姚燕麗，吳靜標(biāo)，潘曉芳，韓芝斌，柯杰馳

廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 （廣東中山 528437）

根據(jù)2019年中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)和國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心聯(lián)合制定的《液體活檢在臨床腫瘤診療應(yīng)用和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)踐中的專(zhuān)家共識(shí)》[1]，檢測(cè)已知、單個(gè)靶向治療敏感或耐藥型突變時(shí)，建議使用突變擴(kuò)增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）憑借原理簡(jiǎn)單、操作性強(qiáng)、價(jià)格較低、靈敏度高、特異度好、及時(shí)方便的優(yōu)勢(shì)成為現(xiàn)階段伴隨診斷的主流技術(shù)，在基礎(chǔ)研究以及醫(yī)學(xué)診斷、法醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)等各大領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛。PCR作為臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，還被廣泛應(yīng)用于血站核酸檢測(cè)、疾控核酸檢測(cè)、臨床核酸檢測(cè)等領(lǐng)域，其中，在傳染病診斷和血篩檢測(cè)中能夠縮短診斷的“窗口期”，并且可以定量對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)，相比于傳統(tǒng)的免疫診斷方式，其具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，且基于PCR 的分子診斷是醫(yī)院對(duì)傳染性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是目前應(yīng)用最成熟、分子診斷臨床應(yīng)用最廣泛的技術(shù)平臺(tái)，尤其是在傳染性疾病（病毒性肝炎、性病和其他病菌/病毒類(lèi)等）和腫瘤伴隨診斷領(lǐng)域[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，截至2020年11月11日，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）共批準(zhǔn)了846個(gè)PCR 類(lèi)產(chǎn)品，其中qPCR 產(chǎn)品占比高達(dá)86.54%。在伴隨診斷領(lǐng)域，NMPA 批準(zhǔn)的伴隨診斷產(chǎn)品中有60%都是基于qPCR，而在美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的46個(gè)伴隨診斷產(chǎn)品中，基于qPCR 的產(chǎn)品占比也高達(dá) 32.61%（15個(gè)）。

產(chǎn)品委托檢驗(yàn)是體外診斷試劑盒上市前產(chǎn)品性能驗(yàn)證重要且不可或缺的一個(gè)環(huán)節(jié)，是產(chǎn)品第一次走出企業(yè)、真正面臨第三方的質(zhì)量考驗(yàn)。產(chǎn)品檢驗(yàn)過(guò)程中總是會(huì)出現(xiàn)一些共性問(wèn)題，作為第三方注冊(cè)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)，本研究從試劑盒產(chǎn)品性能評(píng)估的企業(yè)參考品的設(shè)計(jì)過(guò)程質(zhì)量控制和病毒核酸檢測(cè)試劑制樣過(guò)程、擴(kuò)增條件的優(yōu)化過(guò)程質(zhì)量控制這兩方面的共性問(wèn)題進(jìn)行總結(jié)討論，闡述企業(yè)在試劑盒研制中可能要注意的質(zhì)量控制點(diǎn)。

1 企業(yè)參考品設(shè)計(jì)過(guò)程中的質(zhì)量控制

1.1 企業(yè)參考品的原料

企業(yè)參考品的原料應(yīng)盡可能與待檢樣本基質(zhì)一致并盡量使用臨床真實(shí)滅活樣本，但考慮到多數(shù)病毒的生物傳染性，采用臨床樣本時(shí)應(yīng)充分有效滅活以防止其成為新的傳染源[3-5]。在企業(yè)的實(shí)際研發(fā)中，對(duì)到底采用合成質(zhì)粒還是病毒樣顆粒作為企業(yè)參考品的原料一直有爭(zhēng)議。在使用企業(yè)參考品檢測(cè)試劑盒性能時(shí)，如果使用合成質(zhì)粒將無(wú)法監(jiān)控核酸提取和逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，使產(chǎn)品可能處于失控狀態(tài)，而使用病毒樣顆粒則可以模擬病毒的全過(guò)程，進(jìn)行有效的產(chǎn)品質(zhì)量控制[6]。

此外，企業(yè)參考品的原料應(yīng)該經(jīng)過(guò)定值并有相應(yīng)的定值溯源過(guò)程[7]。目前，采用人工合成基因大多使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)并計(jì)算分子數(shù)的方法，此方法會(huì)存在極大的誤差，直接影響到檢測(cè)限的確定，從而導(dǎo)致產(chǎn)品性能評(píng)估誤差，影響臨床使用。故在進(jìn)行定值時(shí)應(yīng)該選擇更可靠的方法，如將目標(biāo)核酸與已有國(guó)際/國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的核酸合成為一個(gè)基因組，并用國(guó)際/國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行量值傳遞來(lái)實(shí)現(xiàn)，從而更有效保證產(chǎn)品質(zhì)量。

1.2 企業(yè)參考品

通過(guò)對(duì)企業(yè)參考品中陽(yáng)性參考品、陰性參考品、精密度參考品、檢測(cè)限參考品的合理設(shè)置可以對(duì)檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品的性能指標(biāo)進(jìn)行有效評(píng)估，同時(shí)也是企業(yè)出廠(chǎng)檢驗(yàn)和質(zhì)量控制的主要手段。

1.2.1 陽(yáng)性參考品

陽(yáng)性參考品反映產(chǎn)品檢測(cè)不同濃度的陽(yáng)性樣本的能力，即產(chǎn)品準(zhǔn)確性，一般由高、中、低不同濃度樣本組成[4-5]。在病毒核酸檢測(cè)試劑中，陽(yáng)性參考品一般可以將臨界值的樣本設(shè)置為弱陽(yáng)性參考品，將接近檢測(cè)上限或醫(yī)學(xué)上限的濃度設(shè)置為強(qiáng)陽(yáng)性參考品，在弱陽(yáng)性參考品和強(qiáng)陽(yáng)性參考品之間選擇設(shè)置中陽(yáng)性參考品[8]。

1.2.2 陰性參考品

陰性參考品主要考察產(chǎn)品的特異性，應(yīng)盡可能包括干擾樣本和健康人樣本[8]。干擾樣本分為內(nèi)源性和外源性，應(yīng)是與待測(cè)物可能發(fā)生干擾的物質(zhì)、病原體或與取樣過(guò)程中相關(guān)的微生物、相似癥狀的病原體、相關(guān)治療藥物的不同濃度的樣本。部分的體外診斷企業(yè)采用了合成質(zhì)粒而不是滅活病毒作為陰性參考品，這種方法對(duì)于特異性的驗(yàn)證是不利的，因?yàn)楹铣傻馁|(zhì)粒只是病毒的基因片段而不是全序列基因組，并不能全面評(píng)估試劑盒的特異性。

1.2.3 精密度參考品

精密度參考品反映了產(chǎn)品的重復(fù)性，一般包括不同濃度的弱陽(yáng)和中陽(yáng)性樣本。在檢測(cè)次數(shù)上一般為檢測(cè)10次，通過(guò)計(jì)算10次檢測(cè)的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）確定試劑盒的精密度，一般產(chǎn)品的精密度≤10%[9-10]。

1.2.4 檢測(cè)限參考品

檢測(cè)限參考品是評(píng)價(jià)產(chǎn)品的一個(gè)重要指標(biāo)，體現(xiàn)產(chǎn)品檢測(cè)靈敏度。確定檢測(cè)限需要進(jìn)行大量的樣本測(cè)試和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，而檢測(cè)限參考品則只是對(duì)已確定的檢測(cè)限進(jìn)行驗(yàn)證。在企業(yè)參考品中至少應(yīng)該設(shè)置3個(gè)不同梯度的檢測(cè)限參考品，每個(gè)檢測(cè)重復(fù)3次，直至不能全部檢出為止[9-10]。

2 產(chǎn)品設(shè)計(jì)過(guò)程中的質(zhì)量控制

試劑盒大部分是由核酸提取試劑、擴(kuò)增試劑、質(zhì)控品組成，各個(gè)成分的開(kāi)發(fā)環(huán)節(jié)與質(zhì)量控制密切相關(guān)，而對(duì)制樣過(guò)程和擴(kuò)增條件的優(yōu)化直接影響試劑盒質(zhì)量[3]。

2.1 制樣過(guò)程

2.1.1 核酸提取試劑

核酸提取試劑一般包括蛋白殼的裂解、洗滌、洗脫等步驟。部分病毒屬于單鏈核糖核酸（single-stranded ribonucleic acid，ssRNA）病毒，容易被提取過(guò)程中的RNA酶降解[11]，需要加入RNA 酶抑制劑并對(duì)提取的過(guò)程進(jìn)行充分優(yōu)化，同時(shí)在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)指定配套的提取試劑，以保證擴(kuò)增樣本質(zhì)量。在應(yīng)用過(guò)程中，大部分企業(yè)只提供擴(kuò)增試劑和質(zhì)控品，對(duì)于提取試劑的適配性沒(méi)有充分研究，同時(shí)因?yàn)椴《镜幕蚪M比較短[11]，若不對(duì)提取過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制監(jiān)控，如再遇到內(nèi)標(biāo)設(shè)置不當(dāng)時(shí)，則難以保證核酸提取的純度。因此，應(yīng)對(duì)配合使用的核酸提取試劑/方法的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗(yàn)證。

2.1.2 質(zhì)控品

質(zhì)控品需要參與提取，是擴(kuò)增質(zhì)量控制的有效手段之一。質(zhì)控品一般由含檢測(cè)目標(biāo)的陽(yáng)性質(zhì)控和不含檢測(cè)目標(biāo)的陰性質(zhì)控組成。質(zhì)控品首先推薦充分滅活的臨床樣本，其次為病毒樣顆粒，并保證質(zhì)控品與樣本檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。質(zhì)控品的濃度選擇是檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)品特異性、檢測(cè)限、準(zhǔn)確性的集中體現(xiàn)，質(zhì)控品的濃度過(guò)高不僅可能產(chǎn)生額外的污染，還無(wú)法評(píng)估檢測(cè)能力，而質(zhì)控品的濃度過(guò)低則可能導(dǎo)致檢測(cè)失敗，從而導(dǎo)致更多的復(fù)測(cè)，一般高于試劑的檢測(cè)限濃度5倍即可，具體還需參考產(chǎn)品的重復(fù)性參考品進(jìn)行設(shè)置[11]。

2.2 擴(kuò)增條件的優(yōu)化

擴(kuò)增試劑質(zhì)量的高低是檢測(cè)成功與否的關(guān)鍵。擴(kuò)增試劑主要由緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶（檢測(cè)RNA 病毒時(shí)）、聚合酶、引物探針組成，同是應(yīng)盡可能加入防污染的酶系，有效防止PCR 產(chǎn)物污染。退火、變性的溫度和時(shí)間、鎂離子濃度（或錳離子）、核酸模板純度、dNTP 濃度、引物序列和長(zhǎng)度的設(shè)計(jì)都是擴(kuò)增條件優(yōu)化需要考慮的因素[12]。

另外，對(duì)于試劑盒內(nèi)標(biāo)的選擇也是影響擴(kuò)增效果的關(guān)鍵，完善的內(nèi)標(biāo)可以監(jiān)控臨床樣本從采樣、提取、擴(kuò)增整個(gè)完整流程，防止因樣本量少、操作不當(dāng)、試劑失效等因素產(chǎn)生的假陰性，有效提高對(duì)應(yīng)病毒疾病的診斷準(zhǔn)確性。一般選擇內(nèi)源性的內(nèi)標(biāo)可以監(jiān)控從采樣到擴(kuò)增的全過(guò)程，外源性的內(nèi)標(biāo)則最多只能監(jiān)控從提取到擴(kuò)增的過(guò)程。目前，市場(chǎng)上的部分企業(yè)沒(méi)有設(shè)置內(nèi)源性或外源性?xún)?nèi)標(biāo)（如噬菌體），大大增加了假陰性結(jié)果和復(fù)測(cè)的工作量[13]；即使部分企業(yè)設(shè)置了內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)（如看家基因GAPDH 等），但是為了產(chǎn)品出廠(chǎng)檢驗(yàn)速度卻降低了標(biāo)準(zhǔn)，沒(méi)有對(duì)整個(gè)產(chǎn)品進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。試劑盒同時(shí)設(shè)置內(nèi)源性的內(nèi)標(biāo)和外源性的內(nèi)標(biāo)可以多效監(jiān)控試劑盒的整個(gè)檢測(cè)過(guò)程。

3 小結(jié)

企業(yè)參考品的設(shè)計(jì)定值和核酸檢測(cè)試劑制樣過(guò)程、擴(kuò)增條件的優(yōu)化過(guò)程構(gòu)成了病毒核酸試劑盒的配方開(kāi)發(fā)全過(guò)程。配方研發(fā)人員首先是產(chǎn)品的設(shè)計(jì)師，而不只是性能的調(diào)試員。配方開(kāi)發(fā)方案的設(shè)計(jì)，需要與后續(xù)產(chǎn)品轉(zhuǎn)產(chǎn)結(jié)合起來(lái)。首先，企業(yè)所開(kāi)發(fā)試劑的生產(chǎn)條件是可實(shí)現(xiàn)的；其次，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的配方在生產(chǎn)過(guò)程中可能產(chǎn)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)是可規(guī)避的，即必須結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)的各種問(wèn)題驗(yàn)證試劑的穩(wěn)定性；最后，生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)時(shí)應(yīng)充分評(píng)估和驗(yàn)證產(chǎn)品的主要原材料，特別是對(duì)引物和探針的選擇，同時(shí)考慮臨床樣本的復(fù)雜性和多樣性，進(jìn)行必要的臨床陽(yáng)性樣本的驗(yàn)證，以此來(lái)評(píng)估試劑盒產(chǎn)品的有效性。只有設(shè)計(jì)的精確，才能確保配方開(kāi)發(fā)階段的質(zhì)量控制無(wú)誤，這需要研發(fā)人員具備較強(qiáng)的產(chǎn)品意識(shí)。

試劑盒開(kāi)發(fā)質(zhì)量控制應(yīng)始于配方開(kāi)發(fā)之時(shí)，貫穿于從產(chǎn)品立項(xiàng)到出廠(chǎng)整個(gè)過(guò)程中。若配方開(kāi)發(fā)階段的質(zhì)量控制是一個(gè)靜態(tài)的過(guò)程，那么產(chǎn)品設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)換階段則是動(dòng)態(tài)的控制過(guò)程。而產(chǎn)品的設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)換階段又可以分為兩部分，即工藝設(shè)計(jì)驗(yàn)證和工藝轉(zhuǎn)換。工藝設(shè)計(jì)驗(yàn)證是與配方階段的銜接，是產(chǎn)品可行性的驗(yàn)證，如極端生產(chǎn)環(huán)境的驗(yàn)證和風(fēng)險(xiǎn)的調(diào)配控制，甚至對(duì)配方參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。工藝轉(zhuǎn)換更側(cè)重后期量產(chǎn)，要做好放大生產(chǎn)方法的建立、產(chǎn)品批間差控制與生產(chǎn)過(guò)程的匹配，放大方法的建立對(duì)試劑盒而言最重要的是三大傳遞的放大，即動(dòng)量傳遞、質(zhì)量傳遞和熱量傳遞的放大；產(chǎn)品批間差控制包括小試批間差和放大生產(chǎn)后批間差控制，這都對(duì)設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)換人員綜合素質(zhì)要求較高，要求其對(duì)任何可能導(dǎo)致批間差的物理或化學(xué)因素進(jìn)行排查并解決。

綜上所述，試劑盒產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的質(zhì)量控制體現(xiàn)在每一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的設(shè)計(jì)理念，體現(xiàn)在對(duì)開(kāi)發(fā)細(xì)節(jié)的控制，同樣體現(xiàn)在各個(gè)合作部門(mén)之間的協(xié)作，要求研發(fā)人員具備一定的產(chǎn)品意識(shí)，生產(chǎn)人員需要有一定的研發(fā)思維，設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)換人員則需要起到樞紐作用，保證各個(gè)環(huán)節(jié)連貫不脫節(jié)，才能實(shí)現(xiàn)真正的質(zhì)量控制。