郭天賜 劉愛峰 陳繼鑫 余偉杰

【提要】 骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是好發(fā)于多個年齡段的常見骨關(guān)節(jié)病，伴有軟骨損傷及局部炎癥反應(yīng)等復(fù)雜的病理改變。間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有較強的抗炎、組織修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)的能力，而間充質(zhì)干細胞經(jīng)旁分泌途徑分泌的外泌體(Exosome)在組織修復(fù)與軟骨再生方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs源性外泌體能夠通過轉(zhuǎn)運并釋放蛋白質(zhì)、非編碼RNA等生物活性物質(zhì)，介導(dǎo)并傳遞抗炎及免疫活性因子，緩解OA病理進程，促進軟骨修復(fù)與再生，但其具體作用機制仍不明確。本文對MSCs源性外泌體在OA治療中的相關(guān)機制研究結(jié)果進行綜述，以期為OA的臨床治療提供新的方向。

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是最常見的退行性骨關(guān)節(jié)病，好發(fā)于膝、髖、頸、腰等負重關(guān)節(jié)及指間、跖趾等小關(guān)節(jié)，以關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨退行性改變?yōu)樘卣?，常累及整個關(guān)節(jié)[1-2]。研究顯示，60歲以上的人群中9.6%的男性和18.0%的女性有OA的癥狀[3]。OA的發(fā)病機制尚未完全闡明，但已發(fā)現(xiàn)OA的病理機制涉及NF-κB、Wnt/β-catenin等細胞信號通路以及巨噬細胞自噬清除、多種轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors，TCF)和miRNA的調(diào)控，還涉及TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10等促炎與抑炎因子的失衡等[4-5]。OA的病理涉及軟骨、軟骨下骨在內(nèi)的整個關(guān)節(jié)，現(xiàn)已證明軟骨細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的合成和降解失衡是骨關(guān)節(jié)炎的典型病理特征[6-8]。

臨床中OA的治療手段有很多，盡管手術(shù)和藥物治療能夠一定程度上緩解疼痛，但無法從根本上解決關(guān)節(jié)軟骨的再生和修復(fù)問題。間充質(zhì)干細胞具有強大的軟骨再生和修復(fù)能力，具備向軟骨細胞分化的能力和免疫調(diào)節(jié)特性，成為目前研究最廣泛的OA細胞治療方法[9-10]。大量研究表明，MSCs分化成軟骨細胞、參與組織修復(fù)的功能主要依靠其旁分泌途徑來實現(xiàn)的，其分泌的外泌體在其中可能起著關(guān)鍵作用[11]。Toh等[12]認為，MSCs分泌的外泌體也可以在治療OA中發(fā)揮積極作用，因其含有豐富的蛋白質(zhì)和ECM酶，可以調(diào)節(jié)和恢復(fù)ECM平衡。由于外泌體擁有更高的穩(wěn)定性和免疫原性，無細胞毒性，可減少干細胞移植所帶來的免疫反應(yīng)，更易用于臨床治療[13]。因此，MSCs來源外泌體作為“無細胞”治療手段用于OA治療日趨受到關(guān)注[14]。MSCs源性外泌體在OA治療中的具體作用機制目前尚無定論。本文就MSCs源性外泌體治療OA的具體作用機制及最新研究進展進行綜述。

1 外泌體的相關(guān)概述

1.1 外泌體生物學(xué)特性

外泌體是一種直徑為30～150 nm的雙層微小膜結(jié)合囊泡，可由多種細胞釋放[15]。以“內(nèi)吞-融合-傳遞”的方式釋放至細胞外基質(zhì)中。外泌體內(nèi)包含了多種RNA、mRNA、miRNA、DNA和功能性蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，能夠介導(dǎo)細胞間多種信號傳遞和交流，具有抗炎、修復(fù)受損組織等作用[16]。外泌體來源于胞質(zhì)膜內(nèi)吞作用所產(chǎn)生的內(nèi)體。隨后，在細胞內(nèi)部，諸如mRNA或蛋白質(zhì)之類的生物活性物質(zhì)聚集在內(nèi)小體內(nèi)，從而形成多囊內(nèi)體或腔內(nèi)小泡。進一步加工后，外泌體最終通過膜融合釋放[17-18]。這些微囊泡參與了細胞間信息傳遞的過程，在生物體細胞間的通信交流中起到極其重要的作用。此外，外泌體還可作為穩(wěn)定的載體，將自身攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸(包括miRNA和長的非編碼RNA)等生物活性物質(zhì)特異性輸送到靶細胞中，在細胞間通信和細胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[19]。

1.2 外泌體的軟骨修復(fù)作用

近年來，MSCs源性外泌體在修復(fù)損傷組織及軟骨再生方面的作用已成為研究熱點。MSCs來源外泌體內(nèi)富含大量的蛋白質(zhì)和miRNA，能夠直接與受損組織細胞進行信息交流，對受損細胞進行生物學(xué)功能調(diào)控。因此，MSCs源性外泌體在OA軟骨修復(fù)與再生方面的作用機制也成為了研究的焦點。目前的研究表明，各種MSCs-Exo均可促進軟骨細胞的增殖，加快軟骨的修復(fù)與再生[2]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，外泌體不會被免疫系統(tǒng)識別。外切體的免疫原性可能與其表面黏附蛋白和載體配體有關(guān)，但具體作用機制尚不清楚。Kordelas等[13]對1名有移植物抗宿主病患者2周內(nèi)多次靜脈輸注MSCs來源的外泌體，結(jié)果耐受性良好，沒有引起不良反應(yīng)。Zhang等[20]將人胚胎間充質(zhì)干細胞異種移植到免疫活性動物體內(nèi)進行軟骨修復(fù)，立即引起不良組織反應(yīng)，導(dǎo)致修復(fù)效果不佳。這也表明MSCs來源外泌體具有無細胞毒性且免疫排斥反應(yīng)小的特點。

1.3 外泌體的抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用

關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部生長微環(huán)境是軟骨修復(fù)與再生的關(guān)鍵，外泌體具有抗炎作用，參與免疫調(diào)節(jié)，可抑制OA進展[21]。外泌體能夠減少TNF-α、IL-6等促炎因子的含量，增加抗炎因子IL-10的表達，這可能與NF-κB通路有關(guān)[22]，且能夠抑制TNF-α等引起的炎癥反應(yīng)，如促炎因子白介素及環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)的表達。然而，研究發(fā)現(xiàn)，缺乏外泌體的間充質(zhì)干細胞對COX-2表達的抑制作用明顯減弱。這說明外泌體在間充質(zhì)干細胞抗炎旁分泌途徑中扮演著重要角色。為進一步詮釋外泌體的抗炎作用，Vonk等[23]檢測NF-κB亞單位P65的亞細胞定位情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)TNF-α處理后可引起P65由細胞質(zhì)易位到細胞核，繼而誘使NF-κB 通路激活。進一步研究證明，外泌體能抑制NF-κB的亞單位IKBα的磷酸化，進而阻斷NF-κB通路的激活，表明外泌體的抗炎作用與抑制NF-κB信號通路相關(guān)。此外，Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體具有免疫調(diào)節(jié)作用，可減少M1巨噬細胞的滲入，抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表達，促使M2巨噬細胞大量滲入OA骨缺損及滑膜病變處，發(fā)揮其抗炎作用，分泌血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascular endothelial cell growth factor，VEGF)、IL-10、TGF-β等抑炎因子，有利于軟骨的修復(fù)與再生。綜上所述，MSCs源性外泌體展現(xiàn)出潛在的抗炎與免疫調(diào)節(jié)能力，達到抗炎免疫與組織重建之間的平衡。

2 多種MSCs源性外泌體在OA治療中的應(yīng)用機制

2.1 BM-MSCs源性外泌體在OA治療中的應(yīng)用

近年來，基于BMSCs的治療被認為是組織修復(fù)的新療法[25]。大量研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs通過其分泌的外泌體介導(dǎo)組織修復(fù)，參與了軟骨修復(fù)的調(diào)節(jié)[26]。Ju等[27]發(fā)現(xiàn)，MSCs-Exo在促進軟骨增殖、修復(fù)和增生，維持軟骨穩(wěn)定性和抑制軟骨降解方面具有顯著作用。Wang等[28]發(fā)現(xiàn)，外泌體來源的miR-135B可以下調(diào)軟骨細胞Sp1的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)化生長因子-β-1刺激BMSCs，使得miR-135B在MSCs-Exo中的表達增強，細胞活力提高，Sp1的表達降低，提示轉(zhuǎn)化生長因子-β-1通過刺激MSCs來源的含有miR-135B的外泌體，負調(diào)控Sp1的表達，從而促進軟骨細胞的增殖，加快OA軟骨的修復(fù)，這可能為OA的治療提供新的方向。Jin等[29]發(fā)現(xiàn)，與注射生理鹽水的大鼠相比，注射外泌體的大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中mRNA和蛋白的表達降低；同時，OA大鼠關(guān)節(jié)液中注射外泌體miR-9-5p會導(dǎo)致IL-1、IL-6和TNF-α等促炎因子含量降低。因此，推測外泌體miR-9-5p有助于抑制炎癥和氧化應(yīng)激損傷，BM-MSCs來源的外泌體miR-9-5p對大鼠OA有改善作用，BM-MSCs來源的外泌體能夠抑制OA進展，修復(fù)軟骨損傷和減輕炎癥。

2.2 SD-MSCs源性外泌體在OA治療中的應(yīng)用

以往研究表明，滑膜間充質(zhì)干細胞(Synovium-derived mesenchymal stem cells，SD-MSCs)具有分離方法簡便，增殖能力及多分化能力較強的特點，在軟骨、韌帶及骨組織工程領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。Guo等[30]通過大量體外實驗結(jié)果證明，SD-MSCs外泌體可以促進BMSCs的增殖，同時具有抗凋亡能力，對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨壞死有預(yù)防作用。Tao等[31]發(fā)現(xiàn)滑膜間充質(zhì)干細胞中Wnt5a和Wnt5b高表達，并且在SD-MSCs分泌的外泌體中也富含Wnt5a 和Wnt5b。SD-MSCs分泌的外泌體通過Wnt5a和Wnt5b激活Yes相關(guān)蛋白YAP(Yes-associated protein，YAP)，激活的YAP導(dǎo)致軟骨細胞增殖遷移，但是引起分子信號Sox9(sexdetermining region Y box 9，Sox9)表達和細胞外基質(zhì)蛋白合成分泌降低。由此，進一步對Wnt信號傳導(dǎo)和YAP活化的機制進行研究，通過添加核酸使SD-MSCs高表達miR-140-5p，并在SD-MSCs分泌的外泌體中檢測到高表達的miR-140-5p。結(jié)果表明，高表達miR-140-5p的外泌體能夠增加Sox9和細胞外基質(zhì)分泌。因此，高表達miR-140-5p的SD-MSCs的外泌體可以緩解OA病變，在臨床實踐中具有巨大潛力，可用于開發(fā)研究治療OA的藥物。同時，這些結(jié)果也提示，基因技術(shù)修飾后的外泌體可能是未來OA的治療策略之一，有著廣闊的研究前景。

2.3 AD-MSCs源性外泌體在OA治療中的應(yīng)用

脂肪間充質(zhì)干細胞(Adipose derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs)來源廣泛，易獲取[32]。Xia等[33]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-1等促炎細胞因子和NF-κB通路對OA患者的滑膜炎癥和軟骨破壞特征有很大影響。Zhao等[34]從AD-MSCs中分離的外泌體能夠下調(diào)促炎標志物IL-6的表達，影響NF-κB通路的表達。因此，AD-MSCs-Exo能夠抑制這些促炎細胞因子，具有改善OA的潛力。

Mianehsaz 等[35]發(fā)現(xiàn)，從AD-MSCs分泌的外泌體可以通過多種途徑起到抗炎和軟骨保護的作用，包括減少炎癥介質(zhì)(如TNF-α、IL-6、IL-1)的產(chǎn)生，減少基質(zhì)金屬蛋白酶活性的釋放。Cosenza等[26]發(fā)現(xiàn)，MSCs來源的外泌體可以通過增加Ⅱ型膠原和聚集素等軟骨細胞標志物的表達，降低炎性標志物INOS及MMP-13、ADAMTS-5等分解代謝標志物的表達，減少軟骨細胞的凋亡，并阻斷巨噬細胞的激活，從而保護OA的軟骨和骨的降解。這些作用與促進細胞增殖和遷移可能是AD-MSCs-Exos對OA有一定保護作用的原因。

3 MSCs源性外泌體分泌miRNA在OA治療中的應(yīng)用機制

miRNA是一種非編碼RNA，長度約為22個核苷酸[36]。MSCs-EXO中含有多種miRNA，其在OA的修復(fù)機制中發(fā)揮著重要作用。Sun等[37]發(fā)現(xiàn)，高表達miR-320C的hBMSCs來源外泌體在促進軟骨細胞增殖和下調(diào)基質(zhì)金屬肽酶13方面更有效。Martinez-Sanchez等[38]提出，miRNA-145可以通過直接抑制Sox9來調(diào)節(jié)人類軟骨細胞的功能。Wang等[28]在大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，MSCs-exo衍生的miRNA-135B可通過調(diào)控TGF-b促進軟骨修復(fù)。蘇永蔚等[39]在實驗型SD大鼠創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎模型中發(fā)現(xiàn)，MSC-27b-Exos關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，具有明顯的抗炎作用并可減緩關(guān)節(jié)軟骨退行性變。

Miyaki等[40]通過低表達miRNA-140(--/++)的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)miRNA-140介導(dǎo)了關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖的合成和軟骨的纖維化過程，其缺失可導(dǎo)致退行性骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生，而當miRNA-140高表達時可防止OA樣軟骨的退變，表明MSCs源性外泌體中攜帶的高含量miRNA-140可能成為OA潛在的治療方式，值得深入研究。此外，Dudek等[41]證實miR-675可以調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原A1(COL2A1)的表達，高表達的miR-675能夠在一定程度上緩解由于Sox9基因缺失造成的COL2A1的缺乏，這可能會成為調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)生成的新途徑，軟骨修復(fù)的新靶點。miR-148a高表達可以降低Ⅹ型膠原A1的表達，促進COL2A1的分泌，促進軟骨細胞增殖，預(yù)防OA的進展。這可能成為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨及間充質(zhì)干細胞治療骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶點[42]。因此，MSCs-Exo來源的miRNA不僅可以促進軟骨細胞增殖，抑制軟骨細胞凋亡，還能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。了解其特定miRNA的潛在機制及進一步探索不同基因的排列組合，可能為OA的治療提供一些新的方向。

4 總結(jié)

OA的病理涉及軟骨、軟骨下骨等在內(nèi)的整個關(guān)節(jié)，MSCs源性外泌體由于其獨特的功能和特性，能協(xié)調(diào)骨性關(guān)節(jié)炎中的炎癥介質(zhì)及免疫過程，且富含大量蛋白質(zhì)、miRNA等生物活性物質(zhì)，對修復(fù)受損組織或充當治療藥物穩(wěn)定載體具有重要作用，在OA發(fā)病機制、診斷及治療方面擁有廣闊的臨床前景。今后的研究應(yīng)著力于兩方面。①外泌體應(yīng)用于OA臨床治療的研究鮮有報道，且外泌體對人體正常細胞的作用機制尚不十分清楚，利用外泌體作為治療藥物載體值得深入研究；②有關(guān)外泌體對OA的具體作用機制尚不深入，MSCs源性外泌體在OA人體中的注射劑量也有待標準化。因此，需要進一步探究其治療OA的可行性和安全性。相信在不久的將來，外泌體會為臨床OA治療提供新的方向。