. Effects of blood glucose control on the protein levels of KLF6，PPARγ，E-cadherin，F(xiàn)N and IL-6 in NRK-52E cells. The protein levels of KLF6，PPARγ，E-cadherin，F(xiàn)N and IL-6 were determined by Western blot. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs NG group；#P＜0.05 vs HG group.圖7 控制血糖對NRK-52E細(xì)胞中KLF6、PPARγ、E-cadherin、FN和IL-6蛋白水平的影響

討 論

據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會（International Diabetes Federation，IDF）的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2019 年全球約 4.63 億 20～79 歲成人患 DM，預(yù)計到 2045 年，DM患者會達(dá)到7.002億［9］，約30%～35%的DM 患者可發(fā)展為 DKD［10］。隨著 DM 發(fā)病率逐年上升，DKD 已經(jīng)嚴(yán)重影響了人們的身體健康。

DKD 發(fā)病機制十分復(fù)雜，其中炎癥、凋亡和纖維化在DKD 發(fā)病機制中起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在腎臟疾病的發(fā)生過程中，炎癥細(xì)胞的浸潤及細(xì)胞外基質(zhì)增生導(dǎo)致了腎臟的炎癥和間質(zhì)纖維化［11］。腎小管上皮細(xì)胞的凋亡是間質(zhì)纖維化發(fā)展的早期事件，參與了 DKD 的進(jìn)展［12］。在本研究中，DM 組大鼠腎組織病理結(jié)果顯示，系膜及間質(zhì)輕度節(jié)段增生，上皮細(xì)胞顆粒及灶狀空泡變性，腎間質(zhì)可見灶性炎癥細(xì)胞浸潤，且Western blot 結(jié)果顯示膠原沉積明顯增加，炎癥因子TNF-α 和IL-6 蛋白表達(dá)明顯增多，凋亡相關(guān)蛋白Bax 表達(dá)增多，提示DM 大鼠發(fā)生了炎癥、凋亡及腎小管-間質(zhì)纖維化病變。而經(jīng)過INS 處理后，DM 大鼠腎組織炎癥因子、凋亡相關(guān)蛋白Bax 表達(dá)及病理變化都有所降低與改善。

KLF6 是巨噬細(xì)胞中激活促炎基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子之一［13］，在人近端腎小管上皮細(xì)胞中過表達(dá)KLF6 會加劇細(xì)胞炎癥及凋亡反應(yīng)［14］。在分子水平上，KLF6 可通過抑制巨噬細(xì)胞中的PPARγ和miR-223等抗炎基因的表達(dá)，提高促炎基因的表達(dá)［15］。以上結(jié)果提示，KLF6 表達(dá)增加會促進(jìn)炎癥及凋亡反應(yīng)。本實驗研究結(jié)果顯示，DM 組腎組織α-SMA、Col III 和Bax 蛋白表達(dá)水平明顯升高，并伴有炎癥因子上調(diào)。予INS 治療后，INS 組腎臟組織α-SMA、Col III和Bax 蛋白及炎癥因子較DM 組降低。為了明確KLF6 在腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用，腎小管上皮細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF6質(zhì)粒后予以NG 環(huán)境中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染si-KLF6后置于HG環(huán)境中培養(yǎng)。結(jié)果顯示，與 NG+vector 組相比，NG+OE-KLF6 組 E-cadherin 的表達(dá)降低，F(xiàn)N 及IL-6 的表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡率有所增加；與 HG 組相比，HG+si-KLF6 組的 E-cadherin 表達(dá)升高，F(xiàn)N、IL-6的表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率有所降低，提示KLF6 參與了腎小管-間質(zhì)纖維化炎癥病變及細(xì)胞凋亡過程。為進(jìn)一步明確HG 是否通過上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞KLF6介導(dǎo)細(xì)胞損傷，分別予以NRK-52E細(xì)胞NG，HG，以及HG培養(yǎng)24 h后NG培養(yǎng)，與NG組相比，HG 組 KLF6、FN 和 IL-6 表達(dá)增多，PPARγ 和 E-cadherin減少；與HG組相比，HG to NG 組KLF6、纖維化指標(biāo)FN 及炎癥指標(biāo)IL-6表達(dá)降低，PPARγ和上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin增多，提示HG通過上調(diào)KLF6的表達(dá)介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷。

PPARγ 是一個核激素受體超家族的成員，控制著許多生理過程，如葡萄糖和脂質(zhì)代謝、INS 敏感性和炎癥反應(yīng)［16-17］。PPARγ 的合成激動劑，包括噻唑烷二酮（thiazolidinediones，TZDs）、羅格列酮和吡格列酮等，已經(jīng)廣泛用于臨床治療高血糖及INS 抵抗［18］。TZDs 在許多器官如肺、腸、腎臟等器官也用于抗纖維化治療［19-20］。在DKD 的發(fā)展過程中，PPARγ可以通過抑制炎癥信號通路從而改善腎臟的炎癥和纖維化病變［21］。本實驗研究結(jié)果中，DM 組大鼠腎組織PPARγ的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著降低，而經(jīng)過INS 治療控制血糖后PPARγ 蛋白與mRNA 表達(dá)水平有所恢復(fù)，提示PPARγ 表達(dá)下調(diào)參與了DKD的發(fā)展過程。

已有研究表明，在人腎小管上皮細(xì)胞中過表達(dá)KLF6時，PPARγ 的表達(dá)減少；敲減KLF6時，PPARγ的表達(dá)有所增加［21］。且在巨噬細(xì)胞中，KLF6 可通過調(diào)節(jié)NF-κB和抑制PPARγ的表達(dá)來促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥基因的表達(dá)［23］。提示 KLF6 可以抑制 PPARγ 表達(dá)，發(fā)揮促炎效應(yīng)。本研究在NRK-52E 細(xì)胞中分別過表達(dá)及敲減KLF6，觀察PPARγ 的變化。與NG+vector 組相比，NG+OE-KLF6 組 PPARγ 表達(dá)降低；與HG 組相比，HG+si-KLF6 組 PPARγ 表達(dá)升高，提示KLF6 與PPARγ 存在著某種負(fù)調(diào)控關(guān)系。并且通過生物信息學(xué)網(wǎng)站 JASPER 對 KLF6 與PPARγ基因啟動子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者間存在多個位點的結(jié)合位。因此，結(jié)合以上實驗與軟件預(yù)測結(jié)果，推測KLF6 可下調(diào)PPARγ的表達(dá)。

綜合文獻(xiàn)和本實驗研究結(jié)果，我們認(rèn)為HG可使KLF6蛋白表達(dá)增多，抑制PPARγ的mRNA 和蛋白表達(dá)，其機制可能是KLF6 通過抑制PPARγ 而影響炎癥因子表達(dá)和凋亡反應(yīng)，加劇了纖維化進(jìn)程，從而參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展；而控制血糖可通過下調(diào)KLF6 而抑制1 型DM 大鼠的腎小管上皮細(xì)胞損傷。因此進(jìn)一步研究KLF6 在腎間質(zhì)纖維化中的調(diào)節(jié)作用，對DKD的治療具有重要意義。