徐 駿，曹 恩，矢慶明，王 嘉，尹碧洋，況曉東

(南昌大學(xué)a.病理教研室； b.第二附屬醫(yī)院骨科； c.瑪麗女王學(xué)院2018級，南昌 330006)

所有真核生物的核糖體RNA(rRNA)在細(xì)胞核中合成，核糖體是細(xì)胞合成所需的蛋白質(zhì)合成的分子機(jī)器。核仁磷酸蛋白(NPM)是一種重要的核蛋白，與細(xì)胞周期密切相關(guān)。NPM在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡中起著重要作用，主要涉及2個(gè)方面：其一，NPM直接影響細(xì)胞周期，參與核糖體合成，中心體復(fù)制和周期控制蛋白的調(diào)節(jié)[1]，其二，NPM還可以調(diào)節(jié)促腫瘤或抑制作用，抑制蛋白的活性并影響其靶基因的下游轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡[2]。本文就NPM異常表達(dá)對腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞周期特征

細(xì)胞的生長和增殖在整個(gè)生命周期中都受到仔細(xì)和嚴(yán)格的調(diào)控，G1/S測試點(diǎn)是最重要的調(diào)控開關(guān)之一。在這一轉(zhuǎn)折點(diǎn)上，細(xì)胞對不同的胞內(nèi)和胞外刺激因素做出各種不同反應(yīng)，即細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化或生長停止、G1期停止等。同時(shí)在此期間，中心體結(jié)合的NPM被cyclin E和CDK2異二聚體復(fù)合物磷酸化，啟動(dòng)中心體復(fù)制[3]。因此，在G1/S這個(gè)測試點(diǎn)，任何可能的損傷或者突變，如抑癌基因失活或癌基因激活，都可能導(dǎo)致異常的細(xì)胞增殖或轉(zhuǎn)化。有研究[4]表明，NPM蛋白敲除會(huì)導(dǎo)致中心粒數(shù)制NPM蛋白磷酸化會(huì)導(dǎo)致中心體復(fù)制失敗。

2 NPM的結(jié)構(gòu)與功能

NPM，也稱為B23或N038，位于5q35，包括3個(gè)亞型，即NPM1、NPM2和NPM3，目前學(xué)術(shù)界對NPM1了解最為詳細(xì)。NPM蛋白的N端富含非極性氨基酸，具有組蛋白伴侶的功能，中間部分是核糖核酸酶活性區(qū)，負(fù)責(zé)組蛋白和核糖體的組裝，可以依賴乙?；黾咏M裝水平。C端是含有核定位信號的核酸結(jié)合域。野生型NPM可通過核孔在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，參與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的運(yùn)輸。穿梭過程受核輸出信號、核定位信號和核仁定位信號序列控制。NPM可以被一些激酶磷酸化，如酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)。NPM和CKⅡ共同位于細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和凋亡[5]。

3 NPM異常表達(dá)對腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響

NPM異常表達(dá)，包括基因突變、過表達(dá)和沉默表達(dá)3種形式，對腫瘤細(xì)胞的增殖或凋亡產(chǎn)生影響。

3.1 NPM突變對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

有研究[6-16]表明，NPM突變對許多惡性腫瘤，特別是對血液腫瘤發(fā)生發(fā)展尤為密切。

3.1.1 NPM突變與急性髓細(xì)胞白血病(AML)

FALINI等[6]首次發(fā)現(xiàn)成人AML中NPM1基因突變的檢出率為35.2%，正常核型AML中為61.7%，這揭示了NPM基因與血液腫瘤的相關(guān)性。近年來，AML中NPM1的異常表達(dá)引起了人們的關(guān)注和研究。AML中的NPM1突變可發(fā)生在FAB-AML的幾乎所有亞型中，最常見的突變是M4(發(fā)病率77%)、M5a(發(fā)病率71%)和M5b(發(fā)病率90%)[7]。目前，最常見的突變類型B和D是在相同的基因位點(diǎn)插入CATG和CCTG，而突變類型A是在野生型NPM1核苷酸序列的956-959位插入1個(gè)TCTG[8]。NPMI基因第12外顯子突變在原發(fā)性AML尤其是正常核型AML患者中發(fā)生率較高，具有特殊的臨床特征和較好的預(yù)后[9]。

3.1.2 NPM突變導(dǎo)致NPM突變基因胞漿異常定位

基因突變致NPM胞漿移位的白血病細(xì)胞稱之為NPMc+細(xì)胞。NAKAGAWA等[10]提出，C端色氨酸只在野生型NPM的核仁定位中起主要作用，但是在野生型NPM的細(xì)胞質(zhì)移位中并無顯著性作用。當(dāng)NPM1發(fā)生突變后，11-氨基酸殘基取代NPM1蛋白C端7-氨基酸，NPM1蛋白末端5個(gè)氨基酸均為VSLRK，導(dǎo)致NPM1蛋白C端288和290位點(diǎn)至少1個(gè)色氨酸發(fā)生突變，削弱了核定位信號，最終導(dǎo)致NPM1在細(xì)胞質(zhì)中的異常定位。此外有研究[11]還發(fā)現(xiàn)，突變NPM1的C端產(chǎn)生額外的富含亮氨酸的核輸出信號序列，這增強(qiáng)了依賴于CRM1的核輸出信號。細(xì)胞核定位信號減弱，輸出信號增強(qiáng)，最終導(dǎo)致NPM1蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的異常定位。

FALINI等[12]通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)突變NPM移位胞漿是通過CRM1依賴途徑，此外通過NES序列敲除實(shí)驗(yàn)證明突變NPM只有在同時(shí)具有2種NES序列的情況下才能實(shí)現(xiàn)其胞漿的聚集。NPMc+的異常表達(dá)是多種因素共同作用的結(jié)果。

3.1.3 NPM突變(NPMc+)導(dǎo)致血液腫瘤增殖的可能機(jī)制

白血病細(xì)胞的惡性增殖可以通過p53依賴或p53非依賴途徑來促進(jìn)。一方面，依賴P53途徑，通過影響p53的穩(wěn)定性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖。P53是一種腫瘤抑制基因，由于其突變常導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。受損DNA和癌基因的表達(dá)被激活，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)開始，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯或凋亡。正常情況下，p53處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，p53蛋白的穩(wěn)定性受HDM2(人雙微體基因2)調(diào)節(jié)，HDM2是泛素E3連接酶，下調(diào)P53活性。它也由核仁素的抑癌基因蛋白富精氦酸因子(ARF)調(diào)節(jié)，該因子與HDM2相反。NPM從核仁中分離出ARF。隨著基因毒性刺激的激活，ARF轉(zhuǎn)移到核質(zhì)，通過下調(diào)HDM2穩(wěn)定p53，并激活p53依賴性細(xì)胞周期停滯或凋亡。但是NPM突變(NPMc+)卻維持與ARF聯(lián)接能力，在胞質(zhì)分離。移位到胞質(zhì)的ARF導(dǎo)致自身部分降解，p53失去穩(wěn)定性，腫瘤抑制能力減弱，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增殖[13]。另一方面，ARF自身就有抑制核糖體合成、阻止細(xì)胞周期的功能，因此它的失活也將導(dǎo)致P53非依賴途徑失活,刺激核糖體合成和促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程,使細(xì)胞過度增殖[14]。因此，NPM突變可導(dǎo)致抑癌基因ARF和P53的失活，加上致癌基因的刺激，多因素作用促使細(xì)胞發(fā)生惡性增殖。此外胞質(zhì)中的NPM1突變蛋白可降低抑癌蛋白生長素應(yīng)答因子的活性、增強(qiáng)原癌蛋白c-Myc的穩(wěn)定性，從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖和抗凋亡作用[15-16]。

3.2 NPM過表達(dá)對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

3.2.1 實(shí)體腫瘤中NPM基因往往過表達(dá)

細(xì)胞以分裂的形式進(jìn)行增殖，是生物體生長、發(fā)育、繁殖、遺傳的基礎(chǔ)。NPM蛋白在腫瘤及增殖期細(xì)胞中的含量約是靜止期細(xì)胞的20倍。此外NPM1在多種腫瘤細(xì)胞中(如胃[17]、結(jié)腸[18]、卵巢和前列腺腫瘤[1])過表達(dá)，可直接參與腫瘤的發(fā)生且NPM1的表達(dá)水平與腫瘤發(fā)展階段成正相關(guān)，但目前在實(shí)體腫瘤中還沒有觀察到有NPM序列的突變[19]。鄢超等[20]發(fā)現(xiàn)NPM1蛋白的陽性表達(dá)率在結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后往往比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者要差,這些結(jié)果提示NPM1蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。雌激素是子宮內(nèi)膜癌的危險(xiǎn)因素，它通過抑制NPM蛋白的泛素化而穩(wěn)定NPM，并使其表達(dá)水平升高，提示NPM與子宮內(nèi)膜癌存在相關(guān)性[21]。PIANTA等[22]通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)NPM在甲狀腺腺癌和良性濾泡腺瘤均有表達(dá)，且在甲狀腺腺癌中顯著過表達(dá)，提示NPM可作為甲狀腺癌的早期事件。體外研究[23]表明，NPM基因轉(zhuǎn)染正常成纖維細(xì)胞NIH3T3，發(fā)現(xiàn)過量NPM能夠促進(jìn)正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)高表達(dá)NPM的NIH3T3細(xì)胞可使裸鼠致瘤。

3.2.2 NPM過表達(dá)調(diào)控細(xì)胞增殖抑制凋亡的可能機(jī)制

腫瘤細(xì)胞和生長細(xì)胞中NPM含量顯著高于靜止細(xì)胞，而凋亡細(xì)胞中的表達(dá)則下調(diào)[24]。雖然還沒有直接證據(jù)證明NPM的過表達(dá)參與了細(xì)胞周期的控制，但NPM作為一種抗凋亡蛋白間接參與了相關(guān)的機(jī)制[25]。抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制如下:1)在NIH3T3成纖維細(xì)胞中，NPM過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而抵抗紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并通過上調(diào)PCNA和增加DNA修復(fù)來維持增殖[26]；2)在缺氧細(xì)胞中，NPM可以抑制P53第15位絲氨酸的磷酸化，從而抑制凋亡的發(fā)生[27]；3)NPM可以控制ARF的定位并與Mdm2競爭結(jié)合ARF，而NPM通過定位核仁和破壞ARF-Mdm2結(jié)合來抑制P53活性[28]；4)GURUMURTHY等[29]認(rèn)為NPM1蛋白是一種HEXIM1結(jié)合蛋白(HEXIM1是RNA聚合酶Ⅱ的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子P-TEFb的抑制蛋白)，對HEXIM1起負(fù)調(diào)節(jié)作用。因此，從這些機(jī)制研究中可見，NPM1蛋白的過表達(dá)可使RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄激活，從而影響細(xì)胞增殖。

3.3 NPM基因沉默性表達(dá)對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

NPM基因沉默常常影響細(xì)胞周期，其主要表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

3.3.1 NPM基因的沉默性表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡

余秀琴等[30]的研究表明，siRNA沉默NPM基因表達(dá)可顯著降低皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的增殖活性，并引起細(xì)胞周期停滯，表明細(xì)胞生長受到顯著抑制。LOBELLO等[3]構(gòu)建了NPMl-RNAi抗HL-60細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞系(HL-60/A DR)的細(xì)胞模型，轉(zhuǎn)染后能有效抑制HL-60細(xì)胞和HL-60/ADR中NPM蛋白的表達(dá)。石靜嫻[28]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞沉默NPM后，通過MMT檢測其增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞間的粘附能力，降低了遷移能力。這些結(jié)果都表明NPM的沉默表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。

3.3.2 NPM沉默性表達(dá)導(dǎo)致凋亡的可能機(jī)制

細(xì)胞周期的G2/M期阻滯發(fā)生在NPM沉默后[28]。AVITABILE等[31]指出NPM沉默表達(dá)抑制前RNA合成的產(chǎn)生，引起P53靶基因P21和MDM2的表達(dá)，提示NPM在調(diào)節(jié)rRNA產(chǎn)生和控制P53通路中起重要作用，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡。NPM還下調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)并抑制細(xì)胞增殖[28]。Caspase-3是凋亡早期激活的關(guān)鍵蛋白酶?；钚缘腃aspase-3在腫瘤組織中低表達(dá)，加速增殖，抑制凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有學(xué)者研究[28]表明，在人成骨肉瘤細(xì)胞MG63中，NPM沉默后，活化的Caspase-3表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，表明Caspase家族和Bcl-2家族參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控。此外，石松林等[32]通過姜黃素誘導(dǎo)食管癌EC9706細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)姜黃素處理后，NPM穿梭于細(xì)胞質(zhì)中，激活下游促凋亡蛋白，起到加速凋亡過程的作用；NPM可抑制細(xì)胞核內(nèi)相應(yīng)促凋亡蛋白如p53的活性，維持細(xì)胞的存活。

4 小結(jié)

NPM在調(diào)控細(xì)胞周期中起重要作用，NPM突變影響腫瘤細(xì)胞的耐藥性，NPM高表達(dá)往往使腫瘤細(xì)胞抑制功能減弱，而出現(xiàn)異常增殖的現(xiàn)象，提示了在早期發(fā)現(xiàn)、確診、預(yù)后方面檢測NPM蛋白表達(dá)的有效性?？刂芅PM的下調(diào)或NPM基因敲除均能引發(fā)癌細(xì)胞或損傷細(xì)胞凋亡。此外，在組織損傷引發(fā)的核仁應(yīng)激反應(yīng)中，NPM重定位并且也能夠引發(fā)細(xì)胞凋亡。在NPM異常表達(dá)對細(xì)胞增殖凋亡的調(diào)控機(jī)制中，P53通路有不可忽略的作用，這為探討通過NPM控制癌細(xì)胞增殖的過程提供了思路。