鄭磊 ，路佳

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的胃腸道腫瘤之一，其發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。根據(jù)最新癌癥統(tǒng)計(jì)結(jié)果，結(jié)直腸癌是世界第三大常見(jiàn)的惡性腫瘤，位居肺癌和胃癌之后［1］。30%～50%的新確診患者已進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，其 5 年生存率僅為 50%～60%［2］。腫瘤異質(zhì)性是由于單個(gè)腫瘤內(nèi)的細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的分化，導(dǎo)致的癌細(xì)胞之間遺傳和分子特征的差異［3］，其在癌癥的形成和發(fā)展過(guò)程中起重要作用。結(jié)直腸癌具有高度異質(zhì)性，傳統(tǒng)的研究方法僅能對(duì)整個(gè)腫瘤組織進(jìn)行分析，無(wú)法在單細(xì)胞水平比較腫瘤內(nèi)的差異［4］。單細(xì)胞分離和測(cè)序技術(shù)以單個(gè)細(xì)胞為研究對(duì)象，能夠?qū)?xì)胞異質(zhì)性進(jìn)行較為深入的研究［5］。單細(xì)胞分離技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)使得解析腫瘤組織的異質(zhì)性分子特征成為可能，可應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域［6］。此外，它還可用于發(fā)現(xiàn)異常增生的細(xì)胞類(lèi)型，以尋找結(jié)直腸癌新的發(fā)病機(jī)制［7］。本文對(duì)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及其在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)綜述。

1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介

根據(jù)樣本類(lèi)型，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可分為單細(xì)胞基因組測(cè)序和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了不同的方法進(jìn)行單細(xì)胞捕獲和文庫(kù)構(gòu)建，每種方法均有各自的技術(shù)特點(diǎn)。單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)中的多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)能夠?qū)Ψ蛛x的單細(xì)胞中的微量全基因組DNA進(jìn)行高效擴(kuò)增，獲得高覆蓋率的完整的基因組后進(jìn)行高通量測(cè)序。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù) Smart-seq2、液滴測(cè)序（Drop-seq）、10×Genomics 等能夠滿足高靈敏度、低偏好性的cDNA擴(kuò)增，具有一定的應(yīng)用前景。

1.1 單細(xì)胞測(cè)序樣本制備 單細(xì)胞樣本制備主要有細(xì)胞團(tuán)及組織獲取、細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞分類(lèi)、單細(xì)胞分散到獨(dú)立容器4個(gè)步驟。不同的樣本類(lèi)型制備單細(xì)胞的方法各不相同，單細(xì)胞捕獲質(zhì)量決定了單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的通量和成本。單細(xì)胞捕獲最初采用纖維吸取或激光捕獲顯微分離技術(shù)分離單個(gè)細(xì)胞，特定類(lèi)型的單細(xì)胞也可以通過(guò)熒光激活細(xì)胞分類(lèi)術(shù)（fluorescent activated cell sorting，F(xiàn)ACS）分離到孔板中?；谖⒖谆蛞旱蔚奈⒘骺馗咄糠椒―rop-seq利用微流控裝置將帶有條形碼的微珠和細(xì)胞一起裝入微液滴，將液滴分割成納升大小的反應(yīng)室，條形碼隨后會(huì)連接到反轉(zhuǎn)錄后的cDNA上，由此可檢測(cè)數(shù)以千計(jì)的細(xì)胞，提高了分離細(xì)胞的通量和效率［8］。

通過(guò)單細(xì)胞捕獲后得到的單個(gè)細(xì)胞懸液可進(jìn)行相應(yīng)細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞原代培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型選擇相應(yīng)的培養(yǎng)條件。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的低代次的細(xì)胞在細(xì)胞狀態(tài)上基本與體內(nèi)性狀差異不大，而且可以有效去除前期分散處理過(guò)程中的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，恢復(fù)一定的細(xì)胞活力。經(jīng)過(guò)原代培養(yǎng)后，可通過(guò)顯微鏡挑取單細(xì)胞于EP 管中，或通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，選擇活力好的細(xì)胞群，分選單細(xì)胞于96孔板中，用于單細(xì)胞測(cè)序分析［9］。

1.2 單細(xì)胞建庫(kù)及測(cè)序

1.2.1 單細(xì)胞全基因組建庫(kù)測(cè)序 由于人類(lèi)單個(gè)二倍體細(xì)胞中能分離出的DNA含量極少，因此需要進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification，WGA），以滿足高通量測(cè)序的樣本量需求［9］。在單細(xì)胞全基因組建庫(kù)及測(cè)序中，WGA是其關(guān)鍵步驟。常用的WGA 技術(shù)有：（1）簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）。DOP-PCR 是一種特殊的PCR，由于是指數(shù)擴(kuò)增，因此對(duì)細(xì)胞基因組的物理覆蓋率一般低于10%［10］。（2）多重置換擴(kuò)增（MDA）。MDA 是一種利用phi29聚合酶對(duì)基因組進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增的技術(shù)，對(duì)單細(xì)胞基因組或外顯子組物理覆蓋率大于90%［10］，解決了基于PCR 擴(kuò)增帶來(lái)的偏倚。（3）Nucseq。Nuc-seq是2014年由Wang等［11］開(kāi)發(fā)的全基因組和外顯子組單細(xì)胞測(cè)序方法，該方法通過(guò)檢測(cè)G2/M期細(xì)胞核，使細(xì)胞基因組平均覆蓋率達(dá)到了91%。

1.2.2 單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)及測(cè)序 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)過(guò)程為：捕獲和裂解單個(gè)細(xì)胞，將釋放的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后通過(guò)多聚胸腺嘧啶、T 重復(fù)寡核苷酸啟動(dòng)方法進(jìn)行擴(kuò)增，以構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。雙鏈cDNA 合成可直接通過(guò)PCR 實(shí)現(xiàn)，但可能引入擴(kuò)增偏差。因此，科學(xué)家們利用莫洛尼鼠白血病病毒轉(zhuǎn)錄酶的鏈轉(zhuǎn)換活性開(kāi)發(fā)了模板切換技術(shù)，包括STRT-seq 和 SMART-seq/Smart-seq2，以減少 3'覆蓋偏差。其他方法如CEL-seq、CEL-seq2 和MARS-seq，通過(guò)將T7啟動(dòng)子并入寡核苷酸引物中，在第二鏈合成后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄以線性擴(kuò)增。在Illumina 測(cè)序平臺(tái)上制備測(cè)序文庫(kù)也需要片段化和適配器合并［12］。

單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可進(jìn)行3'、5'端和全長(zhǎng)測(cè)序，需根據(jù)研究目的選擇合適的測(cè)序平臺(tái)。全長(zhǎng)測(cè)序方法如Smart-seq2，在基因表達(dá)檢測(cè)中顯示出更高的靈敏度，并且能夠檢測(cè)剪接轉(zhuǎn)錄變體和T/B 細(xì)胞受體（TCR/BCR）序列［13］。該技術(shù)的通量較低，成本較高，而InDrop、Drop-seq 或10×Chromium 等3'端測(cè)序方法，可同時(shí)取樣數(shù)千個(gè)細(xì)胞，更適合于細(xì)胞類(lèi)型和標(biāo)記的鑒定。既往研究表明，測(cè)序深度可能會(huì)影響靈敏度，但不會(huì)明顯影響細(xì)胞分型的準(zhǔn)確性［13］。一般而言，每個(gè)細(xì)胞讀取50 000次就足以進(jìn)行無(wú)偏差細(xì)胞聚類(lèi)和標(biāo)記識(shí)別。

2 單細(xì)胞測(cè)序在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用

腫瘤異質(zhì)性是癌癥診斷和治療的關(guān)鍵。由于腫瘤組織是不同細(xì)胞的混合體，因此傳統(tǒng)測(cè)序通常難以對(duì)癌癥患者的腫瘤組織進(jìn)行異質(zhì)性分析。單細(xì)胞測(cè)序使基因表達(dá)譜在細(xì)胞水平上得以實(shí)現(xiàn)，是研究結(jié)直腸癌異質(zhì)性的重要手段，能夠?yàn)榻Y(jié)直腸癌的防治提供新的思路。

2.1 結(jié)直腸癌分型 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能通過(guò)鑒定單個(gè)腫瘤細(xì)胞中的基因組改變和特有轉(zhuǎn)錄組水平來(lái)研究腫瘤異質(zhì)性，因此單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌中的基因表達(dá)水平，對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行分型。Dai 等［14］對(duì)1 例Ⅲ期結(jié)直腸癌患者癌組織中的2 824個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，并通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)⑵渚垲?lèi)為5 個(gè)不同的簇，發(fā)現(xiàn)每個(gè)簇的基因具有不同的功能且富集到不同的基因本體術(shù)語(yǔ)中，各個(gè)簇之間表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性，即每個(gè)簇能代表一種結(jié)直腸癌的分子類(lèi)型。Zhang 等［3］通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)來(lái)自結(jié)直腸癌患者的肝轉(zhuǎn)移癌組織和癌旁正常組織，共鑒定出6種細(xì)胞類(lèi)型的12個(gè)簇，包括癌細(xì)胞、T 細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和B細(xì)胞。Li等［15］對(duì)來(lái)自11例結(jié)直腸癌患者的969個(gè)原發(fā)腫瘤細(xì)胞和7 例癌旁正常黏膜的622 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，參考成分分析（RCA），獲得了7個(gè)不同的細(xì)胞簇，分別為上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、肥大細(xì)胞和髓樣細(xì)胞。此外，通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的差異表達(dá)基因和通過(guò)批量分析鑒定得到的差異表達(dá)基因一致，但在單細(xì)胞測(cè)序中鑒定出的一些差異表達(dá)基因在批量分析中未被檢測(cè)到，表明單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能更全面地檢測(cè)患者的基因表達(dá)情況，進(jìn)而在分子基礎(chǔ)上對(duì)患者進(jìn)行分型。因此，通過(guò)對(duì)腫瘤單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行研究，可以進(jìn)一步完善現(xiàn)有的結(jié)直腸癌分類(lèi)系統(tǒng)，有助于提出新的結(jié)直腸癌分子分型模型。

2.2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）是在癌癥患者的血液中發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞，該細(xì)胞具有完整的核，表達(dá)細(xì)胞角蛋白，但不表達(dá)CD45（白細(xì)胞標(biāo)記，可以作為CTC 篩選的分子標(biāo)記）。研究表明，CTC 不僅與臨床病理特征相關(guān)，還具有預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值［16］。用于CTC分析的結(jié)直腸癌患者血液來(lái)源包括腸系膜、門(mén)靜脈或外周靜脈血。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，結(jié)直腸癌患者的CTC可進(jìn)行基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上的多角度基因表達(dá)分析。例如，比較基因組雜交技術(shù)可以在單個(gè)CTC 中分析 DNA 拷貝數(shù)的變異［17］。CTC 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，在將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，需要進(jìn)行擴(kuò)增，然后使用微陣列或下一代測(cè)序進(jìn)行基因表達(dá)分析［16］。Wang 等［17］開(kāi)發(fā)了新的單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)ChimeraX?-i120，利用該平臺(tái)檢測(cè)CTC 具有高靈敏度、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性的優(yōu)勢(shì)，在結(jié)直腸癌中，CTC陽(yáng)性檢出率超過(guò)60%，而在健康人血液中很少發(fā)現(xiàn)CTC。在 Heitzer 等［18］研究中，從 6 例晚期結(jié)直腸癌患者的血液樣本中分離出了CTC，并將原發(fā)腫瘤的基因組圖譜與每例患者的肝轉(zhuǎn)移和CTC圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在CTC 與原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶間，一些基因，特別是已知的結(jié)直腸癌驅(qū)動(dòng)基因（如KRAS、APC、PIK3CA）的拷貝數(shù)變化具有相似之處。通過(guò)對(duì)原發(fā)灶和相應(yīng)的肝轉(zhuǎn)移組織進(jìn)行深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)，CTC 中的特有突變?cè)谠l(fā)和轉(zhuǎn)移組織中也存在亞克隆水平突變。這些研究表明了分離和表征CTC 的重要性，因其攜帶了癌癥患者疾病發(fā)展過(guò)程中形成的突變，可以作為液體活檢來(lái)監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)，也有助于患者的個(gè)體化治療。然而，CTC 不一定攜帶與原發(fā)腫瘤相同的突變，這種不一致性可能是結(jié)直腸癌患者對(duì)化療反應(yīng)存在差異的原因。隨著研究的發(fā)展，未來(lái)CTC將可能用于推進(jìn)結(jié)直腸癌的個(gè)性化治療以及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)。

2.3 結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的研究 結(jié)直腸癌的高轉(zhuǎn)移率是導(dǎo)致患者死亡的重要原因［19］,但目前已批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的靶向治療方法不多，且已知的靶向藥物對(duì)于BRAF 和PIK3CA 等基因的突變療效甚微［20］。選擇何種技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的復(fù)雜特性進(jìn)行研究成為開(kāi)發(fā)新的診斷標(biāo)志物和藥物治療靶點(diǎn)的關(guān)鍵［21］。與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相比，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型提供特異的診斷和預(yù)后標(biāo)志物以及個(gè)體化抗癌藥物的治療靶點(diǎn)。Bian等［22］在2018 年建立了單細(xì)胞三體組測(cè)序（scTrioseq）技術(shù)，該技術(shù)能夠從單個(gè)細(xì)胞層面同時(shí)檢查突變、轉(zhuǎn)錄和甲基化；該研究對(duì)來(lái)自10 例結(jié)直腸癌患者（Ⅲ或Ⅳ期）的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行了scTrioseq測(cè)序，為研究腫瘤進(jìn)化與基因譜系相關(guān)的表觀改變提供了新的方法，并證實(shí)了在譜系中DNA甲基化水平表現(xiàn)出一致的上調(diào)或下調(diào)，而在各個(gè)譜系之間DNA甲基化的上下調(diào)趨勢(shì)可能存在較大差異。Ono等［23］對(duì)來(lái)自小鼠結(jié)直腸癌模型中的200個(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞外顯子組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以鑒定腫瘤異質(zhì)性，并研究了單個(gè)細(xì)胞如何產(chǎn)生腫瘤異質(zhì)性；該研究從體外培養(yǎng)的類(lèi)器官中分離單個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞，移植到小鼠體內(nèi)，成瘤后行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)由于出現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄亞群，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的異質(zhì)性有所升高，這些亞群抑制了間充質(zhì)標(biāo)記基因的表達(dá)，說(shuō)明新的細(xì)胞亞群具有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特性；同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，在具有類(lèi)似表達(dá)特征的人類(lèi)患者中，結(jié)直腸癌有顯著的轉(zhuǎn)移趨勢(shì)，揭示了結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移時(shí)腫瘤細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化機(jī)制。Leung 等［24］利用單細(xì)胞DNA 測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中存在二次轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，說(shuō)明腫瘤轉(zhuǎn)移灶仍然處于不穩(wěn)定狀態(tài)。王智鋒［25］利用單細(xì)胞測(cè)序檢測(cè)結(jié)直腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的突變情況，發(fā)現(xiàn)SMAD4基因的突變是驅(qū)動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因；此外，這項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶中存在與細(xì)胞有絲分裂檢查點(diǎn)調(diào)控相關(guān)基因DLG2的突變，說(shuō)明轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞仍然保留侵襲能力。因此，利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)鑒定結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中關(guān)鍵的分子特征具有重要的研究?jī)r(jià)值。

2.4 結(jié)直腸癌化療耐藥性機(jī)制探索 化療耐藥性是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要因素，化療耐藥細(xì)胞的形成通常歸因于治療前后腫瘤中罕見(jiàn)的耐藥性克?。?6］。這些具有耐藥性的結(jié)直腸癌細(xì)胞能夠破壞藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，使細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程失調(diào)，通過(guò)遺傳或表觀遺傳修飾改變患者的藥物敏感性和治療靶點(diǎn)［27］。根據(jù)基因表達(dá)、表觀遺傳學(xué)、通路特征和治療反應(yīng)來(lái)研究化療耐藥性癌細(xì)胞，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)［27-28］。

常規(guī)轉(zhuǎn)錄組研究可以挖掘化療耐藥有關(guān)的基因表達(dá)特征，但得到的結(jié)果只能體現(xiàn)組織水平的平均情況，忽略了基因表達(dá)的細(xì)胞特異性［29］。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析能夠研究單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，更適合于細(xì)胞特異性精確治療。Chen 等［30］研究證實(shí)了單細(xì)胞RNA測(cè)序能夠表征類(lèi)器官中4種不同類(lèi)型的細(xì)胞亞型的耐藥能力，包括奧沙利鉑治療后的藥物誘導(dǎo)組、藥物不敏感組、藥物敏感組和藥物超敏感組；單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果顯示，對(duì)腫瘤類(lèi)器官進(jìn)行藥物治療會(huì)引起不同亞型間的差異反應(yīng)，藥物不敏感組細(xì)胞占所有4 組細(xì)胞的百分比在藥物治療后有所增加，而藥物敏感組治療后細(xì)胞百分比降低；對(duì)這些亞型進(jìn)行差異表達(dá)基因及通路富集分析，進(jìn)而通過(guò)聚類(lèi)對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行詳細(xì)分類(lèi)，能夠更好地為可能或已經(jīng)表現(xiàn)出化療耐藥性的結(jié)直腸癌患者選擇治療方案。由此可見(jiàn)，單細(xì)胞RNA測(cè)序有望用于預(yù)測(cè)抗腫瘤藥物的有效性，進(jìn)而指導(dǎo)用藥，甚至用于預(yù)防化療耐藥。

2.5 腫瘤微環(huán)境與免疫治療 腫瘤微環(huán)境由多種類(lèi)型細(xì)胞組成，包括免疫細(xì)胞、炎性細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，以及腫瘤內(nèi)部和周?chē)姆羌?xì)胞成分。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞成分已經(jīng)成為腫瘤進(jìn)展、器官特異性轉(zhuǎn)移和治療反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞是免疫治療的關(guān)鍵［31］。由于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）可直接影響預(yù)后和對(duì)免疫治療的反應(yīng)而受到極大關(guān)注［32］。多項(xiàng)研究表明，通過(guò)免疫評(píng)分策略，TIL 的類(lèi)型、位置和豐度可用于預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者的總體生存期和無(wú)進(jìn)展生存期［33］。在原發(fā)性人類(lèi)腫瘤中基于單細(xì)胞測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組分析不僅揭示了T 細(xì)胞異質(zhì)性，而且通過(guò)整合轉(zhuǎn)錄組和T 細(xì)胞受體的分析闡明了T 細(xì)胞群之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系，為預(yù)測(cè)免疫治療療效和患者預(yù)后提供了證據(jù)［34］。Zacharakis 等［35］對(duì) 1 例晚期乳腺癌患者的腫瘤細(xì)胞的全基因組進(jìn)行測(cè)序，從腫瘤細(xì)胞里尋找能夠識(shí)別突變基因及其表達(dá)蛋白的TILs，經(jīng)過(guò)篩選，將能夠有效識(shí)別4 種突變的TIL 進(jìn)行體外擴(kuò)增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)免疫治療方案，取得了良好的療效，患者在治療22 個(gè)月后腫瘤組織全部清除。由此可見(jiàn)，腫瘤微環(huán)境的研究能夠?yàn)槟[瘤患者提供一種有效的治療手段。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境研究具有重要作用。Zhang 等［32］通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)獲得了11 138 個(gè)單個(gè)T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，開(kāi)發(fā)了STARTRAC（single T cell analysis by RNA sequencing and TCR tracking）的生物信息學(xué)分析方法，定量分析具有不同功能和克隆性的20 個(gè)T 細(xì)胞亞群之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系，進(jìn)而利用該方法對(duì)12例結(jié)直腸癌患者的癌組織、癌旁組織以及外周血中的20類(lèi)不同類(lèi)型T 細(xì)胞進(jìn)行追蹤，揭示了T 細(xì)胞的組織分布特性、克隆增生、遷移和狀態(tài)轉(zhuǎn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了結(jié)直腸癌獨(dú)特的TIL 細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)除腫瘤微環(huán)境外，TCR 也會(huì)影響腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+效應(yīng)記憶T 細(xì)胞向“耗竭性T 細(xì)胞”和效應(yīng)T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［32］，這是目前國(guó)際上對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中單個(gè)T細(xì)胞規(guī)模最全面深入的研究。通過(guò)對(duì)原發(fā)性結(jié)直腸癌和對(duì)應(yīng)的正常結(jié)直腸黏膜組織細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，Li等［36］開(kāi)發(fā)了RCA算法，鑒定了兩種不同的結(jié)直腸癌相關(guān)成纖維細(xì)胞亞型，發(fā)現(xiàn)通過(guò)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分為同一亞型的患者具有不同的生存率，大大提高了這種算法在預(yù)測(cè)預(yù)后中的價(jià)值。de Vries 等［37］分別在結(jié)直腸癌組織、腫瘤相關(guān)淋巴結(jié)、正常黏膜組織和結(jié)直腸癌患者外周血樣本中，通過(guò)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在單細(xì)胞水平檢測(cè)36種免疫標(biāo)記物的表達(dá)，揭示了各種免疫細(xì)胞在不同樣本中的分布情況。Zhang 等［34］使用 Smart-seq2 和 10×Genomics 兩種單細(xì)胞測(cè)序方法分析人類(lèi)原發(fā)性結(jié)直腸癌的免疫和基質(zhì)細(xì)胞群，揭示了結(jié)直腸癌內(nèi)髓系T 細(xì)胞和髓系間質(zhì)的聯(lián)系，為進(jìn)一步探索腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞提供了一種新的思路。除免疫T 細(xì)胞外，結(jié)直腸癌中B細(xì)胞特征的研究也能為結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中的免疫生態(tài)系統(tǒng)提供新見(jiàn)解。由于胃腸黏膜的免疫系統(tǒng)長(zhǎng)期暴露于食物性抗原和細(xì)菌中，胃腸黏膜抗原驅(qū)動(dòng)的免疫保護(hù)主要?dú)w因于產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞和漿細(xì)胞。Wang 等［38］通過(guò)對(duì)結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤和鄰近正常黏膜組織的約6 000 個(gè)免疫細(xì)胞進(jìn)行全長(zhǎng)Smartseq2 分析發(fā)現(xiàn)，IgA+免疫球蛋白Lambda 恒定區(qū)2+（IGLC2+）漿細(xì)胞與結(jié)直腸癌預(yù)后不良有關(guān)，而以往研究忽視了分化為IgA+IGLC2+漿細(xì)胞的B 細(xì)胞亞型在癌組織和非癌組織中的異質(zhì)性，導(dǎo)致不同結(jié)直腸癌中 B 細(xì)胞的研究結(jié)果存在差異。Zhou 等［39］對(duì) 21例微衛(wèi)星穩(wěn)定結(jié)直腸癌患者和6例無(wú)癌老年人進(jìn)行了單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境和正常組織中的免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中普遍存在體細(xì)胞拷貝數(shù)改變（SCNA），腫瘤中SCNA 的成纖維細(xì)胞比例遠(yuǎn)高于鄰近正常組織的比例（11.1%～47.7%vs.1.1%～10.6%）。此外，研究鑒定出5 個(gè)基因：BGN、RCN3、TAGLN、MYL9和TPM2，其作為成纖維細(xì)胞特異性的生物標(biāo)志物，如表達(dá)上調(diào)預(yù)示預(yù)后較差。這些研究表明，未來(lái)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠在探索免疫細(xì)胞多樣性、研究免疫治療機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

3 展望

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在細(xì)胞水平探索結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，將成為今后研究的熱點(diǎn)。在基礎(chǔ)研究方面，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠揭示結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中不同類(lèi)型細(xì)胞的突變、表達(dá)、表觀水平的變化，進(jìn)一步闡明結(jié)直腸癌形成的分子機(jī)制。在臨床研究方面，運(yùn)用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)篩選和驗(yàn)證大量腫瘤異質(zhì)性相關(guān)的變異，既可以發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)，又可以開(kāi)發(fā)出針對(duì)個(gè)體化藥物敏感性的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，為開(kāi)發(fā)精準(zhǔn)和個(gè)性化的癌癥治療方法提供關(guān)鍵信息。盡管目前單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)仍處于發(fā)展階段，有關(guān)結(jié)直腸癌單細(xì)胞測(cè)序方面的公開(kāi)研究較少，但隨著大規(guī)?；A(chǔ)和臨床研究的逐漸深入，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)會(huì)對(duì)癌癥患者的治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。