賀修寶，胡小梅，郭雅婧△

乳腺癌的發(fā)病率居全球女性惡性腫瘤的首位，且在我國的發(fā)病率逐年增高［1］?；瘜W療法作為乳腺癌的輔助治療方法，廣泛應用于不同病情程度患者的術前或術后治療，有利于限制腫瘤進展，延長患者生存期，然而其缺乏靶向性，且最終會產生耐藥，影響治療有效性［2-3］。低頻超聲聯(lián)合微泡（LFUSMB）是近年出現(xiàn)的一項治療技術，微泡可在低頻超聲下破裂產生空化作用，增加破裂處血管及細胞膜的通透性，提高藥物傳遞效率，具有針對性和非侵入性，在腫瘤治療中具有應用前景［4］。研究顯示，LFUSMB可提高甲狀腺癌細胞中活性氧（ROS）水平，促進自噬性死亡的發(fā)生，并抑制黑色素瘤B16 細胞的生長［5-6］。Chen 等［7］發(fā)現(xiàn)，LFUSMB 可克服結直腸癌細胞的耐藥性，降低耐藥蛋白腺苷三磷酸結合盒家族蛋白G 成員2（ABCG2）表達，提高卟啉/喜樹堿/氟尿苷對癌細胞的殺傷作用，但其在乳腺癌中的作用機制仍不清楚。本研究通過探討LFUSMB 對乳腺癌MCF-7/阿霉素（ADR）細胞耐藥性的影響并探究其機制，以期為乳腺癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7/ADR 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。阿霉素（ADR，純度＞98.0%）購自美國Sigma 公司；磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）活化劑 740 YP 購自MCE公司；MCF細胞專用培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；微泡對比劑Sonovue購自意大利Bracco公司；兔抗人P糖蛋白（P-gp）、p-PI3K、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT抗體，小鼠抗人β-actin、抗多藥耐藥蛋白（MRP）2、乳腺癌抗性蛋白（BCRP/ABCG2）抗體及羊抗兔、羊抗小鼠或兔IgG 抗體均購自美國Abcam 公司；小鼠抗人MRP1、PI3K 抗體均購自Santa Cruz Biotechnology 公司；CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；低頻超聲治療系統(tǒng)購自美國Philips 公司；電泳儀、酶標儀購自美國BioRad公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將MCF-7/ADR 細胞解凍后離心，采用含1 mg/L ADR 的MCF 細胞培養(yǎng)基懸浮細胞以維持ADR 耐藥性，于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中復蘇培養(yǎng)，1周傳代3次，收集第3代對數(shù)生長期的MCF-7/ADR細胞計數(shù)后進行實驗。

1.3 CCK-8法篩選LFUSMB作用時間 將1.2中對數(shù)生長期的 MCF-7/ADR 細胞制備為 5×105個/mL 的懸浮液，接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿中（2 mL/皿），加入1 mL MCF 細胞培養(yǎng)基（含1 mg/L ADR）和30%微泡對比劑混勻。將培養(yǎng)皿置于脫氣無菌水填充的水箱中，用超聲探頭在距培養(yǎng)皿底部1 cm處進行輻射處理即超聲處理。超聲設置［8］：頻率1 MHz，強度1.0 W/cm2，效率70%。將未經LFUSMB 處理的細胞（未超聲處理組）和上述經超聲處理10 s、30 s、60 s、90 s 的細胞（LFUSMB 10 s組、LFUSMB 30 s 組、LFUSMB 60 s 組、LFUSMB 90 s 組）制備5×104個/mL的懸浮液，接種于96孔板（100 μL/孔），加入MCF細胞培養(yǎng)基（含1 mg/L ADR）。培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標儀測量各孔在450 nm處的吸光度值（A450），細胞活性=［（A450超聲處理組-A450空白組）（/A450未超聲處理組-A450空白組）］×100%。

1.4 CCK-8 法測定ADR 對MCF-7/ADR 細胞的半抑制濃度（IC50） 對數(shù)生長期的MCF-7/ADR 細胞接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿中（1×106個/皿）培養(yǎng)，分為LFUSMB 30 s 組（按照1.3 中方法采用LFUSMB干預30 s）和未超聲處理組（不經LFUSMB干預），干預后收集細胞制備5×104個/mL 的懸浮液，接種于96孔板（100 μL/孔），加入含終質量濃度0、1、5、10、20、30、40、50、60、70 mg/L ADR的MCF細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，按照1.3中方法檢測各組細胞活性，繪制藥物抑制擬合曲線圖并計算ADR 對MCF-7/ADR 細胞的IC50。相對耐藥逆轉倍數(shù)=IC50（LFUSMB 30 s組）/IC5（0未超聲處理組）。

1.5 細胞分組及處理 對數(shù)生長期的MCF-7/ADR 細胞接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿中（1×106個/皿）。對照（C）組：采用MCF細胞培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；ADR 組：采用加入ADR（終質量濃度20 mg/L）的MCF 細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；LFUSMB+ADR 組：采用加入ADR（終質量濃度20 mg/L）的MCF 細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)并經LFUSMB 處理 30 s；另外，為探究 PI3K/AKT 通路對 MCF-7/ADR 細胞耐藥性的作用，設置LFUSMB+ADR+740 YP（PI3K/AKT通路激活劑）組：采用加入ADR（終質量濃度20 mg/L）和740 YP（終質量濃度50 mg/L）的MCF 細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)并經LFUSMB處理30 s，按上述分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞進行檢測。每組重復6次。

1.6 Annexin V-FIFC/PI 法檢測凋亡率 取1.5 各組MCF-7/ADR 細胞經胰酶消化后，按照Annexin V-FIFC/PI 試劑盒操作，調整細胞含量為5×105個/mL，加入500 μL 平衡試劑將細胞重懸，依次加入10 μL的Annexin V-FIFC和PI混勻后避光孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 Western blot 檢測蛋白表達 取1.5各組MCF-7/ADR 細胞經胰酶消化、裂解液裂解后，離心保留上清，BCA試劑盒測蛋白濃度。分別取30 μg 蛋白質進行SDS-PAGE 電泳分離，電泳結束后轉印至PVDF膜。經奶粉封閉后，加入一抗，包括β-actin小鼠單抗（1∶2 000）、P-gp兔單抗（1∶1 000）、MRP1小鼠單抗（1∶2 000）、MRP2 小鼠單抗（1∶2 000）、BCRP/ABCG2小鼠單抗（1∶1 000）、PI3K 小鼠單抗（1∶1 000）、AKT 兔多抗（1∶2 000）、p-PI3K 兔單抗（1∶1 000）以及 p-AKT 兔多抗（1∶2 000）4 ℃孵育過夜，洗膜后加入羊抗小鼠或兔二抗（1∶3 000）孵育1 h，洗膜后加入ECL 發(fā)光液顯影拍照，用目的蛋白和β-actin內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用GrapdhPad 8.0或SPSS 24.0進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行Bonferroni-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LFUSMB 對MCF-7/ADR 細胞活力的影響 未超聲處理組、LFUSMB 10 s 組、LFUSMB 30 s 組、LFUSMB 60 s 組、LFUSMB 90 s 組 MCF-7/ADR 細胞活 性 分 別 為（100.00±0.05）% 、（97.20±3.67）% 、（93.56±4.95）%、（83.04±3.64）%、（57.58±3.81）%（n=6，F(xiàn)=136.296，P＜0.01）。與未超聲處理組比較，LFUSMB 60 s組、LFUSMB 90 s組細胞活性顯著降低（P＜0.05），LFUSMB 10 s 組、LFUSMB 30 s 組細胞活性無顯著變化（P＞0.05）。后續(xù)采用LFUSMB 干預30 s進行研究。

2.2 LFUSMB 對細胞耐藥性的影響 LFUSMB 30 s組ADR 對MCF/ADR 細胞的IC5（05.74 mg/L）低于未超聲處理組（47.06 mg/L），相對耐藥逆轉倍數(shù)約為8.20倍，見圖1。

Fig.1 The effect of LFUSMB on the drug resistance of MCF-7/ADR cells圖1 LFUSMB對MCF-7/ADR細胞耐藥性的影響

2.3 LFUSMB對細胞凋亡率的影響 C組、ADR組、LFUSMB+ADR 組MCF-7/ADR 細胞凋亡率分別為（1.78±0.54）%、（13.15±1.65）%、（67.59±3.71）%（n=6，F(xiàn)=1 327.427，P＜0.01），見圖2。ADR 組細胞凋亡率較C組增高，LFUSMB+ADR 組細胞凋亡率較ADR組進一步增高（P＜0.05）。

Fig.2 The effect of LFUSMB on the apoptosis rate of MCF-7/ADR cells圖2 LFUSMB對MCF-7/ADR細胞凋亡率的影響

2.4 LFUSMB 對 MCF-7/ADR 細胞中 MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白表達的影響 ADR 組細胞MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白表達水平較C 組無明顯變化 ，LFUSMB+ADR 組 細 胞 MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白表達水平較 C 組和ADR組顯著下調（P＜0.05），見圖3、表1。

Fig.3 MRP1,MRP2,P-gp and BCRP/ABCG2 protein expressions detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表達

Tab.1 Comparison of MRP1,MRP2,P-gp and BCRP/ABCG2 protein expressions between the three groups of MCF-7/ADR cells表1 3組MCF-7/ADR細胞MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表達比較 （n=6，）

Tab.1 Comparison of MRP1,MRP2,P-gp and BCRP/ABCG2 protein expressions between the three groups of MCF-7/ADR cells表1 3組MCF-7/ADR細胞MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表達比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與ADR組比較，P＜0.05

組別C組ADR組LFUSMB+ADR組F MRP1 1.86±0.05 1.83±0.07 0.79±0.04ab 742.467＊＊MRP2 1.01±0.09 0.97±0.06 0.42±0.03ab 155.286＊＊P-gp 1.26±0.07 1.23±0.08 0.74±0.06ab 102.966＊＊BCRP/ABCG2 1.95±0.10 1.97±0.09 0.82±0.05ab 378.612＊＊

2.5 LFUSMB對MCF-7/ADR細胞PI3K/AKT通路蛋白表達的影響 ADR 組細胞p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT較C組無明顯變化，LFUSMB+ADR組細胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT較C組和ADR組顯著降低（P＜0.05），見圖4、表2。

Fig.4 The protein expression of PI3K/AKT pathway detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測PI3K/AKT通路蛋白表達

Tab.2 Comparison of PI3K/AKT pathway protein expression between the three groups of MCF-7/ADR cells表2 3組MCF-7/ADR細胞PI3K/AKT通路蛋白表達比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of PI3K/AKT pathway protein expression between the three groups of MCF-7/ADR cells表2 3組MCF-7/ADR細胞PI3K/AKT通路蛋白表達比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與ADR組比較，P＜0.05

組別C組ADR組LFUSMB+ADR組F p-PI3K/PI3K 0.46±0.09 0.44±0.06 0.21±0.03ab 27.571＊＊p-AKT/AKT 0.57±0.08 0.58±0.05 0.13±0.02ab 127.807＊＊

2.6 PI3K/AKT 通路激活劑對LFUSMB 干預后MCF-7/ADR 細胞凋亡及MRP1、MRP2、P-gp、BCRP蛋白表達的影響 與LFUSMB+ADR 組比較，LFUSMB+ADR+740 YP 組 MCF-7/ADR 細 胞凋 亡 率顯著降低，MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白水平顯著增高（P＜0.05），見圖5、表3。

Fig.5 The MRP1,MRP2,P-gp and BCRP/ABCG2 protein expressions detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表達

Tab.3 Comparison of MCF-7/ADR cell apoptosis rate and MRP1,MRP2,P-gp,BCRP/ABCG2 protein expressions beteween the 3 groups表3 3組MCF-7/ADR細胞凋亡率及MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表達比較 （）

Tab.3 Comparison of MCF-7/ADR cell apoptosis rate and MRP1,MRP2,P-gp,BCRP/ABCG2 protein expressions beteween the 3 groups表3 3組MCF-7/ADR細胞凋亡率及MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表達比較 （）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與LFUSMB+ADR組比較，P＜0.05

組別C組LFUSMB+ADR組LFUSMB+ADR+740 YP組F n6 6 6凋亡率（%）2.40±0.05 81.20±9.64a 19.80±2.05ab 317.564＊＊MRP1 1.23±0.11 0.19±0.02a 1.01±0.08ab 286.095＊＊MRP2 1.29±0.08 0.34±0.03a 1.05±0.07ab 360.049＊＊P-gp 1.34±0.10 0.28±0.04a 1.13±0.09ab 287.848＊＊BCRP/ABCG2 1.57±0.09 0.39±0.03a 1.38±0.08ab 469.208＊＊

3 討論

目前對乳腺癌等腫瘤廣泛采用化學療法，隨著治療的進行，最終腫瘤細胞會對化療藥物產生繼發(fā)性耐藥，從而限制其療效［9］。因此尋找改善腫瘤耐藥性的新治療策略至關重要。低頻超聲通常小于5 W/cm2，是一種物理刺激，作為對比劑的微泡可以增加病灶檢測的圖像對比度，兩者聯(lián)合用于治療時可通過聲孔效應增強細胞膜和血管系統(tǒng)的滲透，靶向特異性位點傳遞藥物，增強藥物或基因傳遞，改善細胞對藥物的攝取，進而提高治療功效［10-11］。但是，除提高細胞膜通透性外，是否涉及其他機制并不清楚。Qu 等［8］研究顯示，強度 1.0 W/cm2，頻率 1 MHz的超聲聯(lián)合30%微氣泡為MCF-7/ADR 細胞的最佳作用參數(shù)，本研究采用上述參數(shù)作用MCF-7/ADR細胞60 s 時，觀察到細胞活性為（83.04±3.64）%，與上述研究觀察到的活性（82.91±2.83）%相近，作用30 s時細胞活性為（93.56±4.95）%，對MCF-7/ADR 細胞的毒性較小，后續(xù)按照上述參數(shù)采用LFUSMB 干預30 s 進行研究。洪麗杰等［12］發(fā)現(xiàn)，LFUSMB 可抑制卵巢癌細胞在裸鼠中的生長。武雨琦等［13］研究顯示，LFUSMB 可逆轉前列腺癌對紫杉醇的耐藥性。本研究結果顯示，LFUSMB 30 s組ADR 對MCF/ADR細胞的IC50低于未超聲處理組，相對耐藥逆轉倍數(shù)約為8.20倍，進一步分析發(fā)現(xiàn)，LFUSMB可促進ADR作用下MCF-7/ADR細胞的凋亡，表明LFUSMB可逆轉乳腺癌MCF/ADR 細胞對ADR 的耐藥性，其機制有待探索。

PI3K/Akt 信號的活化有利于抑制腫瘤細胞凋亡，維持腫瘤細胞增殖，在人類乳腺癌等腫瘤的發(fā)生及多藥耐藥中具有重要作用［14］。研究顯示，通過抑制PI3K/AKT信號通路，核糖體S6蛋白激酶4可以抑制MCF-7/多柔比星（DOX）細胞侵襲和腫瘤生長，促進細胞凋亡，減弱MCF-7/DOX 細胞的DOX 耐藥性［15］。Qiu 等［16］發(fā)現(xiàn)，低頻超聲可通過抑制 PI3K/AKT/NF-κB信號通路，下調ABC家族蛋白的表達水平，抑制細胞活力和增殖，逆轉胰腺癌的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，MCF-7/ADR細胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT 在 ADR 聯(lián)合 LFUSMB 作用下顯著降低，表明LFUSMB 可抑制PI3K/AKT 信號的活化。MRP1、MRP2、P-gp及BCRP/ABCG2均屬于ABC家族蛋白，作為能量依賴性外排泵，可促進細胞對有毒物質的外排作用，從而降低其在細胞內的蓄積，在避免外來毒性物質損傷機體的同時，可能導致細胞對化療藥物產生耐藥性［17-18］。研究顯示，PI3K/AKT 通路與乳腺癌耐藥性有關［19］。另外，抑制PI3K 活化可下調P-gp、BCRP/ABCG2 等 ABC 家族蛋白表達，提高耐藥腫瘤細胞的藥物敏感性［20］。本研究觀察到，LFUSMB 作用后可顯著抑制MCF-7/ADR 細胞中MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白 表 達 ，與LFUSMB 對PI3K/AKT 通路的作用趨勢一致，由此推測，LFUSMB 作用于 MCF-7/ADR 細胞，可抑制 PI3K/AKT 通路，下調 MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2多種耐藥蛋白表達，從而減少MCF-7/ADR 細胞對ADR 的外排，增加ADR 在細胞內積累，誘導細胞凋亡，逆轉乳腺癌MCF/ADR 細胞的耐藥性。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT 通路激活劑可拮抗LFUSMB對 MCF-7/ADR 細胞凋亡及 MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白表達的影響，進一步表明LFUSMB 可調控PI3K/AKT 通路活化，逆轉乳腺癌MCF-7/ADR細胞耐藥性。

綜上所述，LFUSMB 可逆轉乳腺癌MCF/ADR 細胞對ADR 的耐藥性，與抑制PI3K/AKT 通路、下調MRP1 等ABC 家族蛋白表達、增加ADR 在細胞內積累及誘導細胞凋亡有關。但是，PI3K/AKT通路下游仍有多種蛋白級聯(lián)傳遞，且多藥耐藥蛋白表達可受到多種通路調控。本研究僅揭示了PI3K/AKT 通路在LFUSMB 逆轉腫瘤耐藥性中的作用，后續(xù)將對其他通路及PI3K/AKT通路下游靶點進行分析，進一步揭示LFUSMB 逆轉腫瘤耐藥性的機制，為LFUSMB應用于腫瘤治療提供參考。