李文藝,李潔維,王發(fā)明,張 晉,鐘彩虹*,李 黎*

(1.植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院 獼猴桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院 武漢植物園，武漢 430074；2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，桂林 541006；3.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西 南寧 530007)

廣西壯族自治區(qū)野生獼猴桃資源豐富，氣候適宜獼猴桃生長(zhǎng)，且果實(shí)成熟期較其他產(chǎn)區(qū)提前了15～20 d，具有較好的產(chǎn)業(yè)發(fā)展條件[1].20世紀(jì)80年代，廣西各地開始種植獼猴桃，引導(dǎo)農(nóng)民脫貧致富.據(jù)2021年6月統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，廣西2020年獼猴桃種植面積已達(dá)0.53萬hm2，結(jié)果面積為0.20萬hm2，年產(chǎn)量為1.5萬t；超越安徽、廣東等老產(chǎn)區(qū)，位列中國(guó)獼猴桃主栽省份的第11位[2].目前，桂林市資源縣、龍勝縣，河池市南丹縣及百色市樂業(yè)縣等地均已發(fā)展成為全國(guó)獼猴桃種植的主產(chǎn)縣區(qū).

然而，伴隨著廣西獼猴桃產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，病害問題也逐漸顯現(xiàn)[3].自2013年初，相關(guān)科研院所逐步展開了研究.陳唯王[4]、黃繼魁[5]及黃冬麗等[6]對(duì)樂業(yè)縣獼猴桃的栽培現(xiàn)狀及病害年發(fā)生動(dòng)態(tài)進(jìn)行了分析，認(rèn)為當(dāng)?shù)刂饕『楦?、褐斑病、潰瘍病及白粉病，并編制了樂業(yè)縣獼猴桃全年栽培管理與病蟲害防治月歷.莫曉云[7]分析了資源縣主要病害潰瘍病、褐斑病、根腐病及花腐病的防治技術(shù).陳艷萍[8]結(jié)合龍勝縣紅陽(yáng)獼猴桃黑斑病的癥狀及發(fā)生規(guī)律，探討了防治措施.但目前暫未見對(duì)廣西主栽區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)病害調(diào)研及鑒定的報(bào)道.

為進(jìn)一步全面了解廣西獼猴桃產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及春季病害感病情況，2021年4月，中國(guó)科學(xué)院武漢植物園聯(lián)合廣西植物研究所、廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院對(duì)桂林市資源縣和龍勝縣、河池市南丹縣及百色市樂業(yè)縣等主產(chǎn)縣園區(qū)進(jìn)行了病害調(diào)研；通過典型病害樣本采集及病原鑒定，全面分析了廣西各主栽區(qū)域的春季病害種類及致病菌類型，為當(dāng)?shù)孬J猴桃病害的預(yù)測(cè)及防治奠定了理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 感病樣本采集

2021年4月，中國(guó)科學(xué)院武漢植物園與廣西植物研究所、廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)合，對(duì)14個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行了園區(qū)春季病害調(diào)研，觀察到典型的細(xì)菌性潰瘍病、真菌性灰霉病和病毒病等癥狀.同時(shí)，采集到33份疑似感病的葉片作為實(shí)驗(yàn)材料.各采樣點(diǎn)具體地理位置見表1.

表1 14個(gè)采樣點(diǎn)的具體地理位置

1.2 病菌分離、培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 細(xì)菌性病原菌的分離及分子鑒定 取3片直徑1 cm的病健交界處的葉片組織，用75%乙醇消毒后裝入600 μL 10 mmol/L MgSO4的1.5 mL離心管中，研磨勻漿.吸取100 μL菌懸液涂布于LB平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d.各樣本3個(gè)重復(fù).挑取單菌落，采用百泰克試劑盒提取細(xì)菌基因組，用16S引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增體系為40 μL：10× PCR buffer 4 μL，5 U/ μL Taq酶0.25 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，1.10 g/mL DMSO 0.8 μL，100 μmol/L正反向引物各0.2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 31.75 μL.PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因公司測(cè)序后進(jìn)行Blast比對(duì)及同源性分析，確定菌株的分類地位.

1.2.2 真菌性病原菌的分離及分子鑒定 取3片直徑1 cm的病健交界處的葉片組織，用75%乙醇消毒后將葉片置于PDA平板上25 ℃培養(yǎng)5 d，選取菌絲尖端置于PDA平板上獲得純菌株并重新培養(yǎng)，25 ℃靜置培養(yǎng)8 d后收集菌絲.每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù).采用上海生工試劑盒提取真菌基因組，運(yùn)用ITS4/ITS5引物進(jìn)行擴(kuò)增(ITS5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG;ITS4-TCCTCCGCTTATTGATATGC)，擴(kuò)增體系與1.2.1類似，具體參照White等[9].

1.2.3 病毒檢測(cè) 取感病嫩葉0.1 g，采用液氮研磨后快速轉(zhuǎn)入裝有1 mL RNA提取緩沖液的1.5 mL離心管中，充分混勻后室溫靜置5 min，離心，將上清液用氯仿抽提2次，加入1 mL異丙醇沉淀核酸，收集沉淀物后用75%乙醇洗滌2次，風(fēng)干后溶于30 μL DEPC處理水中，提取的RNA存于-20 ℃中備用.以RNA為模板，合成cDNA第一鏈.反應(yīng)體系為20 μL，含5× 反轉(zhuǎn)錄buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，RNA酶抑制劑(40U/ μL)0.5 μL，M-MLV(200 U/μL)0.5 μL，隨機(jī)引物(100 pmol/μL)1 μL、RNA模板5 μL和DEPC處理水8 μL.隨后基于各病毒的特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析.以CLBV病毒為例，引物為(CLBV1F-AGCCATAGTTGAACCATTCCTC;CLBV5R-GCAGATCATTCACCACATGC)，PCR反應(yīng)總體系為25 μL，含10× Taq DNA聚合酶緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL，10 mmol/L正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL和滅菌去離子水18.75 μL.PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.病毒的鑒定按照鄭亞洲等[10]、朱晨熹等[11]及黃顯德等[12]方法進(jìn)行.

1.3 致病力測(cè)試

對(duì)于潰瘍病菌，制備濃度為109CFU/mL的菌懸液；對(duì)于真菌菌株，將葉片和果實(shí)的表面用75%酒精消毒后，用2號(hào)解剖針進(jìn)行針刺(果實(shí)刺傷深度2～3 mm)，制備直徑5 mm的培養(yǎng)7 d的菌餅，將菌餅接種于傷口處，菌絲面朝下，覆蓋濕棉球，并放入透明盒中密封保濕，6 d后觀察發(fā)病情況.從病斑處再次分離培養(yǎng)病菌，與原接種菌株進(jìn)行比較鑒定，確定是否符合柯赫氏法則.

2 結(jié)果與分析

2.1 感病癥狀

在廣西部分栽培園區(qū)觀察到疑似潰瘍病、灰霉病和病毒病的癥狀，如圖1所示，感病癥狀與鐘彩虹等[13]、吳水美等[14]及王然等[15]描述癥狀基本一致.疑似潰瘍病感病癥狀：葉片表面出現(xiàn)不規(guī)則形褐色斑點(diǎn)，病斑周圍伴有3～5 mm明顯的黃色暈圈.疑似灰霉病感病癥狀：被侵染的葉片從葉邊緣開始發(fā)病，病部可見大量灰白色菌絲凸起，密生灰色孢子.疑似病毒病感病癥狀：葉片上出現(xiàn)褪綠斑駁、褪綠環(huán)紋、脈黃和花葉等癥狀.

a.疑似潰瘍病癥狀；B.疑似灰霉病癥狀；C.疑似病毒病癥狀.

2.2 細(xì)菌性病菌的鑒定結(jié)果

鑒定到的細(xì)菌菌株及對(duì)應(yīng)的已報(bào)道病害見表2.河池市南丹縣園區(qū)6﹑9的樣本攜帶潰瘍病菌；樂業(yè)縣園區(qū)13的樣本攜帶潰瘍病菌.

表2 采樣點(diǎn)分離鑒定的細(xì)菌菌株及對(duì)應(yīng)已報(bào)道病害

2.3 真菌性病菌的鑒定結(jié)果及預(yù)測(cè)病害

鑒定到的真菌菌株及對(duì)應(yīng)的已報(bào)道病害見表3.桂林市龍勝縣園區(qū)4的樣本檢出果實(shí)軟腐病及灰霉病菌；河池市南丹縣園區(qū)7、8、9的樣本檢出獼猴桃黑/褐斑病菌、果實(shí)軟腐病及灰霉病菌；樂業(yè)縣園區(qū)10﹑11的樣本檢出獼猴桃炭疽病、果實(shí)軟腐病及灰霉病菌.

2.4 獼猴桃葉片的病毒檢測(cè)結(jié)果

將有明顯病毒病癥狀的獼猴桃葉片送檢，檢測(cè)結(jié)果如表4.龍勝縣園區(qū)3、4分別攜帶2、4種病毒；南丹縣園區(qū)8檢出3種病毒.

表4 采樣點(diǎn)春季樣本病毒病檢測(cè)結(jié)果列表

2.5 菌株致病力驗(yàn)證

將潰瘍病、灰霉病及褐斑病菌分別接種在葉片上，灰霉病、黑斑病、軟腐病及炭疽病菌接種于果實(shí)上.致病力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種葉片14 d及果實(shí)6 d左右發(fā)病，菌株接種后均出現(xiàn)典型感病特征，隨后在發(fā)病處重新分離到了接種的菌株，符合柯赫氏法則致病性檢測(cè).

(A,B)擬莖點(diǎn)霉菌(Phomopsis sp.)、(C,D)稻黑孢菌(N.oryzae)及灰霉菌病(E,F)(B.cinerea)分別接種在獼猴桃果實(shí)及葉片上感病癥狀.

3 結(jié)論與討論

本團(tuán)隊(duì)于2021年春季對(duì)廣西桂林市資源縣和龍勝縣、河池市南丹縣及百色市樂業(yè)縣等獼猴桃主產(chǎn)縣的代表性園區(qū)進(jìn)行病害調(diào)查，基于生物學(xué)特性及分子鑒定確定各園區(qū)的病原菌種類，預(yù)測(cè)了各園區(qū)將來可能發(fā)生的病害(表1～4)，為各園區(qū)進(jìn)行有效防治奠定了理論基礎(chǔ).病原鑒定結(jié)果表明河池市南丹縣芒場(chǎng)鎮(zhèn)(園區(qū)6)及城關(guān)鎮(zhèn)(園區(qū)9)、百色市樂業(yè)縣甘田鎮(zhèn)(園區(qū)13)感染了潰瘍病，該病一旦感染，病菌繁殖及傳播迅速，目前并無徹底根治方法，只能采取搭建避雨棚、加強(qiáng)園區(qū)管理等農(nóng)業(yè)措施，結(jié)合化學(xué)及生物防治等方式進(jìn)行控制.桂林市龍勝縣龍脊鎮(zhèn)(園區(qū)4)、河池市南丹縣城關(guān)鎮(zhèn)(園區(qū)8)、百色市樂業(yè)縣同樂鎮(zhèn)(園區(qū)11)感染了近年來產(chǎn)業(yè)中最嚴(yán)重的真菌病害——果實(shí)軟腐病，該病主要在蕾期及幼果期感染，于貯藏期逐漸顯現(xiàn)病癥，需加強(qiáng)侵染期的防治.桂林市龍勝縣龍脊鎮(zhèn)(園區(qū)4)、河池市南丹縣城關(guān)鎮(zhèn)(園區(qū)8)、百色市樂業(yè)縣同樂鎮(zhèn)(園區(qū)10)感染了灰霉?。缓映厥辛_城仫佬族自治縣東門鎮(zhèn)(園區(qū)7)、河池市南丹縣城關(guān)鎮(zhèn)(園區(qū)9)感染了黑/褐斑病；百色市樂業(yè)縣同樂鎮(zhèn)(園區(qū)11)感染了炭疽??；這些真菌病害的發(fā)生主要與園區(qū)修剪不當(dāng)、郁蔽、濕度過大有關(guān)，需根據(jù)實(shí)際情況加強(qiáng)修剪、施用吡唑醚菌酯、嘧霉胺等真菌防治藥劑.桂林市龍勝縣江底鄉(xiāng)(園區(qū)3)、桂林市龍勝縣龍脊鎮(zhèn)(園區(qū)4)及河池市南丹縣城關(guān)鎮(zhèn)(園區(qū)8)均感染2～4種病毒，可運(yùn)用抗病威、病毒克星等藥劑進(jìn)行控制.

總體而言，廣西春季病害主要為細(xì)菌性潰瘍病、真菌性軟腐病、黑/褐斑病、灰霉病、炭疽病及病毒??；按區(qū)域統(tǒng)計(jì)，南丹及樂業(yè)縣的潰瘍病發(fā)生率高，龍勝、南丹及樂業(yè)縣的真菌病害發(fā)生率高，南丹及龍勝縣的病毒病發(fā)生率高；其中南丹縣的病菌種類及檢出率最高.針對(duì)獼猴桃病害防治方面，還應(yīng)引起更多重視，采取一些防治措施，如加強(qiáng)進(jìn)行苗木帶菌檢測(cè)，建防護(hù)網(wǎng)，推廣避雨栽培，防止病原菌傳播；高壟栽培，及時(shí)清理溝渠的雜草，注意排水；注意夏季修剪及疏花疏果，保持果園通風(fēng)透光，防止種植密度過大；減少藥劑濫用；適當(dāng)晚采收.同時(shí)可嘗試發(fā)展新的紅肉但抗性強(qiáng)的品種如‘楚紅’及‘桂紅’等.目前對(duì)廣西獼猴桃的病害發(fā)生條件及病原菌侵染規(guī)律等了解還不夠，后期需進(jìn)一步進(jìn)行周年病害鑒定及發(fā)生規(guī)律研究，形成適合當(dāng)?shù)氐牟『︻A(yù)測(cè)預(yù)報(bào)系統(tǒng)，建立廣西獼猴桃病害數(shù)據(jù)資料庫(kù)，開展藥物篩選及防治效果對(duì)比研究，因地制宜地制定病害防治方案，為從整體上提高廣西獼猴桃產(chǎn)業(yè)的水平提供理論基礎(chǔ).

(致謝：感謝華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院洪霓教授團(tuán)隊(duì)協(xié)助完成病毒方面的工作.)